流感病毒的分离技术操作规范
犬流感病毒的分离鉴定及部分基因序列分析
犬流感病毒的分离鉴定及部分基因序列分析犬流感病毒（Canine Influenza Virus，CIV）是一种由流感病毒引起的狗类感染疾病，主要包括CIV-H3N8和CIV-H3N2两种亚型。
近年来，犬流感病毒感染在全球范围内呈逐渐增加的趋势，给犬只健康和养殖业生产带来了严重的危害。
对犬流感病毒的分离鉴定及部分基因序列分析具有重要意义。
一、病毒分离鉴定病毒分离鉴定是对犬流感病毒进行病原学研究的基础，主要包括病毒的分离、鉴定和鉴定结果的确认三个步骤。
病毒的分离是首要任务，通常采用病毒感染犬只的呼吸道分泌物、血清或组织样本进行病毒的分离培养；病毒鉴定则主要通过电镜观察病毒颗粒的形态、免疫荧光技术检测病毒抗原等方法进行；鉴定结果的确认则可以通过PCR、RT-PCR和序列分析等分子生物学手段进行。
在实际操作中，病毒的分离鉴定需要在生物安全实验室中进行，避免病毒的传播和扩散。
二、基因序列分析基因序列分析是对犬流感病毒基因组进行序列测定和分析的过程，主要包括基因组测序、序列比对和变异分析三个步骤。
通过PCR或RT-PCR技术对病毒样本进行基因组的扩增和测序，获取病毒基因序列信息；然后，通过序列比对将测定到的基因序列与已知的犬流感病毒参考序列进行比对，找出其相同点和变异位点；通过变异分析对病毒亚型、毒株的演化关系进行推断和分析。
通过基因序列分析，可以更加深入地了解犬流感病毒的遗传变异和演化规律，为疫苗研发和防控策略的制定提供重要参考。
针对犬流感病毒的部分基因序列分析，以下以CIV-H3N8亚型为例进行分析。
1. 基因组测序从临床样本中提取病毒RNA，利用RT-PCR技术对病毒基因组进行扩增和测序。
通过比对已知的CIV-H3N8基因组序列，确定扩增的基因片段在全基因组中的位置，并获取完整的基因序列信息。
2. 序列比对和变异分析将测定到的CIV-H3N8基因序列与已知的CIV-H3N8参考序列进行比对，找出其相同点和变异位点。
流感病毒分离培养SOP
1. 范围适用于实验室所有技术人员进行流感病毒的MDCK细胞分离和鉴定。
2. MDCK细胞培养程序2.1 生物安全要求MDCK细胞培养实验室生物安全级别：BSL-2 ，所有操作必须在BSL-2实验室的生物安全柜里进行。
2.2 材料2.2.1 生长成片的MDCK细胞2.2.2 无菌的T25细胞培养瓶2.2.3 D-MEM培养液（含有L-谷氨酰胺）2.2.4 青、链霉素母液（10000 U/mL青霉素G；10000µg/mL硫酸链霉素），分装后保存于-20℃2.2.5 HEPES缓冲液，1M母液2.2.6 胎牛血清2.2.7 EDTA-胰酶（0.05%胰酶，0.53mM EDTA-4Na），分装后保存于-20℃2.2.8 7.5%牛血清白蛋白组分V2.2.9 1mL、10mL无菌移液管2.2.10 70％～75％的酒精注意事项：经常检查试剂使用的有效期。
2.3 实验步骤这里以T75细胞瓶的单层细胞培养为例，叙述MDCK细胞的培养程序。
如果细胞瓶的规格有变，MDCK细胞悬液的量必须做相应的调整。
2.3.1 D-MEM培养液的准备500mL D-MEM液中加入：a）青、链霉素母液5mL（终浓度达：100U/mL青霉素；100µg/mL链霉素）。
b）7.5%牛血清白蛋白组分Ⅴ12.5mL（终浓度：0.2%）。
c）HEPES缓冲液12.5mL（终浓度：25mM）。
2.3.2 细胞生长液的准备胎牛血清10mL加到90mL的上述（1）的液体中，使胎牛血清的终浓度为10%。
