实验一 蛋白质的两性反应及等电点的测定[2]
蛋白质的两性反应实验报告
一、实验目的1. 了解蛋白质的两性反应特性。
2. 掌握蛋白质在酸碱环境中的电荷变化及其对溶解度的影响。
3. 学习通过实验观察蛋白质在不同pH值条件下的沉淀现象，并确定其等电点。
二、实验原理蛋白质是由氨基酸通过肽键连接而成的高分子化合物，分子中包含有氨基（-NH2）和羧基（-COOH）等基团。
这些基团在不同pH值条件下可以解离，从而使得蛋白质分子带正电荷或负电荷。
蛋白质的这种性质称为两性反应。
当蛋白质溶液的pH值等于其等电点时，蛋白质分子所带的正负电荷相等，此时蛋白质的溶解度最低，容易形成沉淀。
三、实验材料与试剂1. 实验材料：鸡蛋清、蒸馏水、pH试纸、滴管、试管等。
2. 试剂：1mol/L HCl、1mol/L NaOH、1mol/L Tris-HCl缓冲液（pH 7.0）、1mol/L硼砂缓冲液（pH 8.5）、1mol/L醋酸缓冲液（pH 4.5）。
四、实验步骤1. 将鸡蛋清用蒸馏水稀释至一定浓度。
2. 分别取适量稀释后的鸡蛋清溶液于试管中。
3. 使用pH试纸测定稀释后的鸡蛋清溶液的pH值。
4. 将1mol/L HCl逐滴加入鸡蛋清溶液中，观察并记录溶液pH值的变化及蛋白质沉淀现象。
5. 重复步骤4，使用1mol/L NaOH、1mol/L Tris-HCl缓冲液、1mol/L硼砂缓冲液和1mol/L醋酸缓冲液分别调节鸡蛋清溶液的pH值，观察并记录溶液pH值的变化及蛋白质沉淀现象。
6. 通过对比不同pH值条件下的蛋白质沉淀现象，确定鸡蛋清溶液的等电点。
五、实验结果与分析1. 在pH 4.5时，鸡蛋清溶液开始出现沉淀，随着pH值的降低，沉淀逐渐增多。
2. 当pH值达到2.5时，沉淀量达到最大，此时蛋白质所带的正负电荷相等，为等电点。
3. 随着pH值的升高，沉淀逐渐减少，当pH值达到8.5时，沉淀基本消失。
六、实验结论1. 蛋白质具有两性反应特性，在不同pH值条件下，其电荷和溶解度发生变化。
2. 通过实验观察蛋白质在不同pH值条件下的沉淀现象，可以确定其等电点。
蛋白质等电点测定实验报告
蛋白质等电点测定实验报告蛋白质等电点测定蛋白质等电点测定及性质实验一、目的：了解等电点的意义及其与蛋白质分子聚沉能力的关系。
初步学会测定蛋白质等电点的基本方法，了解蛋白质的性质。
二、原理：固体颗粒在液体中为什么能够带电？当固体与液体接触时，固体可以从溶液中选择性吸附某种离子，也可以是固体分子本身发生电离作用而使离子进入溶液，以致使固液两相分别带有不同符号的电荷，由于电中性的要求，带电表面附近的液体中必有与固体表面电荷数量相等但符号相反的多余的反离子。
在界面上带电表面和反离子形成了双电层的结构。
在两种不同物质的界面上，正负电荷分别排列成的面层。
对于双电层的具体结构，一百多年来不同学者提出了不同的看法。
最早于1879年Helmholz提出平板型模型；1910年Gouy和1913年Chapman修正了平板型模型，提出了扩散双电层模型；后来Stern又提出了Stern模型。
根据O.斯特恩的观点，一部分反离子由于电性吸引或非电性的特性吸引作用（例如范德华力）而和表面紧密结合，构成吸附层（或称紧密层、斯特恩层）。
其余的离子则扩散地分布在溶液中，构成双电层的扩散层（或称滑移面）。
由于带电表面的吸引作用，在扩散层中反离子的浓度远大于同号离子。
离表面越远，过剩的反离子越少，直至在溶液内部反离子的浓度与同号离子相等。
紧密层：溶液中反离子及溶剂分子受到足够大的静电力，范德华力或特性吸附力，而紧密吸附在固体表面上。
其余反离子则构成扩散层。
滑动面：指固液两相发生相对移动的界面，是凹凸不平的曲面。
滑动面至溶液本体间的电势差称为ζ电势。
固体颗粒带电量的大小及测量方式？ζ电势只有在固液两相发生相对移动时才能呈现出来。
ζ电势的大小由Zeta电位表示，其数值的大小反映了胶粒带电的程度，其数值越高表明胶粒带电越多，扩散层越厚。
一般来说，以pH值为横坐标，Zeta电位为纵坐标作图，Zeta电位为零对应的pH值即为等电点。
对于蛋白质分子来说：蛋白质分子的大小在胶粒范围内，约1～100微米。
蛋白质的两性性质及等电点的测定
蛋白质的两性性质及等电点的测定一 实验目的通过实验了解蛋白质的两性性质和等电点的意义及与蛋白质分子聚沉的关系。
二 实验原理蛋白质是由许多氨基酸组成的，故也是两性电解质。
蛋白质分子中可以解离的基团除末端a －氨基与羧基外，还有肽链上氨基酸残基的侧链基团，如非a －羧基及氨基、胍基、咪唑基等基团，它们都能解离成带电基团。
