细菌质粒DNA的制备

细菌质粒DNA的制备

一、目的要求

掌握平板法分离单菌落、细菌质粒DNA的提取方法（碱裂解法）、菌株的保存和复苏，掌握紫外分光光度法测定DNA含量的方法，掌握DNA电泳方法。

二、基本原理

质粒是一种染色体外的稳定遗传因子，为双链闭合环状DNA分子，具有自主复制和转录能力，可表达他携带的遗传信息。质粒在细胞内的复制一般分为严紧型和松弛型两种。前者只在细胞周期的一定阶段进行复制，每个细胞内只含有1或几个拷贝。后者在整个细胞周期中随时可以复制，在细胞里为多拷贝。基因工程操作中所用的载体质粒均为松弛型质粒。

所有分离质粒DNA的方法都包括三个基本步骤：培养细菌使质粒扩增；收集和裂解细菌；分离和纯化质粒DNA。采用溶菌酶可破坏菌体细胞壁（G-菌多无需此步骤）。在pH 12.0～12.6 碱性环境中，细菌的线性大分子量染色体DNA 变性分开，而共价闭环的质粒DNA 虽然变性但仍处于拓扑缠绕状态。将pH 调至中性并有高盐存在及低温的条件下，大部分染色体DNA 、大分子量的RNA 和蛋白质在去污剂SDS 的作用下形成沉淀，而质粒DNA 仍然为可溶状态。通过离心，可除去大部分细胞碎片、染色体DNA 、RNA 及蛋白质，质粒DNA 尚在上清中，然后用酚、氯仿抽提进一步纯化质粒DNA 。

琼脂糖凝胶电泳是分离、鉴定和纯化DNA片段的标准方法之一。琼脂糖是从海藻中提取出来的一种线状高聚物，将其熔化在所需缓冲液中使成清澈、透明的溶液，然后倒入胶模令其固化。不同浓度的琼脂糖形成的固体基质具有不同的密度（或孔隙度），因此适宜分离不同大小的DNA片段。在电场中，DNA分子主要因其分子大小不同而被分离。在pH 值为8.0～8.3 时，核酸分子碱基几乎不解离，磷酸全部解离，核酸分子带负电，在电泳时向正极移动。采用适当浓度的凝胶介质作为电泳支持物，在分子筛的作用下，使分子大小和构象不同的核酸分子泳动率出现较大的差异，从而达到分离核酸片段检测其大小的目的。核酸分子中嵌入荧光染料（如EB ）后，在紫外灯下可观察到核酸片段所在的位置。

三、实验步骤（具体参照试剂盒说明书）

质粒DNA的提取（参考步骤）

1．将5 mL含相应抗生素的LB加入容量为15 mL并通气良好（不盖紧）的试管中，然后接入一单菌落，于37℃下剧烈振摇培养过夜。

2．将1.5 mL培养物倒入微量离心管中，用微量离心机12 000g离心30秒，将剩余培养物贮存于4℃。

3．吸去培养液，使细菌沉淀尽可能干燥。

4．将细菌沉淀重悬于100 μl溶液I（50 mM葡萄糖，25 mM Tris·Cl pH 8.0，10 mM EDTA pH 8.0）中，剧烈振荡。

5．加200 μl新配制的溶液II（0.2 M NaOH，1%SDS）。盖紧管口，快速颠倒离心管4次，以混合内容物。不要振荡，将离心管放置于冰上。

6．加150 μl用冰预冷的溶液III（5 M乙酸钾60 mL，冰乙酸11.5 mL，水28.5 mL）。盖紧管口，将管倒置后温和振荡10秒钟使溶液III在粘稠的细菌裂解物中分散均匀，之后将管置于冰上3—5分钟。

7．用微量离心机以12 000g离心5分钟，将上清转移到另一离心管中。

8．加入RNase H至终浓度，55℃消化30分钟。

9．加等量酚:氯仿，振荡混匀，用微量离心机以12 000g离心2分钟，将上清转移到另一离心管中。

10．可做可不做：加等量氯仿，振荡混匀，用微量离心机以12 000g离心2分钟，将上清转移到另一离心管中。

11．加入1/10体积0.02M乙酸钠，用等体积异丙醇于室温沉淀双链DNA。振荡混合，用微量离心机以12 000g离心5分钟。

12．弃去上清液，用1mL冰预冷的75%乙醇洗涤，用微量离心机以12 000g离心5分钟。13．弃去上清液，尽量除尽管内液体。在空气中使核酸沉淀干燥。

14．将沉淀重新溶解在无菌水或TE溶液中，贮存于-20℃。

琼脂糖凝胶电泳

1.琼脂糖凝胶板的制备

配制1%琼脂糖-TAE（242 g Tris，57.1 ml乙酸，100ml 0.5M EDTA pH 8.0，用时稀释50倍）凝胶液。待琼脂糖完全溶解并冷却至65℃左右，小心倒入有机玻璃内槽，控制灌胶速度，使胶液缓慢展开，直到在整个有机玻璃板表面形成均匀的胶层。室温下静置1 h左右，待凝固完全后，将铺胶的有机玻璃内槽放在电泳槽中待用。

2.加样

在电泳槽中注入TAE稀释液，没过整个胶面，拔下加样梳。向DNA样品中加入1/10体积的加样缓冲液（0.25%溴酚蓝，40%蔗糖水溶液），充分混匀，用微量加样器将DNA样品加入加样孔中。可在相隔加样孔中加入DNA marker，以估计DNA条带分子量。

3.电泳

加完样品的凝胶板立即通电，进行电泳，电场强度不高于5 V/cm。当指示剂移动到距离胶板下沿约1-2 cm处，停止电泳。

4.观察

电泳凝胶用EB（溴乙锭）染色（可提前加入琼脂糖凝胶液中），在波长为254 nm的紫外灯下，观察染色后的电泳凝胶。紫外光激发30秒左右，肉眼可观察到清晰的条带。在紫外灯下观察时，应戴上防护眼镜或有机玻璃防护面罩，避免眼睛遭受强紫外光损伤。

附注：质粒检测

电泳检测：质粒电泳一般有三条带，分别为质粒的超螺旋、开环、线型三种构型

吸光值检测：采用分光光度计检测260nm 、280nm 波长吸光值，若吸光值260nm/280nm 的比值介于1.7 －1.9 之间，说明质粒质量较好，1.8 为最佳，低于1.8 说明有蛋白质污染，大于 1.8 说明有RNA 污染。