鸡胚绒毛尿囊膜模型的建立

各位对如何能够不戳穿尿囊膜将PBS溶液注入卵壳膜和尿囊膜之间有何办法,请指教.
hanweina
鸡胚绒毛尿囊膜试验方法
无壳法和开窗法到底哪个更好?????
sherryshuyu
两种方法我都做过，我个人觉得可能还是开窗法比较好。无壳法做了以后，如果培养条件不是很好，很容易污染，开窗法比起无壳法来说比较不容易污染，而且操作也比较简单，我个人建议采用开窗法。
view wrote:
请详细讲解一下鸡胚绒毛尿囊膜试验方法/步骤。研究一种药物抗鸡胚绒毛尿囊膜血管生成如何分组？需要多少经费？
详细步骤：
1。取10－13日龄鸡胚，于检卵灯下标记气室及胎位，并在胎位附近无大血管处画一记号。
2。用碘酒，乙醇消毒气室顶部和记号处，然后在气室顶部钻一小孔，同时用磨卵器在记号处将卵壳磨一个和纵轴平行的裂痕，勿伤及
l 取鸡胚，于检卵灯下标记气室及胎位，并在胎位附近无大血管处画一记号。
l 用碘酒，乙醇消毒气室顶部和记号处，然后在气室顶部钻一小孔，同时用小钢锯在记号处将卵壳磨一个和纵轴平行的裂痕，勿伤及壳膜。
l 将卵平放，轻轻将裂痕处卵壳去掉，勿伤及壳膜，于壳膜上刺破一小缝但不伤及下面的绒毛尿囊膜，滴加无菌生理盐水一滴于壳膜上。
总之,大碗牛人做的实验过程也可能很多问题没弄清,这不一定妨碍他作出结果,但我等做之前一定要多查文献,多问为什么,很多问题就迎刃而解了.
ygqdxy
zzyty
Marie_423
关于鸡胚尿囊膜（CAM）模型已经有很多论述，但是对于我们刚刚接触此模型时遇到很多具体的细节问题还真没找答案，特请教各位：
5．揭开人工气室上的壳膜，暴露该处的绒毛尿囊膜，滴加0.2-0.5ml病毒悬液于绒毛尿囊膜上，用无菌胶布封口。将鸡胚横卧，于37度孵育，不能翻动，以免人工气室移位。
6．4－5天后取出收获。用碘酒，乙醇消毒接种部位及四周，撕去封闭处卵壳，用无菌镊子扩大开口处，轻轻夹起绒毛尿囊膜用无菌剪刀剪下接种面及周围的膜。置于生理盐水平皿内，观察白色斑点或做其它检测。
尽管血管生成的体内动物模型研究更为接近人体的生理状态，使研究结果更为可靠，但仍有一些不足之处，如操作繁琐，耗时过长；另外，在该类模型中，血管生成物必须植入眼角膜囊、颊囊、或绒毛尿膜囊使之诱导血管生成，难免产生人为因素诱导的血管生成；血管生成促进因子、抑制因子等需要从多聚载体中释放出来；操作方法和测定其结果的技术较为复杂
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依照文献，将（中速定性滤纸）载体加到鸡胚（大头端）下方CAM的两根大血管之间,窗口下方一层透明的并有丰富血管的是鸡胚绒毛膜和小部分尿囊膜,我不否认以上方法可能可以做出结果.鸡胚绒毛尿囊膜准确是可参看北大出的动物胚胎发育学(记不大清了):
laofuzi1977
我也作过CAM模型，但是前两个问题不太清楚怎么回事，但是第三个问题我有一个方法你可以试试，卵壳膜和尿囊膜之间可以注射无菌PBS溶液，靠溶液的重力作用将其分离，我们实验室就是采取这种方法分离的，效果还可以你可以试试。
xiangzi7692002
用生理盐水也可以,最主要的还是靠自己的手法,做多了就熟练的
CAM 实验方案
? 材料准备：
l 材料：孵化箱、检卵灯、高压消毒锅、小钢锯、小剪刀、小镊子（眼科用）、针头、微量加样器、种鸡蛋、数码相机、切片机、显微镜等
l 试剂：酒精棉球、碘酒、新洁尔灭、明胶海绵、甲基纤维素、bFGF、甲醛、石蜡、甲苯胺蓝等
? 实验操作：
鸡胚准备： 新鲜来航种鸡蛋80只，于（37.5 0C～38.5 0C）、
加样的滤纸发生漂移:鸡胚绒毛尿囊膜包括鸡胚绒毛膜,鸡胚尿囊膜两部分,是在发育过程中,不断动态变化,但有个相对稳定时期,要看你的目的了.你可参看北大出的动物胚胎发育学(记不大清了),有个图示,一看就清楚了.加对了地方,漂移会很少的.这当然和你划定的开窗位置有关,也就是你的目的有关.先把这弄清楚,就不会有以上问题了.