因此，蛋白质分子与氨基酸一样，在酸性溶液中作碱性解离，成为带正电荷的阳离子，在碱性溶液中作酸性解离，成为带负电荷的阴离子。
HRCOOHNH 3+HRCOONH 3+HRCOO H 2NOH在一定氢离子浓度时，蛋白质分子的酸性解离与碱性解离相等，成为中性颗粒，所带正负电荷相等，净电荷为零，此时溶液的pH 值称为蛋白质的等电点（pI ）。
在等电点时蛋白质分子在电场中既不向阴极移动，也不向阳极移动。
而且分子间因碰撞而引起聚沉的倾向增加。
所以此时蛋白质溶解度最小，若再加入乙醇、丙酮等试剂与蛋白质分子争夺水分子，减低了蛋白质分子外水化膜的厚度，而使浑浊度增加，蛋白质等电点与所含氨基酸种类和数量有关。
若蛋白质含酸性氨基酸多，则等电点多略酸性，如胃蛋白酶的等电点为pH1左右，也有一些蛋白质含碱性氨基酸多，则等电点偏碱性。
如鱼精蛋白等电点为pH12.0-12.4，含酸性和碱性氨基酸残基数目相近的蛋白质，其等电点为中性偏酸约5左右。
本实验采用酪蛋白在不同pH 溶液中形成的混浊度来确定其等电点，即混浊度最大的溶液pH 值为该种蛋白质的等电点。
三 实验设备(1) 试管架 1个(2) 吸管 1mL 2支 ；2mL 1支 ；5mL 1支；10mL 1支 (3) 试管 1.5×15mL 10支 (4) 滴管 2支四 实验试剂（1）1mol/L 醋酸溶液：量取99.5%醋酸(比重1.05)2.875 mL ，加水至50 mL 。
（2）0.1mol/L 醋酸溶液：量取1mol/L 醋酸5 mL ，加水至50 mL 。
实验一蛋白质的两性反应及等电点的测定2
实验一蛋白质的两性反应及等电点的测定2一、实验目的1、学习蛋白质的两性反应；二、实验仪器pH计、电泳槽、电源、紫外分光光度计、比色皿、恒温水浴箱等。
三、实验原理蛋白质分子中含有大量的离子基团，它们可以接受或释放H+离子，从而表现出两性反应的特征。
根据pH的变化，蛋白质分子的电荷状态和溶解性都会发生改变。
不同蛋白质的两性反应的pH区间有所不同，但都表现出了一定的规律性。
一般来说，蛋白质的等电点（pI）即蛋白质分子带的净电荷等于零时的pH值。
在这个pH值附近，蛋白质分子的溶解度最低。
2、等电聚焦电泳等电聚焦电泳（isoelectric focusing, IEF）是基于蛋白质分子的等电点原理，运用电场作用于溶液中的蛋白质使其向等电点运动，到达等电点时就不再运动，电场作用力为零，从而使蛋白质在等电点处聚焦。
该技术可以高效地将蛋白质分子分离开，并且不产生电荷的副反应。
IEF的缺点是需要高纯度的蛋白质样品和复杂的设备。
四、实验操作1、示范两性反应的现象制备两个100mL的肉汤。
其中一个加入适量的氢氧化钠溶液，并记录溶液的pH值。
将两个溶液放在一起，观察两溶液之间的相互作用。
2、测定牛血清白蛋白（BSA）的pI值将0.1g的BSA溶解于100mL的蒸馏水中，并调整pH至2.0。
加入适量的氢氧化钠溶液，逐渐增加溶液的pH值。
每次变化pH值0.5时，用pH计测定一次溶液的pH值，并记录BSA 对应的电泳距离。
将记录的数据制成曲线图。
由BSA的等电点的定义，等电点的pH值应该是曲线的最低点。
3、等电聚焦电泳测定蛋白质的等电点（1）样品的制备制备10mL的蛋白质样品，如卵清蛋白（ovalbumin）、BSA、牛血浆血清白蛋白（BSC）、胰岛素等。
将蛋白质样品以蒸馏水稀释至10μg/μL。
（2）样品的前处理a. 加入10μL的pH 3-10缓冲液、10μL的非离子型洗涤剂和80μL的样品。
b. 活化酶处理：在样品中加入基质，辅助样品中蛋白酶的活化。
蛋白质的两性反应和等电点测定
蛋白质的两性反应和等电点测定一、实验目的1.熟悉蛋白质的沉淀反应、颜色反应和两性反应及其机理。
2.掌握蛋白质等电点的测定方法及其原理。
3.掌握蛋白质电荷的测定方法及其机理。
二、实验原理(一)蛋白质的沉淀反应原理蛋白质的水溶液是一种比较稳定的亲水胶体，这是因为蛋白质颗粒表面带有很多极性基团，如—NH3+，—COO-，—SH，—CONH2等和水有高度亲和性，当蛋白质与水相遇时，就很容易被蛋白质吸住，在蛋白质颗粒外面形成一层水膜(又称水化层)。
水膜的存在使蛋白颗粒相互隔开，颗粒之间不会碰撞而聚成大颗粒。
因此蛋白质在溶液中比较稳定而不会沉淀。
蛋白质能形成较稳定的亲水胶体的另一个原因，是因为蛋白质颗粒在非等电状态时带有相同电荷，使蛋白质颗粒之间相互排斥，保持一定距离，不致相互凝集沉淀。
