细菌质粒DNA的制备
质粒dna提取原理
质粒dna提取原理
质粒DNA提取原理是通过破坏细菌细胞壁和细胞膜结构，释
放质粒DNA，并利用化学方法提取纯化质粒DNA。
质粒DNA提取的步骤如下：
1. 细胞裂解：将细菌培养物经过离心，得到菌体沉淀，然后加入裂解缓冲液，破坏细菌细胞壁和细胞膜，释放质粒DNA。
2. 质粒DNA纯化：加入一定量的碱性溶液，使细菌染色体DNA变性沉淀，而质粒DNA仍溶于溶液中。
然后通过离心，将质粒DNA沉淀下来。
3. 质粒DNA沉淀：将溶液中的质粒DNA与乙醇混合，使质
粒DNA沉淀成片状。
通过离心，得到质粒DNA沉淀。
4. 质粒DNA溶解：将质粒DNA沉淀洗涤去除杂质，并用适
当的缓冲液将质粒DNA溶解，得到高浓度的质粒DNA。
质粒DNA提取的关键在于破坏细菌细胞结构，释放质粒DNA，然后利用沉淀和溶解等步骤进行纯化。
通过以上步骤，可以提取到纯化后的质粒DNA，用于后续实验或分析。
质粒dna的提取实验报告
质粒dna的提取实验报告质粒DNA的提取实验报告引言：DNA提取是分子生物学研究中的基础实验之一，通过提取DNA可以进一步进行PCR扩增、基因克隆等实验。
本实验旨在提取质粒DNA，质粒DNA是存在于细菌细胞质中的环状DNA分子，具有重要的研究价值。
本文将详细介绍实验的步骤、原理以及结果分析。
材料与方法：1. 细菌培养液：选择含有目标质粒的细菌进行培养，如大肠杆菌。
2. 细菌培养基：选择适宜的培养基，如LB培养基。
3. 细菌培养器具：如培养皿、离心管等。
4. DNA提取试剂盒：选择适合的DNA提取试剂盒，如酚/氯仿法或硅胶柱法。
5. 离心机：用于离心细菌培养液以获取细菌沉淀。
6. 紫外可见分光光度计：用于检测DNA的纯度和浓度。
实验步骤：1. 细菌培养：将含有目标质粒的细菌接种于LB培养基中，培养过夜，使细菌充分繁殖。
2. 收集细菌：将培养液离心，以12000转/分钟离心10分钟，将细菌沉淀收集。
3. 细胞裂解：加入适量的细胞裂解缓冲液，使细菌细胞裂解，释放DNA。
4. 蛋白质沉淀：加入酚/氯仿混合液，离心分离上层的DNA溶液和下层的蛋白质。
5. DNA沉淀：将DNA溶液转移至新的离心管中，加入等体积的冷乙醇，轻轻倒置离心管，使DNA沉淀出来。
6. DNA洗涤：用70%的乙醇洗涤DNA沉淀，去除残余的盐和杂质。
7. DNA溶解：用适量的去离子水溶解DNA沉淀，得到纯净的DNA溶液。
8. DNA浓度检测：用紫外可见分光光度计检测DNA的浓度和纯度。
结果与分析：通过实验，成功提取了质粒DNA，并进行了浓度检测。
根据实验结果，我们可以得到DNA的浓度和纯度信息，这对于后续的实验设计和操作非常重要。
此外，实验中还可以通过凝胶电泳等方法对提取的DNA进行进一步的分析，如确定DNA的大小和完整性。
结论：本实验成功提取了质粒DNA，并获得了纯净的DNA溶液。
通过浓度检测和进一步的分析，我们可以进一步了解DNA的特性和应用。
质粒dna的提取步骤
质粒dna的提取步骤质粒DNA的提取步骤质粒DNA是细菌中的圆形DNA分子，与细胞染色体不同，可以在细菌中自主复制。
质粒DNA的提取是一项常规实验，可用于高效地分离纯化质粒。
在进行质粒DNA提取之前，需要准备一些必要的试剂和设备。
材料和试剂：1.细菌培养物2.经过钙离子或热处理的TTES缓冲液（10mM Tris-HCl [pH8.0]，1mM EDTA [pH8.0]，25%蔗糖溶液）3.蛋白酶K处理缓冲液（50mM Tris-HCl [pH8.0]，100mM NaCl，10mM EDTA [pH8.0]）4.醇5.异丙醇6.以太7.加拿大CFII列的紫外灯8.恒温振荡器步骤：1.收集培养物将培养物用无菌工具收集到1.5毫升离心管中。
通过离心将细胞沉淀到离心管底部。
2.细胞溶解添加500 μl TTES缓冲液到离心管中，并用Vortex或20号钢珠打破细胞壁。
将离心管放在水浴中恒温振荡器中，30分钟以70 rpm。
3.移除细胞碎片离心管离心2分钟，将浮于上层的无菌细胞断片去除（上清），移至另外的离心管。
4.蛋白酶K处理向上清中加入100 μl蛋白酶K处理缓冲液和15μl蛋白酶K，室温下静置10分钟，然后加入200 μl醇混合液（3：7乙醇：异丙醇），与上清混合均匀。
5.沉淀DNA的制备离心管离心2分钟，然后将上清倒出。
沉淀物将采用70%的醇作为清洗液，在沉淀物上滴入1 ml的70%醇，在打破后的沉淀物中短暂的搅拌。
离心管轻轻晃动，浮于上层的除去，再加1ml的70%酒精，将沉淀物中混合在一起。
6.沉淀物最佳溶解将沉淀物在无尘工作台上空气干燥（大约10~15分钟），直到酒精挥发。
将沉淀物用10毫升 TE缓冲液（10mM Tris-HCl [pH8.0]，1mM EDTA [pH8.0]）悬浮，经缓慢抽气镇静。
7.检测提取的DNA通过紫外光下的可见目标，如果质粒DNA等目标脱胶，就可以看到了。
通常设定为 OD260/OD280值为1.8-2.0。
碱裂解发制备质粒DNA原理
碱裂解发制备质粒DNA原理碱裂解法是一种常用的制备质粒DNA的方法，其原理是通过使用碱性溶液将细菌细胞膜和核酸中的蛋白质进行裂解，从而分离出质粒DNA。
下面将详细介绍碱裂解法的原理和步骤。