2.3.3 首先将细胞培养瓶中的培养液弃去，加入5mL在37℃水浴中预热的EDTA-胰酶。
2.3.4 温和地摇动细胞瓶1min，使EDTA-胰酶均匀分布在整个细胞薄层。
然后用移液管吸去EDTA胰酶。
2.3.5 重新加入5mL在37℃水浴中预热的EDTA-胰酶重复上述步骤。
2.3.6 加入1mLEDTA-胰酶使其均匀分布在整个细胞薄层，37℃孵育细胞瓶直至细胞从塑料细胞瓶的表面分离（约5～10min）。
流感病毒的分离培养
适大小的细胞培养瓶和细胞培养板来用做 病毒分离 • 2、胰酶（牛胰腺来源Ⅷ型） • 3、HEPES缓冲液，1M母液 • 4、D-MEM培养基，Hank's液 • 5、青、链霉素母液（10000U/mL 青霉素G； 10000µg/mL硫酸链霉素
资料仅供参考,不当之处，请联系改正。
• (5)将针头弃于合适的生物安全装置中 • (6)用消毒过的医用胶布封口 • (7)33～35oC 温箱培养鸡胚2～3 天。临床
采样标本通常培养3天，病毒传代通常培养 2天。
• 注意：鸡胚进行病毒分离培养时，每天检 查鸡胚生长情况，24小时内死亡的鸡胚， 认为是非特异死亡应弃去
100U/mL青霉素；100µg/mL链霉素） • ②牛血清白蛋白组分Ⅴ 12.5mL（终浓度：
0.2%） • ③HEPES缓冲液 12.5mL（终浓度：
25mM）
资料仅供参考,不当之处，请联系改正。
• （2）病毒生长液
• 每500mL细胞维持液中加入0.5mL的TPCK胰酶（母液浓度为2mg/mL）使TPCK-胰酶 的终浓度为2µg/mL。2．流感病毒MDCK细 胞分离步骤：
二、流感病毒分离之鸡胚培养法 资料仅供参考,不当之处，请联系改正。
• （一）、检视标记鸡胚 • （1）用照蛋灯检视鸡胚，判断鸡胚状态 • 血管：活胚血管清晰；死胚模糊，成淤血带
或淤血块
• 胎动：活胚有明显的自然运动，死胚无胎动 • 绒毛尿囊膜发育界限：密布血管的绒毛尿囊
膜与鸡胚
• 胎的另一面形成明显的界限 • （2）标记出鸡胚的气室与尿囊的界限 • （3）如果鸡胚是死胚、没有受精、有裂痕、发
资料仅供参考,不当之处，请联系改正。
微生物实验十 流感病毒的分离培养 PPT课件
• （二）、接种样本 • 将标记好的鸡胚的气室朝上放置在照蛋器上。 • （2）用75％酒精消毒鸡胚，用无菌镊子在气室 端钻孔，再无菌眼科剪剪开10x6mm窗口。 • (3)用注射器吸800µl标本。 • (4)从窗口中滴入无菌的液体石蜡，轻轻晃动鸡胚， 让液体石蜡在鸡胚壳膜内层铺开，此时在照蛋灯 下即可清楚的看到鸡胚胎的位置。将注射针头刺 入胚胎的鄂下胸前，用针头轻轻拨动下颚及腿， 当进入羊膜腔时，能看到鸡胚随着针头的拨动而 动，即可注射200µl标本。将针头退出至½ 寸，将 另外200µl标本注入鸡胚尿囊腔。每个样本接种2全装置中 • (6)用消毒过的医用胶布封口 • (7)33～35oC 温箱培养鸡胚2～3 天。临床 采样标本通常培养3天，病毒传代通常培养 2天。 • 注意：鸡胚进行病毒分离培养时，每天检 查鸡胚生长情况，24小时内死亡的鸡胚， 认为是非特异死亡应弃去
+++”：大部分红细胞凝集，在管底铺成薄膜状，但尚有少数红细胞不
二、流感病毒分离之鸡胚培养法
• （一）、检视标记鸡胚 • （1）用照蛋灯检视鸡胚，判断鸡胚状态 • 血管：活胚血管清晰；死胚模糊，成淤血带 或淤血块 • 胎动：活胚有明显的自然运动，死胚无胎动 • 绒毛尿囊膜发育界限：密布血管的绒毛尿囊 膜与鸡胚 • 胎的另一面形成明显的界限 • （2）标记出鸡胚的气室与尿囊的界限 • （3）如果鸡胚是死胚、没有受精、有裂痕、发 育不全、或表面有好多渗水孔，应弃掉