蛋白质由于带有电荷和水膜，因此在水溶液中形成稳定的胶体。
当某些物理化学因素破坏了蛋白质的水膜或中和了蛋白质的电荷，则蛋白质胶体溶液就不稳定而出现沉淀现象。
蛋白质可因加入下列试剂而产生沉淀：1.加盐类如硫酸铵、硫酸钠、氯化钠等可以破坏蛋白质胶体周围的水膜，同时又中和了蛋白质分子的电荷，因此使蛋白质产生沉淀，这种加盐使蛋白质沉淀析出的现象称盐析。
盐析法是分离制备蛋白质的常用方法，不同蛋白质盐析时所需的盐浓度不同，因此调节盐浓度，可使混合蛋白质溶液中的几种蛋白质分段析出，这种方法叫做分段盐析。
但中性盐并不破坏蛋白质的分子结构和性质，因此，若除去或降低盐的浓度，蛋白质就会重新溶解。
2.加有机溶剂如酒精、丙酮等可使蛋白质产生沉淀，这是由于这些有机溶剂和水有较强的作用，破坏了蛋白质分子周围的水膜，因此发生沉淀作用。
若及时将蛋白质沉淀与丙酮或乙醇分离，蛋白质沉淀则可重新溶解于水中。
3.重金属盐如氯化汞、硝酸银、醋酸铅及三氯化铁等。
这是因为蛋白质在碱性溶液中带负离子，可与这些重金属的正离子作用而生成不易溶解的盐而沉淀。
4.某些酸类如苦味酸、单宁酸、三氯乙酸等能和蛋白质化合成不溶解的蛋白质盐而沉淀。
1．蛋白质的等电点测定.doc
课程：基础生物化学实验学院：班级：学号：姓名：成绩：评阅教师：实验一蛋白质的等电点和含量测定1．蛋白质的等电点测定（pH值沉淀法）一、实验目的1．学习和掌握蛋白质的两性解离性质。
2．掌握pH值法测定蛋白质等电点的一般原理和操作方法。
二、实验原理三、试剂与仪器、耗材1．试剂2．仪器耗材四、实验方法取4支同样规格的试管，按下表顺序分别精确地加入各试剂，加入后立即混匀，加一管，摇匀一管。
静置，观察各管在不同时间的混浊度。
观察时可用+，++，+++，表示浑浊度。
表1试剂管号H2O/mL0.01mol/LHAC/mL0.10mol/LHAC/mL1.00mol/LHAC/mLpH蛋白质溶液/mL观察现象0 min 10 min 20 min1234五、实验结果、计算与分析1.观察各管中清澈度变化，记录结果并解释现象.2.确定酪蛋白的等电点。
六、思考题蛋白质在等电点沉淀的原因是什么？影响该实验结果准确性的因素有哪些？2. 双缩脲法测定蛋白质含量一、实验目的1．学习双缩脲法测定蛋白质浓度的基本原理。
2．学习和掌握双缩脲法测定蛋白质浓度的实验操作方法。
二、实验原理三、试剂与仪器、耗材1．试剂2．仪器耗材四、实验方法1.制标准曲线取试管6支，编号0-5，按下表顺序加入各试剂。
表2试管试剂/mL0 1 2 3 4 5标准牛血清白蛋白0.0 0.4 0.8 1.2 1.6 2.0 蒸馏水 2.0 1.6 1.2 0.8 0.4 0.0 双缩脲试剂 4.0 4.0 4.0 4.0 4.0 4.0 蛋白质含量 mg/mL 0.0 2.0 4.0 6.0 8.0 10.0上述试剂加完后，充分混匀，室温放置30 min。
以0号管为对照管，于540 nm处比色测定吸光值，记下各管吸光度，以每管蛋白质含量为横坐标，对应吸光度为纵坐标，作吸光度-蛋白质含量标准曲线。
2．样品测定五、实验结果、计算与分析1．使用Excel程序绘制标准曲线，计算回归方程。
实验一蛋白质的两性性质和酪蛋白等电点的测定
实验一蛋白质的两性性质和酪蛋白等电点的测定实验一蛋白质的两性性质和酪蛋白等电点的测定一、实验目的与要求1.掌握蛋白质的两性解离性质；2.熟练掌握测定蛋白质等电点的基本方法。
二、实验原理蛋白质是由氨基酸组成的高分子化合物。
虽然大多数的α-氨基和α-羧基成肽键结合，但仍有N末端的氨基和C末端的羧基存在，同时侧链上还有一些可解离基团。
因此，蛋白质和氨基酸一样是两性电解质。
调节蛋白质溶液的pH，可使蛋白质带上正电荷或负电荷；在某一pH时，其分子中所带的正电荷和负电荷相等，此时溶液中蛋白质以兼性离子形式存在。
在外加电场中蛋白质分子既不向正极移动也不向负极移动，此时溶液的pH 称为该蛋白质的等电点，蛋白质的溶解度最小。
不同的蛋白质，因氨基酸的组成不同有不同的等电点。
三、实验材料、试剂与仪器1.材料与试剂NaOH、HCl、乙酸、溴甲酚绿、酪蛋白、精密pH试纸等。
0.5 %酪蛋白溶液：0.5 g酪蛋白，先加入几滴1 mol/L的NaOH使其湿润，用玻璃棒搅拌研磨使成浆糊状，逐滴加入0.01 mol/L的NaOH使其完全溶解后定容到100 mL.酪蛋白—乙酸钠溶液：将0.25 g酪蛋白加5 mL 1 mol/L的NaOH溶解，加20 mL水温热使其完全溶解后，再加入5 mL 1 mol/L的乙酸，混合后转入50 mL的容量瓶内，加水到刻度，混匀备用（pH应为8~8.5）；0.01%的溴甲酚绿溶液：将0.01g溴甲酚绿溶解于100mL含有0.57mL0.1mol/LNaOH的水中。