碱裂解法的原理是利用强碱溶液（如NaOH或KOH）对细菌细胞进行裂解，同时可去除细胞膜及其上的蛋白质，使质粒DNA从细胞内部释放出来。
此外，碱性环境可以使DNA表现为单链结构，这使得DNA与其他形式的核酸（如RNA和DNA-蛋白复合物）有所区别，有助于后续的提取和纯化。
制备质粒DNA的碱裂解法的步骤如下：1.菌液培养：选取含有质粒的细菌菌株，在适宜的培养基中培养至合适的生长期。
2.收获细菌细胞：采用离心等方法将细菌细胞从菌液中收集。
通常使用蒸馏水进行细菌菌液的稀释，以确保细菌能够在蒸馏水中悬浮均匀。
3.清洗细菌细胞：使用理化方法（如洗涤剂、EDTA、乙醇等）将细菌细胞洗净。
这一步骤的目的是去除掉附着在细菌细胞表面的杂质，减少对后续步骤的影响。
4.裂解细菌细胞：将清洗后的细菌细胞悬浮在碱性溶液（如0.2MNaOH）中，使其完全裂解。
碱性溶液的作用是破坏菌细胞膜结构，去除蛋白质，并使DNA变为单链结构。
5. 中和反应：在细菌细胞裂解后，添加中和剂（如2 M Tris-HCl, pH 7.4），将溶液的pH值迅速调整到酸性，以中和碱性溶液中的氢氧根离子。
6.沉淀DNA：通过离心将细菌细胞碎片和其他残余物沉淀下来，将上清液（含有质粒DNA）收集。
7.聚集DNA：通过旋转浓缩、加入盐类或乙醇等方法，将质粒DNA聚集成颗粒状沉淀。
8. 洗涤和纯化：使用缓冲液（如低浓度Tris-HCl或盐溶液）洗涤和纯化质粒DNA，去除残余的盐和杂质。
9.确定DNA浓度和纯度：通过分光光度法或凝胶电泳等方法，测定质粒DNA的浓度和纯度，以确定提取的质粒DNA是否适合下游实验。
总之，碱裂解法通过利用强碱溶液裂解细菌细胞，去除蛋白质，使质粒DNA释放出来，并通过离心、沉淀、洗涤和纯化等步骤，得到高纯度的质粒DNA。
质粒DNA提取及纯化
质粒DNA 提取纯化、DNA 电泳检测实验目的1．掌握质粒DNA 的制备的原理和方法2．了解质粒琼脂糖凝胶电泳分离二、实验原理1．质粒DNA 的制备方法质粒(Plasmid) 是独立存在于染色体外、能自主复制并能稳定遗传的一种环状双链DNA 分子，分布于细菌、放线菌、真菌以及一些动植物细胞中，但在细菌细胞中含量最多。
细菌质粒大小介于1～200Kb 之间，是应用最多的质粒类群，在细菌细胞内它们利用宿主细胞的复制机构合成质粒自身的DNA 。
质粒DNA 的制备包括3 个步骤：①培养细菌，使质粒DNA 大量扩增；②收集和裂解细菌；③分离和纯化质粒DNA 。
主要方法包括：碱裂解法：0.2molNaOH+1%SDS ；煮沸裂解法：沸水煮沸40 秒；SDS 裂解法：10%SDS ，一般用于质粒大量提取。
在实际操作中可以根据宿主菌株类型、质粒分子大小、碱基组成和结构等特点以及质粒DNA 的用途进行选择。
本实验选择碱裂解法提取质粒DNA 。
2．碱裂解法质粒DNA 具特定的形态结构，在特殊的环境条件下，如加热、极端pH 值、有机溶剂、尿素、酰胺试剂等会导致质粒DNA 变性，去除变性条件又可以使DNA 复性。
碱裂解法根据共价闭合环状质粒DNA 和线性染色体DNA 在拓扑学上的差异来分离质粒DNA 。
SDS 是一种阴离子表面活性剂，它既能裂解细菌细胞，又能使细菌蛋白质变性。
SDS 处理细菌细胞后会导致细菌细胞壁破裂，从而使质粒DNA 及细菌基因组DNA 从细胞中同时释放出来。
细菌环状基因组DNA 在操作过程中会断裂成线状DNA 分子，在pH 值介于12.0 ～12.5 这个狭窄的范围内，线性的DNA 双螺旋结构解开而被变性，尽管在这样的条件下，共价闭环质粒DNA 的氢键会被断裂，但两条互补链彼此相互盘绕结合在一起。
当加入pH4.8 乙酸钾缓冲液时，pH 恢复至中性，因为共价闭合环状的质粒DNA 的两条互补链仍保持在一起，因此复性迅速而准确，而线性的染色体DNA 的两条互补链彼此已完全分开，复性就不会那么迅速而准确，它们相互缠绕形成不溶性网状结构，而复性的质粒DNA 恢复原来构型，保持可溶性状态。
质粒dna提取实验报告
质粒dna提取实验报告实验目的：本实验旨在通过提取细菌质粒DNA，了解细菌质粒的结构、基因组成和使用纯度较高的质粒DNA的重要性，为后续分子生物学实验打下基础。
实验器材：- 细菌- LB液体培养基- 1.5mL微量离心管- 离心机- 动态温度水浴仪- 恒温振荡器- 超声波清洗器- 洁净平台和无菌技术用品- 始终细切割刀和取样刷- 蒸馏水、2% SDS、醋酸铵、90%乙醇、异丙醇和干燥机实验步骤：1. 制备细菌：在LB液体培养基中培养要提取质粒DNA的细菌，由于质粒DNA在对数生长期达到最高含量，因此在显微镜下观察到对数生长期的细菌时进行取样。
2. 细胞打破和溶解质粒：离心细胞，倒去培养基，加入10mL蒸馏水，用振荡器在4℃下以300rpm摇晃3小时。
然后沉淀细胞，在70℃下干燥30分钟。
随后加入150μL1%SDS和其他化学试剂混合物，使用至少15次的起始细切割刀切成绒毛状的颗粒，浸泡在低盐度醋酸铵中2小时以上。
3. 质粒DNA纯化：将浸泡了细菌绒毛颗粒的混合物离心，抽取上清液，将其加入2x体积的异丙醇与等体积的75%，然后用再生明胶抑制蛋白质在异丙醇中凝聚。
离心，除去异丙醇上清液，加入70%乙醇洗涤。
最后用干燥机吸干。
4. 质量分析：分析提取到的质粒DNA的浓度和纯度，使用分光光度计对其进行光谱分析，以检测质粒DNA的A260/A280比例和A260/A230比例。