• • • • •
6、牛血清白蛋白组分Ⅴ，7.5%溶液 7、临床样品0.5mL 8、1mL无菌移液管 9、10mL无菌移液管 10、15mL无菌离心管
• • • • •
（三）实验步骤 1、准备病毒生长液 （1）细胞维持液准备 500mL D-MEM液中加入 ①青、链霉素母液 5mL（终浓度达： 100U/mL青霉素；100µg/mL链霉素） • ②牛血清白蛋白组分Ⅴ 12.5mL（终浓度： 0.2%） • ③HEPES缓冲液 12.5mL（终浓度： 25mM）
甲型流感病毒检测方法及技术方案H1N1
甲型（H1N1）流感病毒实验室检测技术方案(试行)广州健仑生物科技有限公司整理本方案旨在为全国流感监测网络实验室提供甲型H1N1流感病毒实验室检测技术方案，不用作商业活动或赢利目的。
一、标本的采集种类和要求1、推荐采集的呼吸道标本种类疾病发病后应尽快采集如下标本：鼻拭子、咽拭子、鼻腔吸取物、鼻腔冲洗液。
气管插管的病人也应收集气管吸取物。
标本应置于无菌病毒采样液，并立即用冰块或冰排保存或置于4 ℃（冰箱），并马上送至实验室。
（临床样品采集人员及实验室检测人员的感染控制指导请见相关文件。
）采样同时填写疑似人感染甲型H1N1感染病例标本采样单。
（附表1）2、拭子的选择标本应使用头部为合成纤维的拭子（例如，聚酯纤维），用铝或塑料做柄。
不推荐棉拭子和木柄。
标本采集管应包含3毫升病毒采样液（含有蛋白质稳定剂，阻止细菌和真菌生长的抗生素，缓冲液）3、临床标本储存要求保存在4℃（不能超过4天）或者-70℃或-70℃以下。
有条件的实验室均应保存在-70℃或-70℃以下。
不应保存在-20℃。
4、标本的分装处理标本送至实验室后，立即进行处理，避免反复冻融。
将原始标本分为三份，一份用于核酸检测，一份用于病毒分离，一份保存待复核。
5、标本的运输疑似人感染甲型H1N1感染病例列为 A类，用UN2814包装运输。
填写疑似人感染甲型H1N1感染病例标本送检单（附表2）。
二、核酸检测基于PCR原理的核酸检测方法是一种快速有效的诊断方法，在突发传染病应急工作中发挥了巨大作用。
1、基于real-time RT-PCR的方法检测新的甲型H1N1流感病毒（引物和探针序列为美国CDC设计）：4月29日WHO网站上公布了美国CDC设计的针对此次甲型H1N1流感病毒的real-time RT-PCR引物和探针，此实验用于检测疑似甲型H1N1流感病例的呼吸道样本, 因此，用此real-time RT-PCR的方法，建议首先筛选甲型流感病毒并排除季节性流感病毒和H5N1禽流感病毒。
流感病毒分离鉴定
2、血细胞凝集抑制试验
按表加入材料和试剂
试管
1 待测 2 待测 3 血清对照 4 抗原对照 5 红细胞对照
生理盐水 －
－
0.2
1：5血清 0.2 0.2
0.2
4u病毒液 0.2 0.2
－
0.5％鸡红 0.2 0.2
0.2
细胞
0.2
0.4
－
－
0.2
－
0.2
0.2
结果观察 先观察3支对照管，如抗原对照管出现完全凝集，血清对照和红 细胞对照不发生凝集，再观察试验管。 血凝抑制效价：完全抑制红细胞凝集的血清最高稀释度，即该 血清的抑制效价。 鉴定病毒时，效价应与原免疫血清效价相等或相似，血凝抑制 试验亦可用已知病毒抗原，测定病人血清抗体以进行血清学诊 断，恢复期比初期抗体效价增高4倍以上才有小镊子在无大血管处 撕破卵膜,以无菌毛细管吸取尿囊液,放入无菌试管 中。
(2)取尿囊液0．1mL,作1：10稀释。
(3)取10支小试管，按给各管加入生理盐水0.2mL。