取鸡胚，于检卵灯下标记气室及胎位，确定拟加药位置,消毒气室顶部，然后在气室顶部钻一小孔。将卵平放，轻轻将拟加药位置处卵壳去掉，勿伤及壳膜，于壳膜上刺破一小缝但不伤及下面的绒毛尿囊膜，滴加无菌生理盐水一滴于壳膜上。用橡皮乳头从气室端小孔处缓缓将气室内空气吸去，造成气室负压，此时可见生理盐水下沉，绒毛尿囊膜下陷，壳膜与尿囊膜之间形成人工气室。用透明胶带将封好假气室封好，继续孵化。
(5)CAM血管生成实验模型的用途：CAM血管生成模型用于血管生成的研究，可取得两方面结果：①检测评价接种物刺激CAM血管增生的血管生成作用，用于分析研究血管生成促进因子、抑制因子的活性和作用的检测，如肿瘤血管生成的研究等；②对接种物，如肿瘤组织、自身的血管生成进行研究，用于分析不同组织的血管生成活性和作用，如肿瘤组织有引发新生血管生成的作用，但肺癌与其他癌组织的血管生成活性和作用可能不同。
选择纤维素滤膜为载体,用打孔器制成直径5ｍｍ的小圆片,蒸馏水浸泡后灭菌干燥备用。轻轻撕掉透明胶带纸,将载体置于正对观察窗的ＣＡＭ表面的血管,然后将药物分别滴加于载体上,加用透明胶带纸封贴,继续孵育。
在这里,有文献说透明胶带是为了便与观察,但是,谁能透过透明胶带看见东西?不过是和外界隔开,更符合生理状态吧了.透明胶带不透气,和蛋壳不同,扰乱了生理状态,不能呼吸,当然会有水珠,换个透气胶布就行了.
最好还是用明胶海绵做载体.
司徒镇强主编的《细胞培养》p56页
Leica图像分析系统观察、拍摄实验区域（以药物--甲基纤维素薄片为中心范围约1cm2），明确可辨的血管，测定、计算其面积。进行统计学分析。
处理因子可用明胶海绵，也可用甲基纤维素
鸡胚绒毛尿囊膜血管形成(CAM)试验方法1)．鸡胚准备和接种组织：选择北京白鸡种蛋，洗净，用l：1000苯扎溴铵(新洁尔灭)液浸泡3分钟，置37．8土0．5℃培养箱中孵育。鸡胚发育第7天，蛋壳消毒后，标记制作2cmX3cm左右观察窗。接种组织视研究目的而定，一定要在接种当日取材，充分清洗除去血污和粘液，再剪成1～2mm组织小块。
鸡胚卵用o．1％新洁尔灭消毒，在37．6℃(上下浮动 o．2℃），60％湿度的隔水式恒温孵箱内孵育c每日翻动2次，孵育第7天时(满24h为1天)，在绒毛尿囊膜体表投影距胚头1cm处上划定开窗位置。无菌条件下，磨切暴露绒毛尿囊膜，制出假气室。透明胶带封闭窗口。鸡胚开窗后24h，甲基纤维素盘放人假气室(避开大血管)，对照组盘中封闭假气室，继续孵育。每日加样一次，第十二天取材。假气室注入丙酮甲醇混合液固定20分钟后，取假气室一侧的蛋壳后固定20分钟，剥离CAM膜．铺在滤纸上，阴干保存。
相对湿度为60％～80％的孵化箱中孵化、每日照蛋两次，第三天无血管鸡胚抛弃。
开 窗 ： 鸡胚发育3天，选取发育良好的鸡胚，无菌条件下操作在外壳上开10mm×10mm大小的开口，暴露尿囊膜具体操作如下：
用透明胶带开窗后就不担心会感染吗?透气胶布可以灭菌的.更重要的是,鸡胚发育中,免疫尚未建立,一般不会有严重的感染炎症反应,真要有的话,可以剔除,所以要检查.水珠不会影响血管的生长,不管他也可,但可能与滤纸移位有一定关
系.当然,滤纸移位主要原因是鸡胚绒毛尿囊膜的生长.