通过比较纯度，然后将质粒DNA冻保存至-20℃或-80℃。
实验结论：本实验成功提取了细菌的质粒DNA，并进行了纯化和分析。
质粒DNA的提取和纯化是基于一系列物理和化学方法和技术的，实际操作中需要仔细操作，耐心等待，严格注意洁净操作，才能达到最佳的提取和纯化效果。
通过本实验，我进一步了解了在分子生物学和遗传学中质粒DNA的重要性，它可适用于多种研究项目和应用，例如质粒克隆、基因编辑、基因表达、和质粒蛋白质互作等。
实验十一 细菌质粒DNA的提取和纯化
实验十一细菌质粒DNA的提取和纯化一、实验目的：通过细菌质粒DNA的提取，掌握共价闭合环状DNA的提取方法。
二、实验原理：1、细菌中有两种DNA，即染色体DNA和质粒DNA。
2、质粒DNA的提取方法有三种：碱裂解法、煮沸法和去污剂（如Triton 和SDS）裂解法。
3、碱裂解法比较剧烈，可破坏碱基配对，使宿主细胞DNA变性，共价闭合环状DNA由于空间缠绕，两条链不会彻底分开。
当外界条件到达复性条件时，质粒DNA的双链又迅速恢复原状，而较大的线性染色体DNA难以复性。
当菌体在NaOH和 SDS溶液中裂解时，蛋白质与DNA发生变性，当加入中和液后，质粒DNA分子能够迅速复性，呈溶解状态，离心时留在上清中；蛋白质与染色体DNA不变性而呈絮状，离心时可沉淀下来。
纯化质粒DNA的方法通常是利用了质粒DNA相对较小及共价闭环两个性质。
例如，氯化铯-溴化乙锭梯度平衡离心、离子交换层析、凝胶过滤层析、聚乙二醇分级沉淀等方法，但这些方法相对昂贵或费时。
对于小量制备的质粒DNA，经过苯酚、氯仿抽提，RNA酶消化和乙醇沉淀等简单步骤去除残余蛋白质和RNA，所得纯化的质粒DNA已可满足细菌转化、DNA片段的分离和酶切、常规亚克隆及探针标记等要求，故在实验室中常用。
三、实验材料：含有PMD19质粒的大肠杆菌（E. coli.）菌液四、实验用具和药品：实验用具：摇床、离心机、移液器及枪头、玻璃试管（15mL）及塞子、离心管（1.5mL）。
实验药品：五、实验步骤：（一）细菌繁殖第1天晚上：吸取含质粒的菌液2μL，转移入2mL LB（加入相应抗生素），37℃，过夜振荡（200r/min）培养。
（二）菌体收集第2天早晨(时间:约2-3h左右)： 1、将过夜培养的菌体转入1.5mL离心管，5000r/min离心30sec；2、弃上清（三）碱裂解法提取质粒DNA1、将上述沉淀重悬于100μL冰预冷的溶液Ⅰ中，剧烈震荡（须使沉淀完全分散） (葡萄糖：悬浮细胞；EDTA；抑制DNAase)10次，该过程应小2、加入200μL溶液Ⅱ，盖紧管口，轻柔颠倒离心管5~于5min；（NaOH：溶解细胞膜，释放DNA；SDS）10次，3、加入150μL冰预冷的溶液Ⅲ，盖紧管口，温和地颠倒离心管5~该过程大于5min；（乙酸钾：和SDS 反应生成PDS（十二烷基硫酸钾），沉淀蛋白，同时体积较大的染色体DNA也一起沉淀；冰乙酸：中和NaOH ）4、10000r/min离心5min；5、上清转移到另一新1.5mL离心管中；6、加入2倍体积的无水乙醇，充分混匀，室温放置2min（若沉淀不充分，可加入1/10体积3mol/L的醋酸钠）；7、10000r/min离心5min；9、弃上清，干燥沉淀；9、加TE溶解沉淀，保存。
质粒dna提取步骤
质粒dna提取步骤
质粒 DNA 提取是分子生物学实验中的一项基本技术，用于从细菌细胞中分离出质粒DNA。
以下是一般的质粒 DNA 提取步骤：
1. 收集细菌培养物：将含有质粒的细菌培养在适当的培养基上，直到培养物达到合适的密度。
可以使用离心或过滤的方法收集细菌细胞。
2. 细胞裂解：将收集的细菌细胞加入裂解缓冲液中，通过物理方法（如搅拌、超声处理等）或化学方法（如加入裂解酶等）使细胞破裂，释放出质粒 DNA 和其他细胞成分。
3. 去除细胞碎片：将裂解后的混合液通过离心或过滤的方法去除细胞碎片和其他杂质。
4. 沉淀 DNA：向裂解液中加入乙醇或异丙醇等沉淀剂，使质粒 DNA 沉淀。
通过离心将沉淀收集。
5. 洗涤沉淀：用 70%的乙醇洗涤沉淀，以去除残留的盐分和杂质。
6. 干燥沉淀：将洗涤后的沉淀离心，并去除上清液。
然后将沉淀在室温下干燥，以去除残留的乙醇。
7. 溶解 DNA：将干燥的沉淀加入适当的缓冲液中，使质粒 DNA 溶解。
可以在缓冲液中加入 RNA 酶以去除 RNA 杂质。
8. 纯化和浓缩 DNA：可以使用柱层析、电泳或其他方法对提取的质粒 DNA 进行进一步的纯化和浓缩。
9. 质量检测：使用琼脂糖凝胶电泳或其他适当的方法检测提取的质粒 DNA 的质量和完整性。
需要注意的是，具体的质粒 DNA 提取步骤可能因使用的试剂盒或实验条件而有所不同。
在进行质粒 DNA 提取之前，应仔细阅读所使用的试剂盒说明书或相关实验方案，并根据实际情况进行适当的调整和优化。
碱裂解法提取质粒DNA的实验原理和操作步骤
碱裂解法提取质粒DNA的实验原理和操作步骤碱裂解法是一种常用的方法，用于提取质粒DNA（plasmid DNA）纯化。
以下是具体的实验原理和操作步骤。
实验原理：碱裂解法利用碱性溶液将细菌细胞的细胞壁和细胞膜溶解，使细菌细胞内的质粒DNA被释放出来。
接着，使用中性化剂中和碱性溶液，使DNA带正电荷，而细胞中的蛋白质则带负电荷，从而能够通过离心将DNA与蛋白质分离。