该指示剂的变色范围是：酸性（pH3.8）为黄色，pH5.4为蓝色；0.02 mol/L的HCl溶液：将0.8 mL浓盐酸用蒸馏水稀释到480 mL即可；0.02 mol/L的NaOH溶液：将0.8 g NaOH溶解于100 mL水中，最终加入到1000 mL；0.1 mol/L的乙酸溶液：将1 mL冰醋酸用水稀释到170 mL；0.01 mol/L的乙酸溶液：将0.1 mL冰醋酸用水稀释到170 mL；1 mol/L的乙酸溶液：1 mL冰醋酸（17 mol/L）加水到17 mL即可。
实验一、蛋白质的等电点测定
三、试剂仪器和试剂
1、仪器设备
试管及试管架 滴管 吸量管 容量瓶
2、试剂
0.5% 酪蛋白溶液 0.01%溴甲基酚绿指示剂 0.10 mol/L 盐酸溶液 0.10 mol/L 氢氧化钠溶液 1.00 mol/L 醋酸溶液 0.10 mol/L 醋酸溶液 0.01 mol/L 醋酸溶液
Ø 要爱护公物，小心使用仪器和实验设备，注意节约用水、电、药品 和器材。
➢ 所有固体废弃物如：废纸、固体废弃物、沉淀物等必须弃于垃圾 桶中。强酸、强碱必须倒入玻璃器皿中，用水稀释后倒入水槽。
➢ 实验室和实验台应保持整洁。公用试剂用毕，立即盖严并还原。 实验完毕，仪器洗净放好。
➢ 在实验过程中必须遵守操作规程，不得随意乱动乱用。如不会使 用，应请教指导教师。凡因乱动乱用违反操作规程而损坏仪器设 备，造成事故者，按有关规定进行赔偿和处理。
二、实验原理
蛋白质是两性电解质。在蛋白质溶液中存在下 列平衡：
蛋白质分子的解离状态和解离程度受溶液的酸 碱度影响。
常用方法：利用溴甲酚绿指示剂的变色来 观察蛋白质的两性性质。
3.8
5.6
当溶液的pH为一定值时，蛋白质极性基团解离的 正负离子数相等，净电荷为0，此溶液的pH值为 该蛋白质的等电点。
微生物、动物的组织、细胞培养物、血液和分泌物 都可能存在细菌 和病毒感染的潜在危害，处理生物材料必需小心谨慎，做完实验必须 用肥皂、洗涤剂或消毒液洗手。
被污染的物品，必须进行高压消毒或烧成灰烬。 被污染的玻璃用具应在清洗和高压消毒前立即浸泡在适当的消毒液中。
5
试剂使用规则
Ø 使用试剂前应该仔细辨认标签，看清名称及浓度，是否为本实验所需。 Ø 取出试剂后，立即将瓶塞盖好，放回原位；未用完的试剂决不可倒回原
蛋白质两性性质及等电点的测定
蛋白质两性性质及等电点的测定蛋白质是生物体中极其重要的有机化合物，是构成生物体的基本组成部分之一。
蛋白质具有很多种类和功能，不同的蛋白质在生物体内发挥着不同的作用。
蛋白质的性质也因其结构而异，其中包括两性性质和等电点。
本文将介绍蛋白质的两性性质及等电点的测定。
一、蛋白质的两性性质蛋白质是由多肽链组成的，其分子中含有氨基酸残基。
这些氨基酸残基中的羧基（-COOH）和氨基（-NH2）可以参与酸碱反应，所以蛋白质具有两性性质，能够在不同的pH值下呈现不同的电离状态。
1. 在低pH值下，蛋白质中的羧基处于质子化状态，成为正电荷，而氨基则不受质子化，保持中性。
因此，在低pH值时，蛋白质呈正电荷状态，称为阳离子。
2. 在高pH值下，蛋白质中的氨基受到氢离子的质子化，成为正电荷，而羧基则不受质子化，保持中性。
因此，在高pH值时，蛋白质呈负电荷状态，称为阴离子。
3. 在等电点附近，蛋白质的质子化和去质子化同时发生，羧基和氨基的质子化程度相等，呈中性状态。
此时，蛋白质没有净电荷，称为等电点。
由于蛋白质的两性性质，可以影响其溶解性、折叠构象和相互作用等特性，对其功能和生物学作用具有重要影响。
二、蛋白质等电点的测定等电点是蛋白质具有中性状态的pH值。
测定蛋白质的等电点可以帮助我们了解其溶解性、电动力学性质和酸碱加工过程中的变化。
常用的测定等电点的方法有以下几种：1. pH梯度电泳法：这是一种常用且广泛应用的测定等电点的方法。
在一个pH梯度上进行电泳，当蛋白质离子迁移速率和电场力相等时，达到等电点。
可以通过在梯度上观察蛋白质带的形成和移动情况来确定等电点。
2. 等电聚焦电泳法：这是一种利用电场作用下蛋白质在凝胶上垂直移动的方法，根据蛋白质在凝胶中的移动速率和电场力相等时的pH值来测定等电点。
3. 等电点电位计法：该方法利用等电点时蛋白质没有净电荷的特性，使用电位计测量蛋白质在不同pH值下的电位变化，找出没有净电荷时的pH值，即为等电点。