其实很多文献做的是鸡胚绒毛膜,不是鸡胚绒毛尿囊膜,也是没有把概念弄清楚.照搬Auerbach R,Kubal L etal.As imple procedure for the long term cultivation of chicken embryos.Dev Biol, 1974;11∶391等,还有军事医科院的文献而已
丁香园
wangyhcrong
孵蛋第d,用尖针在蛋气室表面扎1小洞, 使鸡胚的尿囊绒毛膜与鸡蛋的内壳膜分开,便于后续操作。照蛋灯下寻找胚头,划定开窗位置,消毒蛋壳表面,在蛋壳表面划刻出凹痕,轻揭凹陷处蛋皮,轻轻撕掉内壳膜,此时该处CAM下陷,形成假气室(区别于自身的气室)。用透明胶带纸封贴假气室，制备假气室时切勿损伤CAM，否则剔除。
壳膜。
3．将卵平放，轻轻将裂痕处卵壳去掉，勿伤及壳膜，于壳膜上刺破一小缝但不伤及下面的绒毛尿囊膜，滴加无菌生理盐水一滴于壳膜上。
4．用橡皮乳头从气室端小孔处缓缓将气室内空气吸去，造成气室负压，此时可见生理盐水下沉，绒毛尿囊膜下陷，壳膜与尿囊膜之间形成人工气室。
如果你要是做药物对鸡胚绒毛尿囊膜血管生成影响实验，可以在第五步把滴加病毒悬液改为滴加药物悬液。
我认为分组应该分两组：实验组和对照组，实验组要药物刺激，对照组用无菌生理盐水。实验组中为了观察药物不同浓度大小对绒毛尿囊膜血管生成的影响，可以从低到高分为几个不同浓度组。（一家之言，仅供参考）。
前4步可以参考，后面的要将加病毒改成加药。加药时一般用5mm直径膜做载体。第一步用的鸡胚的日龄也只是参考，可以小一些。最后结果可以用软件分析血管的面积。 分析血管面积我用的是形态学分析软件。
鸡胚发育四五天时应该就能看到胚头两侧的两条卵黄静脉,理论上两条卵黄静脉下方血管生长较少,我们实验目的是看药物对血管生长的促进作用,所以选择在此位置加载体.
laofuzi1977的方法"卵壳膜和尿囊膜之间可以注射无菌PBS溶液，靠溶液的重力作用将其分离" ,不知道为什么卵壳膜和尿囊膜贴得很紧,无论我们怎样试图轻轻地将注射器插进卵壳膜和尿囊膜之间,都会直接戳穿尿囊膜 ,也就没办法继续进行加药那一步. 所以,至今我们还没有突破,实验暂停.
(4)CAM的血管生成表现：组织接种24小时后
，CAM血管开始向接种组织生长，随培养时间的延长，血管数目及直径均明显增加；第2天，新细小血管直接趋向组织；第3天，新生血管形成以接种组织为中心，10～20条放射状血管网；尔后，CAM血管继续明显增加。非接种部位与接种部位比较，CAM血管数目少，大血管与小血管呈脉样均匀分布；而接种部位的CAM血管在接种组织周围弥散样增加，以组织为中心向周围呈放射状分布，在首先与组织发生联系的区域CAM血管更多。第4天，可见新生细小CAM血管生长形成中、粗血管，并在中、粗血管继续分支出细小血管，形成新的血管网。CAM血管管腔结构清晰，可区别动、静脉。