α-淀粉酶的分离提纯

出峰图
注意！！！
–N,N’-亚甲双丙烯酰胺为神经毒性物质，可经 皮肤直接吸收，使用时应避免其直接接触皮 肤，必要时应戴手套。但其凝固后就变成无 毒物质。
敬请各位老师同学指导
一.硫酸铵盐析
硫酸铵沉淀α-淀粉酶过夜 α
离心收集沉淀、称重
SDS-PAGE 酶活性测定
配制凝胶、聚合
电泳
结果分 析
染色及脱色 (除去固定液 以及洗脱液)
凝 胶 电 泳
凝胶电泳是以各种具有网状结构的多孔凝 胶作为支持体的电泳技术。由于凝胶电泳同时 具有电泳和分子筛的双重作用，故具有很高的 分辨率。 凝胶电泳所采用的支持体通常是聚丙烯酰 聚丙烯酰 胺凝胶（PAGE） 胺凝胶（PAGE）。 在制备PAGE时，加入1%-2%的十二烷基硫酸 钠（SDS），制成SDS-聚丙烯酰胺凝胶（SDSSDSSDS 聚丙烯酰胺凝胶（SDSPAGE） PAGE），主要用于测定蛋白质的分子质量。
α- 淀 粉 酶 的 分 离 方 法 的 比 较 α-淀粉酶在食品工业上有着广泛的用途。目前工 淀粉酶在食品工业上有着广泛的用途。 淀粉酶在食品工业上有着广泛的用途 业上从发酵液中提取α淀粉酶的方法多 淀粉酶的方法多。 业上从发酵液中提取 淀粉酶的方法多。 主要有直接用硫酸铵沉淀和采用絮凝-超滤 超滤-乙醇 主要有直接用硫酸铵沉淀和采用絮凝 超滤 乙醇 沉淀方法 。 种方法食品工业上不能使用。 第一 种方法食品工业上不能使用。 第二种方法要求发酵液澄清度好， 第二种方法要求发酵液澄清度好，否则超滤膜堵 此外超滤法浓缩酶液是有限度的， 塞， 此外超滤法浓缩酶液是有限度的，沉淀仍消 耗大量的乙醇同时酶的回收率也较低一般在55%左 耗大量的乙醇同时酶的回收率也较低一般在 左 右。 为了提高产品的活性,酶活性的回收和减少乙醇的 为了提高产品的活性 酶活性的回收和减少乙醇的 用量已有相关报道用大孔吸附树脂吸附的方法分 离纯化α- 淀粉酶 。在此进一步改进了洗脱方式， 离纯化 在此进一步改进了洗脱方式， 使其更便于工业化生产， 使其更便于工业化生产，使用离子交换的方法进 一步纯化α- 淀粉酶。 淀粉酶。 一步纯化
α-淀粉酶的分离提纯
报 告 人：X X 课题名称： 课题名称：生 物 分 析 技 术 学 专 号：1200730455 业：有 机 化 学
目的意义
目前市售α-淀粉酶大多数是粗酶，即还含有除α-淀粉酶外的其它蛋白质。 沉淀分离是通过改变某些条件，使溶液中某种溶质的溶解度降低，从而从 溶液中沉淀析出，达到与其它溶质分离的目的。沉淀的方法很多，如，盐 析沉淀、等电点沉淀、有机溶剂沉淀、复合沉淀、选择性变性沉淀等。 其中，使用最广泛的是盐析沉淀法。 在某一浓度的盐溶液中，不同的蛋 。 白质和酶的溶解度各不相同，可达到彼此分离的目的。 通过硫酸铵盐析法能够将粗酶中的杂蛋白与α-淀粉酶分离开来，从而达 到纯化α-淀粉酶的目的。 • 通过聚丙烯酰胺凝胶电泳法（SDS-PAGE），根据粗酶中各种蛋白在电泳中 的分子量大小差异显示α-淀粉酶的纯度。
二.吸附树脂法 吸附树脂法
发酵液 CaCl2加水 溶解 搅拌 加入 絮凝剂 凝絮发 生后 压滤
收集滤液 40% 40%的乙 醇过滤 收集滤液
源自文库
滤液中加入 吸附树脂
过滤、弃 去滤液
收集吸附 树脂
5%乙醇 沉淀 离 心 分 离
无水乙 醇洗脱 成品 收集沉淀
离子交换法
配制磷酸缓冲液
10ml pH为6.5 0.5mol/L pH为6.5 0.005mol/L pH为6.5 0.2mol/L 称取树脂吸附 淀粉酶1g 2mL/min 2mL/min 处理好 反复洗涤 洗脱酶液 洗脱酶液 的DEDE-32 32 得洗脱峰1，收 1 得洗脱峰2，收 的 集洗脱液 转入烧杯，过夜 集洗脱液 流 速 制3cm~4cm 的层析柱 2ml/min 2ml/min 柱 2mL/min的流速平衡2h 测酶活性 测酶活性