蛋白质两性性质及等电点的测定
注意事项
在测定等电点的实验中，要求各种试剂的浓
度和加入量相当准确。
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阳离子两性离子阴离子
pH<pIpH=pIpHpI 电场中：移向阴极不移动移向阳极调节溶液 的 pH 使蛋白质分子的酸性解离与碱性解离相等， 即所带正负电荷相等，净电荷为零，此时溶液的 pH 值称为蛋白质的等电点。在等电点时，蛋白质 溶解度最小，溶液的混浊度最大，配制不同 pH 的缓冲液，观察蛋白质在这些缓冲液中的溶解情
实验一 蛋白质的等电点测定和沉淀反应
4、有机溶剂沉淀蛋白质
取1支试管，加入2mL蛋白质溶液，再加入2mL95%乙 醇。观察沉淀的生成（如果沉淀不明显，加点NaCl， 混匀。
5、乙醇引起的变性与沉淀
取3支试管，编号。依下表顺序加入试剂
1.向各管内加水4ml，在2，3管内各加一滴甲基红
2.第二管中用0.1mol／L醋酸溶液中和。第三管用0.05mol/L碳酸钠溶液 中和，观察各管的颜色变化和沉淀生成
2、重金属离子沉淀蛋白质
重金属离子与蛋白质结合成不溶于水的复合物。 取1支试管，加入蛋白质溶液2mL，再加3%硝酸银溶液 1—2滴，振荡试管，有沉淀产生。放置片刻，倾去上 清液，向沉淀中加入少量的水，沉淀是否溶解？为什 么？
3、某些有机酸沉淀蛋白质
取1支试管，加入蛋白质溶液2mL，再加入1ml5%三氯 乙酸溶液，振荡试管，观察沉淀的生成。放置片刻倾 出清液，向沉淀中加入少量水，观察沉淀是否溶解。
二、原理
蛋白质是两性电解质。在蛋白质溶液中存在下列平衡：
等电点 : 当溶液的pH 达到一定数值时，蛋质颗粒上正负电荷的数目
相等，在电场中，蛋白质既不向阴极移动，也不向阳极移动，此 时溶液的pH值称为此种蛋白质的等电点。
1. 四、操作步骤
（一）酪蛋白等电点的测定 （1）取同样规格的试管4支，加入各试剂，然后混匀。此时 4个管的pH依次为5.9、5.5、4.7、3.5。
（2）各加酪蛋白的醋酸钠溶液1mL， 加一管，摇匀一管。观 察其混浊度。静置10分钟后，再观察其混浊度。最混浊的一 管pH即为酪蛋白的等电点。
（二）蛋白质的沉淀及变性 1、蛋白质的盐析
蛋白质的盐析: 无机盐（硫酸铵、硫酸钠、氯化钠等）的浓溶液能 析出蛋白质。盐的浓度不同，析出的蛋白质也不同。如球蛋白可 在半饱和硫酸铵溶液中析出，而清蛋白则在饱和硫酸铵溶液中才 能析出。 盐溶:由盐析获得的蛋白质沉淀，当降低其盐类浓度时，又能再溶 解，故蛋白质的盐析作用是可逆过程。 于试管中加入蛋白质溶液5mL ，再加等量的饱和硫酸铵溶液，混 匀后静置数分钟则析出球蛋白的沉淀。倒出少量混浊沉淀，加少 量水，观察是否溶解，为什么？将管内容物过滤，向滤液中添加 硫酸铵粉末到不再溶解为止。此时析出沉淀为清蛋白。取出部分 清蛋白，加少量蒸馏水，观察沉淀的再溶解。
实验一、蛋白质的等电点测定和沉淀反应报告
测定及沉淀反应
一、实验目的
1、了解蛋白质的两性解离性质 2、学习测定蛋白质等电点的一种方法
3、加深对蛋白质胶体溶液稳定因素的认识
4、了解沉淀蛋白质的几种方法及其实用意义
5、了解蛋白质变性与沉淀的关系
二、实验原理
蛋白质是两性电解质。在蛋白质溶液中存在下 列平衡：
蛋白质分子的解离状态和解离程度受溶液的酸 碱度影响。
蛋白质溶液：5%卵清蛋白溶液或鸡蛋清的水溶液 （新鲜鸡蛋清:水=1:9） 0.2M 醋酸-醋酸钠缓冲液，pH4.7 3%硝酸银溶液
5%三氯乙酸溶液
95%乙醇 饱和硫酸铵溶液：25℃，100mL水＋76.7g硫酸铵
0.1 M盐酸溶液
0.1 M氢氧化钠溶液 0.05 M碳酸钠溶液 0.1 M醋酸溶液 甲基红溶液：pH变色范围为4.4-6.2，由红变黄
蛋白的沉淀。
离心，取沉淀，加少量水，观察是否溶解。
离心后上清液中添加硫酸铵粉末到不再溶解为
止，此时析出的沉淀为清蛋白。 离心，取出部分清蛋白，加少量蒸馏水，观察 沉淀能否重新溶解。
2. 重金属离子沉淀蛋白质
取1支试管，加入蛋白质溶液2 mL，再加3%
硝酸银溶液1~2滴，振荡试管，有沉淀产生。
可逆的沉淀反应
蛋白质分子的结构尚未发生显著变化，除去引 起沉淀的因素后，蛋白质的沉淀仍能溶解于原
来的溶剂中，并保持其天然性质而不变性。
如：盐析作用、低温下用乙醇（丙酮）短时间
作用于蛋白质。
提纯蛋白质时，常利用此类反应。
问题：提纯蛋白质时常用的沉淀方法有哪些?