(4)取1：10稀释的尿囊液0．2mL，加人第1个试管 中，混匀后，再吸出0．2mL加入第2个试管中； 混匀后，从第2个试管吸出0．2mL加入第3个试 管……依次作倍比稀释至第九管，混匀后自第9 个试管中取出0．2mL弃掉。这样各管液体量均 为0．2mL，从第1-9个试管的尿囊液稀释度为 1:20，1:40，…，1:5120，第10个试管为生理 盐水对照管。
边缘不整齐。
“+++”：大部分红细胞凝集，在管底铺成薄膜状，但尚有少数红细胞不
凝，在管底中心形成小红点。
“++”：约有半数红细胞凝集，在管底铺成薄膜，面积较小，不
流感病毒分离培养SOP
1. 范围适用于实验室所有技术人员进行流感病毒的MDCK细胞分离和鉴定。
2. MDCK细胞培养程序2.1 生物安全要求MDCK细胞培养实验室生物安全级别：BSL-2 ，所有操作必须在BSL-2实验室的生物安全柜里进行。
2.2 材料2.2.1 生长成片的MDCK细胞2.2.2 无菌的T25细胞培养瓶2.2.3 D-MEM培养液（含有L-谷氨酰胺）2.2.4 青、链霉素母液（10000 U/mL青霉素G；10000µg/mL硫酸链霉素），分装后保存于-20℃2.2.5 HEPES缓冲液，1M母液2.2.6 胎牛血清2.2.7 EDTA-胰酶（0.05%胰酶，0.53mM EDTA-4Na），分装后保存于-20℃2.2.8 7.5%牛血清白蛋白组分V2.2.9 1mL、10mL无菌移液管2.2.10 70％～75％的酒精注意事项：经常检查试剂使用的有效期。
2.3 实验步骤这里以T75细胞瓶的单层细胞培养为例，叙述MDCK细胞的培养程序。
如果细胞瓶的规格有变，MDCK细胞悬液的量必须做相应的调整。
2.3.1 D-MEM培养液的准备500mL D-MEM液中加入：a）青、链霉素母液5mL（终浓度达：100U/mL青霉素；100µg/mL链霉素）。
b）7.5%牛血清白蛋白组分Ⅴ12.5mL（终浓度：0.2%）。
c）HEPES缓冲液12.5mL（终浓度：25mM）。
2.3.2 细胞生长液的准备胎牛血清10mL加到90mL的上述（1）的液体中，使胎牛血清的终浓度为10%。
2.3.3 首先将细胞培养瓶中的培养液弃去，加入5mL在37℃水浴中预热的EDTA-胰酶。
2.3.4 温和地摇动细胞瓶1min，使EDTA-胰酶均匀分布在整个细胞薄层。
然后用移液管吸去EDTA胰酶。
2.3.5 重新加入5mL在37℃水浴中预热的EDTA-胰酶重复上述步骤。
2.3.6 加入1mLEDTA-胰酶使其均匀分布在整个细胞薄层，37℃孵育细胞瓶直至细胞从塑料细胞瓶的表面分离（约5～10min）。
禽流感病毒的分离与鉴定技术
禽流感病毒的分离与鉴定技术孙建宏,刘景利,张从禄①（中国农业科学院哈尔滨兽医研究所，黑龙江哈尔滨150001）①摘要：禽流感病毒的诊断一般是通过鸡胚分离病毒，检测其血凝活性，并应用琼脂扩散试验或其他试验确定其是否为禽流感病毒，再进一步进行亚型鉴定、致病力测定。
如果是H5或H7亚型，还应采用PCR等方法对血凝素裂解位点的氨基酸序列进行测定。
①关键词:流感病毒;分离;鉴定①禽流感（Avianinfluenza，AI）由正黏病毒科A型流感病毒属的流感病毒引起。
该病毒的血清型分为15个HA亚型和9个NA亚型。
禽流感病毒可感染各种家禽和野禽，但多数呈亚临床感染。
一些H5和H7亚型可引起高致病性禽流感，可使鸡群100%死亡。
高致病性禽流感因其传播快、危害大，有的血清型可感染人，世界动物卫生组织（OIE）将其列为A类动物疾病，我国将其列为一类动物疫病。