最后，通过浓缩、洗涤和纯化，得到高质量的质粒DNA。
操作步骤：1.培养细菌：选取含有质粒DNA的细菌菌株，如大肠杆菌。
在含有适当抗生素的培养基中培养细菌菌株。
2.收获细菌：当菌液呈现较稠的浑浊状态时，收取细菌培养物。
使用离心机将菌液离心，分离菌体沉淀和上清液。
将上清液倒掉，保留菌体沉淀。
3.碱裂解：将菌体沉淀溶解于碱性溶液中，如盐酸和十二烷基硫酸钠（SDS）溶液。
轻轻混合并将溶液放入水浴中加热，使细菌细胞壁和细胞膜被溶解。
4.中和：使用中性化剂，如醋酸，使溶液中的酸性物质中和。
这样可以确保DNA带正电荷，而蛋白质和其他污染物则带负电荷。
5.离心：将溶液离心，在离心过程中，DNA会与细胞内其他分子分离，形成一个DNA沉淀。
上清液中含有蛋白质和其他污染物。
6.洗涤：使用洗涤缓冲液，如乙酸盐缓冲液，洗涤DNA沉淀，去除残留的污染物。
7.纯化：用去离子水溶解DNA沉淀，使其溶解在水中。
将溶解的DNA沉淀通过滤纸等过滤装置过滤掉残余杂质。
8.浓缩：通过酒精沉淀法或其他方法，将DNA溶液浓缩到所需的浓度。
9.检测：使用紫外分光光度计等方法，测定提取的质粒DNA的纯度和浓度。
注意事项：1.在实验过程中保持操作环境和仪器无菌。
2.碱裂解法中使用的溶液需准备新鲜，并避免受到污染。
3.操作过程中需要低温处理和离心操作，以保护DNA的完整性。
4.质粒DNA的提取可以根据实验目的进行进一步的扩增、测序或转染等应用。
总结：通过碱裂解法，可以从细菌中提取纯化的质粒DNA。
质粒dna的制备实验报告
质粒dna的制备实验报告质粒DNA的制备实验报告引言：DNA（脱氧核糖核酸）是生物体内负责遗传信息传递的重要分子。
质粒DNA是一种环状的双链DNA分子，广泛存在于细菌和其他一些原核生物中。
质粒DNA具有自主复制的能力，并携带了一些对细菌有益的基因信息。
因此，质粒DNA的制备对于基因工程研究和生物技术应用具有重要意义。
实验目的：本实验旨在通过离心、溶解、酶切及纯化等步骤，制备出高纯度的质粒DNA样品。
实验材料与方法：1. 细菌培养液：含有目标质粒DNA的细菌培养物。
2. 离心管：用于离心沉淀细菌。
3. 离心机：用于离心沉淀细菌和质粒DNA。
4. 细胞裂解缓冲液：含有细胞裂解所需的缓冲盐和酶切酶。
5. 酶切酶：用于切割质粒DNA。
6. 蛋白酶K：用于降解细胞中的蛋白质。
7. 酚/氯仿：用于提取DNA。
8. 异丙醇：用于沉淀DNA。
9. 纯化缓冲液：用于纯化DNA样品。
实验步骤：1. 收获细菌：将培养液离心10分钟，将菌体沉淀收集至离心管中。
2. 细胞裂解：加入适量的细胞裂解缓冲液，使菌体充分裂解，并加入蛋白酶K降解蛋白质。
3. DNA提取：加入等体积的酚/氯仿混合液，轻轻摇动离心管使两相混合，离心分离上下两相。
4. DNA沉淀：将上层水相转移至新的离心管中，加入等体积的异丙醇，轻轻摇动离心管使DNA沉淀。
5. DNA纯化：将DNA沉淀洗涤至纯化缓冲液中，离心沉淀DNA，去除上清液。
6. 测定DNA浓度：使用比色法或荧光法等方法测定DNA的浓度。
结果与讨论：经过上述步骤，我们成功制备出了高纯度的质粒DNA样品。
通过测定DNA浓度，我们可以得到质粒DNA的含量。
实验中使用的细菌培养物中含有目标质粒DNA，经过细胞裂解和酶切等步骤，我们成功地将质粒DNA从其他细胞组分中分离出来。
酚/氯仿提取和异丙醇沉淀的操作使得DNA得以纯化和浓缩。
最后，使用纯化缓冲液洗涤和离心沉淀，去除上清液，进一步提高了DNA的纯度。
质粒dna的碱法大量制备,实验报告
质粒dna的碱法大量制备,实验报告大量制备质粒DNA方法SDS碱裂解法制备质粒DNA：大量制备用碱和SDS处理可以从大规模（500ml）的细菌培养物中分离质粒DNA，所获得的质粒则可通过柱层析或CsCl-溴化乙锭梯度离心进一步纯化：材料：缓冲液和溶液：碱裂解液I：50mmol/L 葡萄糖25mmol/L Tris-HCl （pH8.0）10mmol/L EDTA （pH8.0）（溶液I一次可配制100ml，在15psi[1.05kg/cm2]压力下蒸汽灭菌15min，保存于4摄氏度。
）碱裂解液II：0.2 N NaOH （从10N贮存液中现用稀释）1% （m/V）SDS（溶液II要现用现配，室温下使用）碱裂解液III：5mol/L 乙酸钾60ml冰乙酸11.5ml双蒸水（去离子水）28.5ml 所配成的溶液中钾的浓度为3mol/L，乙酸根的浓度为5mol/L。
保存于4摄氏度，用时置于冰浴中。
）另需：乙醇异丙醇STETE（pH8.0）溶菌酶（10mg/ml）现在开始实验：细胞的制备：1. 挑取转化细菌的单菌落，接种到30ml含适当抗生素的培养基中。
注：a. 试管的体积应该至少比细菌培养物的体积大4倍。
b. 试管不宜盖的太紧c. 应在剧烈振摇下温育2. 在适当的温度和摇速下培养菌液直至对数生长期晚期（OD600约为0.6）。
3. 在含500mlLB、YT或Terrific培养液（预热到37摄氏度）及适当抗生素的烧瓶（2L）中接种25ml对数生长期晚期的菌液，将此培养液在37摄氏度剧烈振摇（300r/min）培养约2.5小时。
注：最后菌液的OD600值应为0.4。