蛋白质性质实验
实验六蛋白质的性质（二）蛋白质的等电点测定和沉淀反应一、蛋白质等电点的测定（一）目的1、了解蛋白质的两性解离性质。
2、学习测定蛋白质等电点的一种方法。
（二）原理蛋白质是两性电解质，在溶液中存在下列平衡：蛋白质分子的解离状态和解离程度受溶液的酸碱度影响。
当溶掖的pH达到一定数值时，蛋白质颗粒上正负电荷的数目相等，在电场中，蛋白质既不向阴极移动，也不向阳极移动，此时溶液的PH值称为此蛋白质的等电点(p1)。
不同的蛋白质有其各自的等电点。
在等电点时，蛋白质的理化性质都有变化，可利用此种性质来测定各种蛋白质的等电点。
最常用的方法是利用物质在达到等电点时溶解度最小的性质，测定蛋白质溶液的溶解度呈现最低时的溶液pH值，此时的pH倍即为该蛋白质的等电点。
本实验通过观察酪蛋白在不同pH溶液中的溶解度，来测定酪蛋白的等电点。
用醋酸与醋酸钠配制成各种不同PH值的缓冲液．然后向各缓冲溶液中加入酪蛋白，观察沉淀出现并测定酪蛋白的等电点。
（三）实验器材1、水浴锅。
2、温度计。
3、200mL锥形瓶。
4、100mL容量瓶。
5、移液管。
6、试管。
7、试管架。
8、研钵。
（四）材料与试剂1、0.5％酪蛋白醋酸钠溶液：取0.5g酪蛋白．加少量水在研钵中仔细地研磨，将所得的蛋白质液移入200 mL锥形瓶内，并用少量40～50℃的温水洗涤研钵，将洗涤液也移入锥形瓶内。
加入10 mLlmol/L醋酸钠溶液。
把锥形瓶放入50℃水浴中，并小心地旋转锥形瓶，直到酪蛋白完全溶解为止。
将锥形瓶内的溶液全部移至100 mL容量瓶内，加水至到度，塞紧玻璃塞，混匀。
2、1mo1/L醋酸溶液。
3、0.1mo1/L醋酸溶液。
4、0.01mo1/L醋酸镕液.（五）操作方法2、。
静置20min后，再观察每支试管内溶液的混浊度，以—、＋、＋＋，＋＋＋符号表示沉淀的多少，根据观察结果，指出那一个pH是酪蛋白的等电点。
二、蛋白质的沉淀及变性（一）目的1、加深对蛋白质胶体溶液稳定因素的认识。
蛋白质的两性性质及等电点的测定
蛋白质的两性性质及等电点的测定1 实验目的1.1 了解蛋白质的两性性质及等电点与蛋白质分子聚沉的关系。
1.2 掌握通过聚沉测定蛋白质等电点的方法。
2 实验原理蛋白质是两性电解质。
蛋白质分子中可以解离的基团除N端α―氨基与C端α―羧基外，还有肽链上某些氨基酸残基的侧链基团，如酚基、巯基、胍基、咪唑基等基团，它们都能解离为带电基团。
因此，在蛋白质溶液中存在着下列平衡：阳离子两性离子阴离子pH < pI pH = pI pH > pI电场中：移向阴极不移动移向阳极调节溶液的pH使蛋白质分子的酸性解离与碱性解离相等，即所带正负电荷相等，净电荷为零，此时溶液的pH值称为蛋白质的等电点。
在等电点时，蛋白质溶解度最小，溶液的混浊度最大，配制不同pH的缓冲液，观察蛋白质在这些缓冲液中的溶解情况即可确定蛋白质的等电点。
3 主要仪器与试剂3.1 器材试管架；试管1.5×15cm（×8）；移液管1mL（×4），2mL（×4），10mL（×2）；胶头滴管（×2）。
3.2 试剂1mol/L乙酸：吸取99.5%乙酸（比重1.05）2.875mL，加水至50mL。
0.1mol/L乙酸：吸取1mol/L乙酸5mL，加水至50mL。
0.01mol/L乙酸：吸取0.1mol/L乙酸5mL，加水至50mL。
0.2mol/L NaOH：称取NaOH2.000g，加水至50mL，配成1mol/L NaOH。
然后量取1mol/L NaOH 10mL，加水至50mL, 配成0.2mol/L NaOH。
0.2mol/L HCl：吸取37.2%（比重1.19）HCl 4.17mL，加水至50mL，配成1mol/L HCl。
然后吸取1mol/L HCl 10mL，加水至50mL，配成0.2mol/L HCl。
0.01%溴甲酚绿指示剂：称取溴甲酚绿0.005g，加0.29mL 1mol/L NaOH，然后加水至50mL。
实验蛋白质的等电点测定和沉淀反应
蛋白质分子的解离状态和解离程度受溶液的酸 碱度影响。
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3
当溶液的pH为一定值时，蛋白质极性基团解离 的正负离子数相等，净电荷为0，此溶液的pH值 为该蛋白质的等电点。
不同蛋白质具有各自特定的等电点，与该蛋白 质的组成结构有关。
在等电点时，蛋白质的理化性质都有变化，可 利用性质的变化测定各种蛋白质的等电点。
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（二）蛋白质沉淀实验
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1. 蛋白质的盐析
加5%卵清蛋白溶液5 mL于试管中，再加等量 饱和硫酸铵溶液，混匀后静置数分钟则析出球 蛋白的沉淀。
离心，取沉淀，加少量水，观察是否溶解。 离心后上清液中添加硫酸铵粉末到不再溶解为
止，此时析出的沉淀为清蛋白。 离心，取出部分清蛋白，加少量蒸馏水，观察
实验一、蛋白质等电点 测定及沉淀反应
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1
一、实验目的
1、了解蛋白质的两性解离性质 2、学习测定蛋白质等电点的一种方法 3、加深对蛋白质胶体溶液稳定因素的认识 4、了解沉淀蛋白质的几种方法及其实用意义 5、了解蛋白质变性与沉淀的关系
