差异致龋性变形链球菌细胞外蛋白质组学的初步研究

差异致龋性变形链球菌细胞外蛋白质组学的初步研究戴煦原;崔伟;杨光;王成龙【摘要】目的:分析不同致龋性变形链球菌之间细胞外蛋白质的差异性,研究变形链球菌的胞外蛋白在细菌致龋过程中的作用.方法:相同条件培养变形链球菌的不同致龋性的临床分离株,提取各菌株的细胞外蛋白,利用双向电泳和质谱分析进行蛋白组学的分析,重组表达并纯化在不同致龋性变形链球菌表达有差异的胞外蛋白.结果:获得在不同致龋性变形链球菌中构成与表达量有差异性的细胞外蛋白,并重组表达了这一组蛋白中的S1蛋白.结论:不同致龋性变形链球菌细胞外蛋白表达有差异,这些差异蛋白有可能在变形链球菌致龋过程中具有重要的生物学功能.【期刊名称】《中华老年口腔医学杂志》【年(卷),期】2019(017)004【总页数】5页(P193-197)【关键词】变形链球菌;蛋白组学;双向电泳;质谱分析【作者】戴煦原;崔伟;杨光;王成龙【作者单位】解放军总医院第一医学中心口腔科北京 100853;解放军总医院第一医学中心口腔科北京 100853;军事科学院军事医学研究院毒物药物研究所抗毒药物与毒理学国家重点实验室北京 100850;解放军总医院第一医学中心口腔科北京100853【正文语种】中文【中图分类】R781龋病是一种牙体硬组织的慢性破坏性疾病，变形链球菌是导致龋病发生发展的主要致龋菌[1～3]。

对于变形链球菌致龋因子的结构和功能，包括葡糖基转移酶[4～6]、表面抗原AgI/II蛋白家族[7,8]、葡聚糖结合蛋白[9,10]以及群体感应密切相关LuxS蛋白和信号分子AI-2[11]等，学者们已经有了比较明确的认识。

但是基于变形链球菌致龋因子的龋病防治效果还不能令人满意[4,9,12,13]。

分泌蛋白质组(Secretome)是蛋白质组学研究的重要内容，是对细胞释放到胞外的全部蛋白质(细胞外蛋白)的研究。

病原菌的分泌蛋白质往往含有致病或毒性因子，与疾病发病机制密切相关，对疾病发病机理的研究等具有重要意义[14～18]。

关于变形链球菌分泌蛋白质组研究，目前国内外还未见文献报道。

我们在前期研究工作[19]的基础上，研究高、低致龋性变形链球菌细胞外蛋白质的差异，希望能够发现除GTF、GBPs等致龋因子外，不同致龋性变形链球菌差异表达的蛋白并为这些差异表达蛋白在致龋过程中的作用及其机理研究打下基础。

1.材料与方法1.1 菌株变形链球菌国际标准株Streptococcus mutans Ingbritt(首都医科大学附属北京口腔医院口腔医学研究所提供)，低致龋性临床分离株4号、高致龋性临床分离株5号[19,20](本课题组保存)。

1.2 主要仪器 ImageMaster 2Dplatinum双向电泳凝胶图像分析软件；Burke公司REFLEXTMIII型基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱仪(MALDITOF-MS)；Micromass公司ESI-MS/MS(Q-TOF 2)质谱仪；Bio-Rad Protena II型垂直电泳仪。

1.3 实验方法1.3.1 变形链球菌细胞外蛋白制备参照Liu Y等的 TCA(三氯乙酸)法[21]。

1.3.2 双向电泳第一向等电聚焦；第二向SDS-PAGE电泳。

1.3.3 银染色1.3.4 ImageMaster 2D platinum软件分析双向电泳凝胶图像运用Image Master 2D Platinum软件对电泳凝胶图像蛋白质斑点进行检测、量化、背景扣除、匹配，自动检测后手工校对，取4号菌株凝胶图像作为参考凝胶，5号菌株凝胶图像与之匹配。

1.3.5 质谱分析 ESI-MS/MS正交加速电喷雾串联质谱仪，配有毛细管液相色谱和纳升喷雾源，所有测定均为正离子模式，雾化气体为N2，碰撞气体为H2，源温80℃，锥孔电压50V，TOF加速电压9.1kV，MCP检测器电压2200V。

取4ul样本，900V毛细管电压，检测获得串联质谱图，经过MaxEnt3处理后，使用MasSeq推导出肽段序列。

1.3.6 变链菌标准株S1基因克隆、重组表达S1蛋白纯化以变形链球菌Ingbritt基因组为模板，设计合成S1特异性引物，5'F NdeI：CATA TGATGAATGAATTTGAAGA，3'R XhoI：CTC GAGTTATAATTCAATATCAC，通过PCR扩增得到S1基因。

PCR条件为94℃变性，55℃退火，72℃延伸，进行30个循环。

将PCR扩增得到的S1片段用NdeI和XhoI酶切分子克隆至pET-28a载体，将所得表达载体转化至大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中。