由于不同菌株的生长速度不同，可稍微延长或缩短培养时间，使最终的OD值为0.4。
4. 若质粒为低或中拷贝数的松弛型质粒，在培养液中添加2.5ml 浓度为34mg/ml的氯霉素，使其终浓度为170微克/ml。
注：对于高拷贝数的质粒不需要添加氯霉素。
质粒DNA的制备和酶切
实验十五质粒DNA的制备和酶切一、实验目的及背景质粒时细菌内的共生型遗传因子，它能在细菌中垂直遗传并且赋予宿主细胞一些表型，是比病毒更简单的原始生命。
质粒通过细菌的结合作用，从雄性体转移到雌性体，是细菌有性繁殖的性因子，1952年由Lederburg正式命名为质粒。
质粒是携带外源基因进入细菌中扩增或表达的重要媒介物，这种基因运载工具在基因工程中具有极为广泛的应用价值。
本实验要求掌握最常用的质粒的提取方法。
从大肠杆菌中分离质粒DNA方法众多，目前常用的如碱变性法、煮沸法、SDS法、羟基磷灰石栏层析法等。
各个方法分离是依据宿主菌株类型，质粒分子大小，碱基组成及结构等特点加以选择的，其中碱变性法既经济且得率较高，获得的质粒可以用于酶切，连接与转化。
碱变性法基本原理是，在pH为12.0-12.6的碱性环境中，线性的大分子量细菌染色体DNA变性，而共价闭环质粒DNA仍为自然状态。
将pH调至中性并有高盐浓度存在的条件下，染色体DNA之间交联形成不溶性网状结构，大部分DNA 和蛋白质在去污剂SDS的作用下形成沉淀，而质粒DNA仍为可溶状态，通过离心可去除大部分细胞碎片，染色体DNA，RNA及蛋白质，质粒DNA尚在上清中，再用酚氯仿抽提进一步纯化质粒DNA。
在获得较纯的质粒后，我们常常会利用核酸限制性内切酶对质粒进行酶切，就可以达到在体外有目的地对遗传物质DNA进行改造。
核酸限制性内切酶，是一类能识别双链DNA中特定碱基顺序的核酸水解酶，能够以内切方式水解核酸链中的磷酸二酯键，产生的DNA片段5’端为P，3’端为OH。
根据限制酶的识别切割特性，催化条件及是否具有修饰酶活性可分为I/II/III型三大类，II型酶就是通常指的DNA限制性内切酶，他们能识别双链DNA的特异序列，并在这个序列内进行切割，产生特异的DNA片段。
II型酶分子量较小，仅需Mg2+作为催化反应的辅助因子，识别序列一般为4~6个碱基对的反转重复序列，可以切割DNA 产生三种不同的切口：①5’端突出②3’端突出③平末端。
质粒dna提取实验报告
质粒dna提取实验报告质粒DNA提取实验报告引言：质粒DNA提取是分子生物学研究中常用的技术手段之一。
通过提取质粒DNA，我们可以获得特定的基因片段，进一步进行基因克隆、转染、PCR扩增等实验。
本实验旨在探究质粒DNA提取的方法和步骤，并验证提取的质粒DNA是否纯度高、浓度适宜。
材料与方法：1. 细菌培养：选择含有目标质粒的细菌菌株，如大肠杆菌。
2. 培养基制备：制备含有适当抗生素的LB培养基。
3. 菌液培养：在培养基中接种细菌菌液，培养至适当的生长期。
4. 细菌收获：离心细菌培养液，收集菌体沉淀。
5. 细胞裂解：使用裂解液将细菌细胞壁破裂，释放细胞内的DNA。
6. 蛋白质沉淀：通过加入盐溶液，将蛋白质沉淀下来。
7. DNA沉淀：加入酒精，使DNA沉淀出来。
8. 洗涤：使用乙醇洗涤沉淀的DNA，去除杂质。
9. 干燥：将洗涤后的DNA干燥至无水状。
结果与讨论：经过以上步骤，我们成功提取到了质粒DNA。
下面将对实验结果进行分析和讨论。
首先，我们需要评估提取的质粒DNA的纯度。
常用的方法是使用比色法或分光光度法测量DNA溶液的吸光度比值（A260/A280）。
纯度较高的DNA溶液其吸光度比值通常在1.8-2.0之间。
如果比值低于1.8，说明可能存在蛋白质、RNA 或其他杂质的污染，需要进一步纯化处理。
其次，我们需要评估提取的质粒DNA的浓度。
常用的方法是使用比色法或分光光度法测量DNA溶液的吸光度（A260）。
通过测量吸光度并使用标准曲线，我们可以计算出DNA的浓度。
在实验中，我们可以根据需要调整DNA的浓度，以适应后续实验的要求。
此外，我们还可以通过琼脂糖凝胶电泳来评估提取的质粒DNA的完整性。
将DNA样品与DNA标准品一同加载到琼脂糖凝胶上，经电泳分离后，通过比较DNA带的大小和形态，我们可以初步判断提取的质粒DNA是否完整。
在实验过程中，需要注意的是避免DNA的降解。
DNA在裂解液中容易受到核酸酶的降解，因此在裂解过程中应尽量避免长时间的暴露。
质粒dna 的提取和基因组dna的提取
质粒dna 的提取和基因组dna的提取以质粒DNA的提取和基因组DNA的提取为标题，本文将分别介绍质粒DNA和基因组DNA的提取方法。
一、质粒DNA的提取质粒DNA是存在于细菌细胞内的一个环状DNA分子，它具有独立复制和转录的能力。
质粒DNA的提取是进行基因工程研究和分子生物学实验的重要步骤之一。
质粒DNA的提取方法一般包括以下步骤：1.细菌培养与收获：首先选取含有目标质粒的细菌菌株进行培养，培养至适宜的生长阶段，然后通过离心将细菌菌体收获。
2.细菌菌体破碎：将收获的细菌菌体进行破碎，破碎方法常用的有物理破碎和化学破碎。
物理破碎可以通过超声波处理或高压破碎等方法进行；化学破碎则常使用蛋白酶K等酶进行。
3.质粒DNA的分离：通过离心将破碎后的细菌细胞碎片与其他细胞组分进行分离。
常用的方法包括差速离心和密度梯度离心等。