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2
二、实验原理
蛋白质是两性电解质。在蛋白质溶液中存在下 列平衡：
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5
在水溶液中，蛋白质分子由于表面生成水 化层和双电层而成为稳定的亲水胶体。
在一定的理化因素影响下，蛋白质颗粒可 因失去电荷和脱水而沉淀。
蛋白质的沉淀反应可分为两类。
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➢ 可逆的沉淀反应
蛋白质分子的结构尚未发生显著变化，除去引 起沉淀的因素后，蛋白质的沉淀仍能溶解于原 来的溶剂中，并保持其天然性质而不变性。
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蛋白质的两性反应实验报告
蛋白质的两性反应实验报告一、实验目的1、了解蛋白质的两性解离性质。
2、掌握蛋白质两性反应的实验操作和现象观察。
二、实验原理蛋白质是由氨基酸组成的大分子化合物，其分子中同时含有可解离的酸性基团（如羧基 COOH）和碱性基团（如氨基 NH₂）。
在一定的pH 条件下，蛋白质会发生解离，使其分子带上正电荷或负电荷。
当溶液的 pH 达到某一特定值时，蛋白质所带的正电荷和负电荷数量相等，此时蛋白质的净电荷为零，这个 pH 值称为蛋白质的等电点（pI）。
在等电点以上的 pH 环境中，蛋白质解离成阴离子，带负电荷；在等电点以下的 pH 环境中，蛋白质解离成阳离子，带正电荷。
因此，通过调节溶液的 pH，可以观察到蛋白质的两性反应。
三、实验材料与设备1、实验材料鸡蛋清溶液04%酪蛋白乙酸钠溶液1%醋酸溶液01mol/L 盐酸溶液01mol/L 氢氧化钠溶液001%溴甲酚绿指示剂广泛 pH 试纸2、实验设备试管滴管移液管离心机四、实验步骤1、蛋白质的两性反应取 4 支试管，编号为 1、2、3、4。
向 1 号试管中加入 2mL 鸡蛋清溶液，滴加 2 滴 01mol/L 盐酸溶液，边加边振荡，观察溶液的变化。
向 2 号试管中加入 2mL 鸡蛋清溶液，滴加 2 滴 01mol/L 氢氧化钠溶液，边加边振荡，观察溶液的变化。
向 3 号试管中加入 2mL 04%酪蛋白乙酸钠溶液，滴加 2 滴 1%醋酸溶液，边加边振荡，观察溶液的变化。
向 4 号试管中加入 2mL 04%酪蛋白乙酸钠溶液，滴加 2 滴 01mol/L 氢氧化钠溶液，边加边振荡，观察溶液的变化。
2、蛋白质等电点的测定取 5 支试管，编号为 5、6、7、8、9。
向 5 号试管中加入 4mL 04%酪蛋白乙酸钠溶液。
向 6 号试管中加入 2mL 04%酪蛋白乙酸钠溶液和 2mL 01mol/L 盐酸溶液，摇匀。
向 7 号试管中加入 2mL 04%酪蛋白乙酸钠溶液和 2mL 01mol/L 氢氧化钠溶液，摇匀。
蛋白质的等电点测定与沉淀反应
❖ 加5%卵清蛋白溶液5 ml于试管中，再加等量的饱和硫酸 铵溶液，混匀后静置数分钟则析出球蛋白的沉淀。倒出少 量混浊沉淀，加少量水，观察是否溶解，为什么？将管中 内容物过滤，向滤液中添加硫酸铵粉末到不再溶解为止， 此时析出的沉淀为清蛋白。
－
－
1
2 8.7 －0.3 －1来自3 8.0 －1.0 －
1
4 7.4 －
－ 1.6 1
最浑浊的一管的p可H编辑为ppt 酪蛋白的等电点。 7
六.等电点测定实验结果
几号管最混浊,溶液pH为?由于等电点 时蛋白质溶解度最小,所以酪蛋白的等电点 为?
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Ⅱ．蛋白质的沉淀反应
一、目的： 1．加深对蛋白质胶体溶液稳定因素的认识。 2．了解沉淀蛋白质的几种方法及其实用意义。 3．了解蛋白质变性与沉淀的关系。
❖ 3．某些有机酸沉淀蛋白质 取1支试管，加入蛋 白质溶液2 ml，再加1 ml 5%三氯乙酸溶液，振荡
试管，观察沉淀的生成。放置片刻，倾出上清液， 向沉淀中加入少量水，观察沉淀是否溶解。
❖ 4．有机溶剂沉淀蛋白质 取1支试管，加入2 ml蛋
白质溶液，再加入2 ml 95%乙醇。混匀，观察沉
淀的生成。
❖ 取出部分清蛋白，加少量可蒸编馏辑p水pt ，观察沉淀的再溶解。 12
❖ 2．重金属离子沉淀蛋白质 重金属离子与蛋白质 结合成不溶于水的复合物。
❖ 取1支试管，加入蛋白质溶液2 ml，再加3%硝酸 银溶液1~2滴，振荡试管，有沉淀产生。放置片
刻，倾去上清液，向沉淀中加入少量的水，沉淀 是否溶解？为什么？
+ OH+ H+
实验一 蛋白质的两性反应及等电点的测定[2]
![实验一 蛋白质的两性反应及等电点的测定[2]](https://img.taocdn.com/s3/m/1c48872efd4ffe4733687e21af45b307e871f905.png)
实验一蛋白质的两性反应及等电点的测定[2]一、实验目的2. 掌握测定蛋白质等电点的方法。
二、实验原理1. 蛋白质的两性反应蛋白质是一种复杂的高分子有机化合物，其分子中有许多含酸、含碱基的氨基酸残基。
因此，蛋白质具有两性反应。
当 pH 低于一个特定值时，氨基酸上的氨基质子化，成为带正电荷的离子型，蛋白质带正电；当 pH 高于另一个特定值时，氨基酸上的羧基失去质子，形成带负电荷的离子型，蛋白质带负电。