通过菌落PCR和基因测序鉴定序列正确性。

挑取pET-28a-S1-BL21阳性克隆于LB(kana+)培养基，37℃220rpm摇床过夜，以1∶100比例接入到新的LB(kana+)培养基中，37℃220rpm摇床培养约1.5小时，OD600约为0.6时，加入1mM IPTG，继续37℃220rpm摇床培养6h，所得菌液5000rpm离心5min去上清，ddH2O重悬后超声裂解，Ni亲和树脂柱亲和纯化于裂解液上清的目的蛋白。

2.实验结果2.1 变形链球菌细胞外蛋白的制备通过TCA沉淀法处理对数生长末期的4、5号变形链球菌菌液分别获得两菌株的细胞外蛋白，经SDS-PAGE电泳验证，4、5号菌的细胞外蛋白的电泳凝胶图像可见蛋白条带存在差异。

2.2 变链菌细胞外蛋白双向电泳对获得的细胞外蛋白样本进行了双向电泳，分析凝胶图像(图1)：蛋白点匹配率76%。

以蛋白量有3倍以上差异为标准，其中4号菌株有高表达蛋白点10个(图1A)，5号菌株有高表达蛋白点4个。

同时5号菌株有特异表达蛋白点4个(图1B)。

图1 变形链球菌细胞外蛋白双向电泳A：低致龋菌株4号；B：高致龋菌株5号(“○”表示高表达蛋白点，数字表示5号与4号蛋白表达量比值，“△”表示特异表达蛋白点)我们挖取了5号菌株电泳的2个高表达蛋白点和2个特异表达蛋白点进行质谱分析(图2)，分别标记为 70、71、72、73。

图2 质谱分析位点(70、71点高表达蛋白点，72、73为特异表达蛋白点)2.3 质谱分析通过对4个差异蛋白点质谱分析获得以下结果(表1)。

表1 差异致龋性变形链球菌细胞外蛋白质谱分析表NCBI GI number Protein name[strain]gi|488197484 gi|488222043 gi|488206298 gi|3130093gi|24379801 gi|24379637 gi|21666296 gi|290581292 gi|488240714gi|488208813 gi|24378856 gi|488207400 gi|24378589 gi|488207131gi|24380475 gi|24379669 gi|490994699 gi|516665418 gi|15341180gi|446651915 gi|488193341 gi|195978262 glucan-binding proteinA,GbpA[Streptococcus mutans]glucan-binding proteinA,GbpA[Streptococcus mutans]levansucrase precursor[Streptococcus mutans]glucosyltransferase-I[Streptococcus mutans]glucan-binding protein GbpC[Streptococcus mutans UA159]5'-nucleotidase[Streptococcus mutansUA159]GroEL[Streptococcus mutans]levansucraseprecursor[Streptococcus mutansNN2025]glucosyltransferase-SI[Streptococcus mutans]glucosyltransferase-I,partial[Streptococcus mutans]elongation factor G[Streptococcus mutansUA159]levansucrase precursor[Streptococcus mutans]hypothetical proteinSMU_63c[Streptococcus mutans UA159]30S ribosomal proteinS1[Streptococcus mutans]hypothetical protein SMU_2147c[Streptococcus mutans UA159]enolase[Streptococcus mutans UA159]sugar ABC transporter substrate-binding protein[Klebsiellaoxytoca]enolase[Streptococcus ferus]glucan-binding proteinB[Streptococcus mutans]trigger factor[Bacillus cereus]recombinaseA[Streptococcus mutans]30S ribosomal protein S1[Streptococcus equi subsp.Zooepidemicus MGCS10565]2.4 重组表达S1蛋白我们利用变形链球菌基因组为模板，使用S1特异性引物，PCR钓取S1片断(图3)，测序鉴定序列正确，构建pET-28a-S1表达载体并转入大肠杆菌BL21感受态细胞，菌落PCR(图4)及测序鉴定：pET-28a-S1表达载体构建成功。

图3 PCR钓取S1片段1：对照；2：S1图4 pET-28a-S1-BL21菌落PCR测序正确的阳性克隆成功在37℃、1mM IPTG诱导下成功表达分子量大约为50kDa的S1蛋白。

利用pET-28a载体表达系统自带的his标签，使用Ni离子螯合柱成功纯化获得了纯度较高的重组表达S1 蛋白(图 5)。

图5 S1蛋白重组表达SDS电泳图3.讨论蛋白质组学研究是对蛋白质的成分、表达和修饰的动态变化从整体水平进行的研究。

既往变形链球菌的蛋白组学的相关研究多为关于突变株[16]蛋白表达差异、不同生存条件下[22]的蛋白表达差异以及不同黏附状态下[23]的蛋白表达差异的研究。

而使用蛋白质组学方法研究不同致龋性变形链球菌差异蛋白对于致龋因子和龋病发病机理研究意义更大。

赵兴福，黄晓晶等[15]的研究显示来自高龋患者和无龋者的血清C型变形链球菌的临床分离株的蛋白表达有差异。