4.质粒DNA的纯化：将分离得到的质粒DNA进行纯化，去除杂质和其他核酸。
纯化方法常用的有酚-氯仿法、硅胶柱层析法和离子交换层析法等。
5.质粒DNA的测定：对提取得到的质粒DNA进行浓度和纯度的测定，常用的方法有比色法和紫外分光光度法等。
二、基因组DNA的提取基因组DNA是一个生物体内所有基因的总和，它包含了生物体的全部遗传信息。
基因组DNA的提取是进行基因组学研究和遗传分析的重要步骤之一。
基因组DNA的提取方法一般包括以下步骤：1.样品处理：首先选择合适的样品，如动物组织、植物组织或微生物等，然后对样品进行预处理，如细胞破碎、蛋白酶处理等。
2.细胞破碎：将样品中的细胞破碎，使细胞内的DNA释放出来。
破碎方法常用的有物理破碎和化学破碎。
物理破碎可以通过高温、高压或超声波处理等方法进行；化学破碎则常使用蛋白酶K等酶进行。
3.基因组DNA的分离：通过离心将破碎后的细胞碎片与其他细胞组分进行分离。
常用的方法包括差速离心和密度梯度离心等。
4.基因组DNA的纯化：将分离得到的基因组DNA进行纯化，去除杂质和其他核酸。
sds碱裂解法制备质粒dna
sds碱裂解法制备质粒dna
SDS碱裂解法是一种常用的质粒DNA提取方法。
该方法利用定量的SDS和NaOH对细菌细胞进行裂解，使DNA迅速释放。
接着，加入适当的中和缓冲液，使DNA回复其天然形态，并去除蛋白质等污染物。
最后，通过酒精沉淀法或硅胶柱层析法纯化DNA。
以下是该方法的具体步骤：
1.生长细菌
生长适量细菌菌株并收获细菌：可以选择不同种类、不同来源、不同
体积得到不同量的细菌。
2.裂解细胞壁
将细菌沉淀后加入缓冲液和SDS混合。
SDS能够破坏细菌的细胞膜，使细胞壁裂解，从而将DNA释放出来。
3.中和
加入NaOH将溶液pH值升高至12，使DNA形状发生改变，变得易于析出。
接着，加入Tris-HCl中和缓冲液降低pH值，恢复DNA天
然形态，并使DNA强度不受影响。
4.去除杂质
通过高速离心将DNA沉淀下来，将上清液与DNA分离。
可以采用氯仿提取法以去除蛋白质和其他杂质，专用的富集试剂和离心柱可做更细致的纯化。
5.精华DNA
通过酒精沉淀法或硅胶柱层析法纯化DNA。
酒精沉淀法适用于大量DNA纯化，但对于大片段、GC富集的DNA适用。
硅胶柱层析法适用于小规模、高质量、片段少的DNA纯化，但成本稍高，操作复杂。
总之，SDS碱裂解法是一种快速，简单的质粒DNA提取方法。
由于其便捷的操作和高质量的DNA回收率，它已被广泛应用于基因工程和分子生物学等领域。
DNA连接反应的步骤及说明
DNA连接反应的步骤及说明1.质粒DNA的制备：首先需要从大肠杆菌等细菌中提取质粒DNA。
通常方法是通过破碎细菌细胞并利用离心等步骤纯化质粒DNA。
也可以通过体外扩增技术如PCR获得所需的DNA片段。
2.DNA片段的制备：如果需要连接多个DNA片段，就需要对不同的DNA片段进行提取和纯化。
可以利用限制酶切、PCR等技术将所需的片段放入载体中。
3.线性化载体的制备：选取合适的载体，通常是质粒或噬菌体。
首先需要线性化载体，以便容纳连接的DNA片段。
这可以通过限制酶切除去所需连接部分的DNA序列来实现。
4.生成粘性末端：对于需要连接的DNA片段和线性化载体，需要使其末端具有互补碱基序列，以便后续的连接。
这可以通过在连接反应中引入适当的酶来完成，例如聚合酶、牛碱性磷酸酶等。
5.DNA连接反应的进行：将线性化载体与DNA片段放在连接反应的体系中，同时加入DNA连接酶和连接缓冲液。
酶的作用是催化连接反应，连接缓冲液提供了适合的pH和离子环境。
6.酶切修复：DNA连接反应后，需要将未连接的DNA片段去除，并对连接的DNA进行修复。
这可以通过加入限制酶来切除未连接的DNA，再加入DNA连接酶和连接缓冲液来进行修复。
7.质粒复制和筛选：完成酶切修复后，将连接后的DNA转化到宿主细胞中，使其进行质粒复制。
然后利用抗生素筛选或其他遗传标记来筛选出含有目标连接片段的质粒。
DNA连接反应是一个基本而重要的实验技术。
其步骤主要包括质粒DNA的制备、DNA片段的制备和线性化载体的制备、生成粘性末端、DNA 连接反应、酶切修复以及质粒复制和筛选。
在这个过程中，酶的作用起到了催化和修复的关键作用，而连接缓冲液则提供了适合的环境。
通过这一系列的步骤，可以将不同的DNA片段成功连接起来，实现对目标序列的操纵和重组。
这个技术在基因克隆、DNA工程和生物学研究中被广泛应用，为科学家提供了强大的实验工具。
质粒dna提取的方法
质粒dna提取的方法
提取质粒DNA的常用方法主要有：
1. 碱裂解法：将含有质粒DNA的细菌株进行裂解，使细菌质粒DNA与蛋白质分离。
一般使用碱性裂解缓冲液（如0.2 M NaOH）和含有细菌裂解酶（如SDS）的胰酶溶液进行裂解，然后使用中性盐溶液（如3 M醋酸钠）进行酸性沉淀，最后通过离心分离沉淀的质粒DNA。
2. 除菌剂法：使用含有除菌剂（如SDS）的裂解缓冲液直接裂解细菌细胞，使质粒DNA与细菌蛋白质分离。
然后使用物理方法（如离心）分离DNA和蛋白质，最后使用醋酸盐沉淀法分离质粒DNA。
3. 膜裂解法：将含有质粒DNA的细菌株均匀涂在含有质粒DNA结合断裂物的特殊膜上，经裂解后，膜上会形成质粒DNA的斑点。
然后使用洗脱缓冲液将质粒DNA从膜上洗脱，得到纯化的质粒DNA。