在这两个特定的 pH 值之间，蛋白质带有等量的正离子和负离子，呈等电点状态。
（1）等电聚焦法等电聚焦法是一种利用直流电场将蛋白质分离的方法。
在等电点时，蛋白质的总电荷为零，不受电场作用，停留在等电点位置，实现蛋白质的分离。
这种方法分辨率高、分离效率好，但设备复杂、操作难度大。
（2）等电点电泳法等电点电泳法是一种利用凝胶电泳原理测定蛋白质等电点的方法。
该方法在凝胶中涂上不同 pH 值的缓冲剂，形成不同 pH 值的电泳区，通过一定时间的电泳分离，观察蛋白质的运动位置，即可确定其等电点。
该方法比较简单、直观，分辨率较低。
三、实验步骤1. 预处理（1）将新鲜鸡蛋清取下，放在常温下静置 30 min，去除蛋清表面的泡沫和浮沫。
（2）采用冷环境离心机，将鸡蛋清离心 10 min，离心后取上清。
（1）将 1 mL 蛋清溶液分别加入 7 个不同 pH 值的缓冲溶液中，分别为 2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0。
（2）观察各实验管中的蛋清溶液的颜色变化。
（1）将 0.2 mL 蛋清溶液加入 4 mL 聚丙烯酰胺凝胶缓冲液中，混合均匀倒入凝胶板中。
（2）试管中加入 3 mL 结晶紫染色溶液（10^-3 M），将凝胶板浸泡在染色溶液中，染色 30 min 后，倒掉染色溶液，用蒸馏水清洗凝胶板几次，至染色液流出凝胶板没有颜色为止。
（3）取出凝胶板，用透明胶带覆盖红色刻度线，用间隔开的两条直线将凝胶板对折，压平，用剪刀从中央向两侧剪开，取下其中一块凝胶，放入测定盒中，插上电极进行电泳。
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一、实验目的
1、了解蛋白质的两性解离性质。
2、初步学会测定蛋白质等电点的方
Байду номын сангаас
法。
3、学会正确使用吸量管吸量试液。
二、实验原理
蛋白质分子除含有一定的自由氨基和羧基外， 还含有酚基、巯基、胍基、唑基等，因此，蛋白 质和氨基酸一样也有两性电离的性质。在溶液中， 蛋白质的解离状态受溶液酸碱度影响，酸性溶液 中蛋白质解离成阳离子，碱性溶液中则解离成阴 离子。等电点时，蛋白质分子所携带的正负电荷 相等，以兼性离子存在，在电场中不向正负电极 移动，在溶液中溶解度最小，容易沉淀析出。
剂 i ]
• 该实验要求各种试剂的浓度和加入量 必须相当准确。实验中应严格按照定 量分析的操作进行。
• 思
考
题
• 何谓蛋白质的等电点？ • 在等电点时蛋白质的溶解度为什么 最低？请结合你的实验结果和蛋白 质的胶体性质加以说明。
剂 i ]
1 3.2 0.8
剂 i ]
2 － －
4.0 － 1.0 4.1
3 2.0 －
2.0 － 1.0 4.4
4 3.0 －
1.0 － 1.0 4.7
5 3.5 －
0.5 － 1.0 5.0
6 1.5 －
－ 2.5 1.0 5.3
7 2.75 －
－ 1.25 1.0 5.6
－ －
1.0 3.8
• 2、静置约20分钟，观察每支试管中溶 液的混浊度，以一，十，十十，十十 十，十十十十符号表示沉淀的多少。 根据观察结果指出哪一个pH是酪蛋白 的等电点？
（6）0.01 mol/L醋酸溶液。 （8）0.02 mol/L氢氧化钠溶
• （3）0.01％溴甲酚绿指示剂。（4）0.02 mol/L盐酸溶液。 • （5）0.10 mol/L醋酸溶液。 • （7）1.00 mol/L的醋酸溶液 液。
2、仪器 （1）恒温水浴箱 （2）温度计 （3）100 mL容量瓶 （4）50 mL容量瓶 （5）吸量管 （6）试管 （7）试管架等
不同的蛋白质等电点不同，可利用溶解度来 测定其等电点。向各种不同pH值的缓冲溶液中加 入酪蛋白，以沉淀出现最多的缓冲液的pH值为酪 蛋白的等电点。
等电点时，蛋白质以兼性离子存在，容易沉淀析出。
三、试剂和器材
1、试剂
• （1）0.5%酪蛋白溶液
•
（2）酪蛋白乙酸钠溶液：称取纯酪蛋白0.25克，加蒸馏水 20毫升及1.00 mol/L氢氧化钠溶液5毫升(必须准确)，摇荡使 酪蛋白溶解。然后加1.00 mol/L醋酸5毫升(必须准确)，倒人 50毫升容量瓶中，用蒸馏水稀释至刻度，混匀，结果是酪蛋 白溶于0.10 mol/L乙酸钠溶液中，酪蛋白的浓度为0.5%。
剂 i ]
四、操作方法
• （一）蛋白质的两性反应
•
•
1、取1支试管，加0.5％酪蛋白溶液20滴和0.01%溴甲酚绿指 示剂5—7滴，混匀。观察溶液呈现的颜色，并说明原因。
2、用细滴管缓慢加入0.02 mol/L盐酸溶液，随滴随摇，直至 有明显的大量沉淀发生，此时溶液的pH按近于酪蛋白的等电点。 观察溶液颜色的变化。 3、继续滴入0.02 mol/L盐酸溶液，观察沉淀和溶液颜色的变 化．并说明原因。 4、再滴入0.02 mol/L氢氧化钠溶液进行中和，观察是否出现 沉淀，解释其原因。继续滴入0.02 mol/L氢氧化钠溶液，为什么 沉淀又会溶解？溶液的颜色如何变化? 说明了什么问题？
剂 i ]
• •
（二）酪蛋白等电点的测定 1、取7支粗细相近的干燥试管， 编号后按下表的顺序准确地加入各 种试剂。加入每种试剂后应混合均
剂 i ]
匀。
试 管 编 号 蒸馏水 1.00 mol/L 加 醋酸 入 0.10 mol/L 试 醋酸 剂 (ml 0.01 mol/L 醋酸 ) 酪蛋白乙酸 钠 溶液最终pH 沉淀出现情况