4. 商业化质粒DNA提取试剂盒：市面上有各种质粒DNA提取试剂盒可供选择，这些试剂盒能够提供简便、快速、高产量且高质量的质粒DNA纯化方法。
根据试剂盒的不同，步骤和原理会有所区别。
不同的方法适用于不同的实验目的和样品类型，请根据具体情况选择合适的提取方法。
质粒dna的纯化原理
质粒dna的纯化原理
质粒DNA的纯化是通过一系列的实验步骤来获得高纯度的DNA样本。
以下是一种常用的质粒DNA纯化方案：
1. 细菌培养：将含有目标质粒DNA的细菌菌落接种到富含营
养物的培养基中，使其迅速生长扩增。
2. 细菌菌体裂解：通过使用裂解缓冲液，细菌菌体进行裂解，释放出内含的DNA分子。
3. 蛋白质去除：使用蛋白酶进行消化，去除细菌细胞的蛋白质。
4. DNA的沉淀：将DNA溶液加入含有盐和酒精的缓冲液中，使DNA分子形成沉淀。
5. 洗涤：用酒精溶液来洗涤DNA沉淀，去除杂质。
6. 干燥：通过将DNA溶液置于V型试管中，用离心机将溶液
中的酒精去除，进一步浓缩DNA。
7. 溶解：将干燥的DNA沉淀溶解在合适的缓冲液中，使其重
新溶解为溶液。
以上是一种常用的质粒DNA纯化方案，通过这些步骤可以得
到高纯度的质粒DNA样本，用于进一步的实验研究或应用。
质粒DNA的小量制备
质粒DNA的小量制备1.收获1）将2ml含相应抗生素的LB（10ml5xLB+40mlH2O+50ul氨苄）加入到标记好的15ml并通气良好（不盖紧）的试管中，然后接入一单菌落，于37度恒温箱振荡培养过夜。
2）将培养好色泽浑浊的培养物倒入标记好的微量离心管中，用离心机在室温以13000g离心1min。
3）吸取培养液，使细菌沉淀尽可能干燥。
（除去上清的最简便方法是用一次性的吸头接触液面轻缓吸取。
尽可能使吸头远离细菌沉淀）2.裂解1）在细菌沉淀上先加入250ul 冰箱保存的solution1，剧烈振荡（在微量离心管里加一根牙签，再在震荡机上使细菌沉淀迅速分散）（50mmol/L葡萄糖,25mmol/L Tris.Cl,10mmol/L EDTA）2）然后加入250ul新配制solution2 盖紧管口，温和颠倒离心管5次，以混合内容物。
（应确保离心管整个内表面均与溶液接触）（0.2mol/L NaOH,1%SDS）3）加入350ul solution3盖紧管口，温和倒置振荡10秒钟，使粘稠的细菌裂解物分散均匀（5mol/L乙酸钾60ml,冰乙酸11.5ml,水28.5ml）4）再用离心机20000g离心10min，将上清液转移到标记好的2ml收集管中。
5）把收集管离心过柱1min后，倒掉滤液，再加500ul HBC Buffer清洗，离心1min倒掉滤液6）再用700ul DNA Wash Buffer清洗过柱离心1min倒掉滤液，重复2次。
7）再空离心2min后，将收集管过到新标记好的微量离心管·中，打开挥干2min8）最后再加入30-50ul 预热好的Elution Buffer溶解1min后，再离心机13000g离心1min 后，去掉收集柱，保留溶解液。
细菌质粒提取原理及步骤
质粒提取原理及步骤一、导论已经提出过许多方法用于从细菌中提纯质粒DNA，这些方法都含有以下3个步骤：1. 细菌培养物的生长。
2. 细菌的收获和裂解3. 质粒DNA的纯化。
（一）细菌培养物的生长从琼脂平板上挑取一个单菌落，接种到培养物中(有含有行当抗生素的液体培养基中生长)，然后从中纯化质粒，质粒的提纯几乎总是如此。
现在使用的许多质粒载体（如pUC系列）都能复制到很高的拷贝数，惟致只要将培养物放在标准LB 培养基中生长到对数晚期，就可以大量提纯质粒。
此时，不必造反性地扩增质粒DNA。
然而，较长一代的载体(如pB R322)由于不能如此自由地复制，所以需要在得到部分生长的细菌培养物中加入氯霉素继续培养若干小时，以便对质粒进行性扩增。
氯霉素可抑制宿主的蛋白质合成，结果阻止了细菌染色体的复制，然而，松弛型质粒仍可继续复制，在若干小时内，其拷贝数持续递增。
这样，像pBR３２２－类的质粒，从经氯霉素处理和未经处理的培养物中提取质粒的产量迥然不同，前者大为增高。
多年来，加入足以完全抑制蛋白质合成的氯霉素μg/ml)已成为标准的操作、用该方法提取的质粒DNA量，对于分子克隆中几乎所有想象到的工作任务。
（二）细菌的收获和裂解细菌的收获可通过离心来进行，而细菌的裂解则可以采用多种方法中的任意一种，这些方法包括用非离子型或离子型去污剂、有机溶剂或碱进行处理及用加热处理等。
选择哪一种方法取决于３个因素：质粒的大小、小肠杆菌菌株及裂解后用于纯化质粒DNA的技术。
尽管针对质粒和宿主的每一种组合分别提出精确的裂解条件不切实际，但仍可据下述一般准则来选择适当方法，以取得满意的结果。
1)大质粒(大于15kb)容易受损，故应采用漫和裂解法从细胞中释放出来。
将细菌悬于蔗糖等渗溶液中，然后用溶菌酶和EDTA进生处理，破坏细胞壁和细胞外膜，再加入SDS一类去污剂溶解球形体。
这种方法最大限度地减小了从具有正压的细菌内部把质粒释放出来所需要的作用力。
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细菌质粒DNA的制备
一、目的要求
掌握平板法分离单菌落、细菌质粒DNA的提取方法（碱裂解法）、菌株的保存和复苏，掌握紫外分光光度法测定DNA含量的方法，掌握DNA电泳方法。
二、基本原理
质粒是一种染色体外的稳定遗传因子，为双链闭合环状DNA分子，具有自主复制和转录能力，可表达他携带的遗传信息。
质粒在细胞内的复制一般分为严紧型和松弛型两种。
前者只在细胞周期的一定阶段进行复制，每个细胞内只含有1或几个拷贝。
后者在整个细胞周期中随时可以复制，在细胞里为多拷贝。
基因工程操作中所用的载体质粒均为松弛型质粒。
所有分离质粒DNA的方法都包括三个基本步骤：培养细菌使质粒扩增；收集和裂解细菌；分离和纯化质粒DNA。
采用溶菌酶可破坏菌体细胞壁（G-菌多无需此步骤）。
在pH 12.0～12.6 碱性环境中，细菌的线性大分子量染色体DNA 变性分开，而共价闭环的质粒DNA 虽然变性但仍处于拓扑缠绕状态。
将pH 调至中性并有高盐存在及低温的条件下，大部分染色体DNA 、大分子量的RNA 和蛋白质在去污剂SDS 的作用下形成沉淀，而质粒DNA 仍然为可溶状态。
通过离心，可除去大部分细胞碎片、染色体DNA 、RNA 及蛋白质，质粒DNA 尚在上清中，然后用酚、氯仿抽提进一步纯化质粒DNA 。
琼脂糖凝胶电泳是分离、鉴定和纯化DNA片段的标准方法之一。
琼脂糖是从海藻中提取出来的一种线状高聚物，将其熔化在所需缓冲液中使成清澈、透明的溶液，然后倒入胶模令其固化。
不同浓度的琼脂糖形成的固体基质具有不同的密度（或孔隙度），因此适宜分离不同大小的DNA片段。
在电场中，DNA分子主要因其分子大小不同而被分离。
在pH 值为8.0～8.3 时，核酸分子碱基几乎不解离，磷酸全部解离，核酸分子带负电，在电泳时向正极移动。
采用适当浓度的凝胶介质作为电泳支持物，在分子筛的作用下，使分子大小和构象不同的核酸分子泳动率出现较大的差异，从而达到分离核酸片段检测其大小的目的。
核酸分子中嵌入荧光染料（如EB ）后，在紫外灯下可观察到核酸片段所在的位置。
三、实验步骤（具体参照试剂盒说明书）
质粒DNA的提取（参考步骤）
1．将5 mL含相应抗生素的LB加入容量为15 mL并通气良好（不盖紧）的试管中，然后接入一单菌落，于37℃下剧烈振摇培养过夜。
2．将1.5 mL培养物倒入微量离心管中，用微量离心机12 000g离心30秒，将剩余培养物贮存于4℃。
3．吸去培养液，使细菌沉淀尽可能干燥。
4．将细菌沉淀重悬于100 μl溶液I（50 mM葡萄糖，25 mM Tris·Cl pH 8.0，10 mM EDTA pH 8.0）中，剧烈振荡。
5．加200 μl新配制的溶液II（0.2 M NaOH，1%SDS）。
盖紧管口，快速颠倒离心管4次，以混合内容物。
不要振荡，将离心管放置于冰上。
6．加150 μl用冰预冷的溶液III（5 M乙酸钾60 mL，冰乙酸11.5 mL，水28.5 mL）。
盖紧管口，将管倒置后温和振荡10秒钟使溶液III在粘稠的细菌裂解物中分散均匀，之后将管置于冰上3—5分钟。
7．用微量离心机以12 000g离心5分钟，将上清转移到另一离心管中。
8．加入RNase H至终浓度，55℃消化30分钟。
9．加等量酚:氯仿，振荡混匀，用微量离心机以12 000g离心2分钟，将上清转移到另一离心管中。
10．可做可不做：加等量氯仿，振荡混匀，用微量离心机以12 000g离心2分钟，将上清转移到另一离心管中。
11．加入1/10体积0.02M乙酸钠，用等体积异丙醇于室温沉淀双链DNA。
振荡混合，用微量离心机以12 000g离心5分钟。
12．弃去上清液，用1mL冰预冷的75%乙醇洗涤，用微量离心机以12 000g离心5分钟。
13．弃去上清液，尽量除尽管内液体。
在空气中使核酸沉淀干燥。
14．将沉淀重新溶解在无菌水或TE溶液中，贮存于-20℃。
琼脂糖凝胶电泳
1.琼脂糖凝胶板的制备
配制1%琼脂糖-TAE（242 g Tris，57.1 ml乙酸，100ml 0.5M EDTA pH 8.0，用时稀释50倍）凝胶液。
待琼脂糖完全溶解并冷却至65℃左右，小心倒入有机玻璃内槽，控制灌胶速度，使胶液缓慢展开，直到在整个有机玻璃板表面形成均匀的胶层。
室温下静置1 h左右，待凝固完全后，将铺胶的有机玻璃内槽放在电泳槽中待用。
2.加样
在电泳槽中注入TAE稀释液，没过整个胶面，拔下加样梳。
向DNA样品中加入1/10体积的加样缓冲液（0.25%溴酚蓝，40%蔗糖水溶液），充分混匀，用微量加样器将DNA样品加入加样孔中。
可在相隔加样孔中加入DNA marker，以估计DNA条带分子量。
3.电泳
加完样品的凝胶板立即通电，进行电泳，电场强度不高于5 V/cm。
当指示剂移动到距离胶板下沿约1-2 cm处，停止电泳。
4.观察
电泳凝胶用EB（溴乙锭）染色（可提前加入琼脂糖凝胶液中），在波长为254 nm的紫外灯下，观察染色后的电泳凝胶。
紫外光激发30秒左右，肉眼可观察到清晰的条带。
在紫外灯下观察时，应戴上防护眼镜或有机玻璃防护面罩，避免眼睛遭受强紫外光损伤。
附注：质粒检测
电泳检测：质粒电泳一般有三条带，分别为质粒的超螺旋、开环、线型三种构型
吸光值检测：采用分光光度计检测260nm 、280nm 波长吸光值，若吸光值260nm/280nm 的比值介于1.7 －1.9 之间，说明质粒质量较好，1.8 为最佳，低于1.8 说明有蛋白质污染，大于 1.8 说明有RNA 污染。