①禽流感病毒的诊断可以根据临床症状、剖检变化做出初步诊断，进一步确诊需进行实验室检测。
目前一般是通过病毒分离和血清学试验检测病毒或是检测感染鸡的抗体进行鉴定。
近年来，随着分子生物学技术的发展，RT-PCR方法日臻成熟，也逐渐成为一种常用的诊断技术。
文章对这些禽流感的诊断技术分别做一些介绍。
①1禽流感病毒的分离①样本可采集死禽样本或活禽样本。
死禽样本一般采集肠内容物或泄殖腔拭子、鼻拭子、咽喉拭子以及内脏组织（气管、肺、气囊、肠、脾脏、肾、脑、肝脏和心脏等）；活禽样本可采集气管拭子、泄殖腔拭子。
由于采集棉拭子时幼禽容易受伤，所以还可取粪便。
①采集的拭子放入1.0mLPBS（pH7.0～7.4，含抗生素）的离心管中，静止作用30min。
对于泄殖腔拭子和粪便，用过滤器过滤除菌，上清液作为样本。
内脏样本应无菌取样，放于灭菌的玻璃研磨器，用PBS配成100g/L的悬液，加入1/10体积的抗生素，将处理过的样本移至离心管内，3000r/min离心10min，取上清液接种。
①采集或处理的样本在2℃～8℃条件下保存应不超过24h；如果需长期保存，需放置-70℃条件，但应避免反复冻融（最多冻融3次）。
标准操作规程（SOP）——蔗糖密度梯度离心纯化流感病毒
标准操作规程（SOP）——一、目的流感病毒的浓缩和纯化方式可以分为物理和化学的方法。
如：超速离心法，酸沉淀法，红细胞吸附-释放法，蒸馏水透析法及聚乙二醇浓缩法等。
其中超速离心法最为常用并且纯度较高。
本SOP明确流感病毒蔗糖密度梯度离心纯化的标准操作方法，保证了实验结果的职能却可靠。
二、范围适用于中国国家流感中心的所有技术人员进行蔗糖密度梯度离心纯化流感病毒。
三、程序（一）生物安全要求H5、H7亚型高致病性禽流感病毒及H2N2亚型流感病毒的操作需要在BSL-3级实验室中进行。
其余流感病毒的操作需要在BSL-2级实验室中进行。
操作人员的生物安全防护要求详见流感中心“生物安全个人防护SOP”（二）材料1．病毒液2．PBS（100mmol/L pH7.2）液3．30%和60%蔗糖溶液4．耗材（注射器，离心管，吸管，实验滤纸）（三）实验步骤1．将待纯化的流感病毒种子株接种鸡胚或者MDCK细胞，收获病毒尿囊液。
具体接种方法参见“流感病毒的鸡胚分离方法SOP”和“MDCK细胞分离流感病毒SOP”。
2．将流感病毒收获的鸡胚尿囊液使用实验滤纸粗滤，以去除蛋壳或者其它沉淀物。
MDCK细胞培养的病毒收获液可以省略此步骤。
3．收集过滤液，使用SIGMA3K18 高速离心及2000rpm离心20min，去沉渣。
4．将上清使用OptimaTM L-80XP 超速离心机30000rpm的转速离心1h，去上清。
加入100mmol/L pH7.2的PBS液数滴浸泡沉淀，置4℃冰箱过夜。
5．制备蔗糖梯度管，用10mL吸管加5mL的60%的蔗糖溶液于管底，在其上小心加入10mL的30%的蔗糖溶液。
在其上缓慢加入20mL病毒悬液。
6．使用OptimaTM L-80XP 超速离心机20000rpm的转速离心1.5h，取出离心管。
使用注射器小心吸取位于30%和60%之间的靠近管底的病毒条带。
7．于所收获的液体加入5倍体积的PBS液，混匀后30000rpm的转速离心1h，去上清。
4 流感病毒标本采集、运输、分离检测及注意事项
在采样管上用油性记号笔做好标记用塑料袋密封。同时填 写“流感/人禽流感监测病例标本原始登记表”，用另一 塑料袋密封；
将装标本的密封袋放入专用运输箱内，放入冰排，然后以 柔软物质填充，内衬具吸水和缓冲能力的材料。同一患者 2份以上的密封标本，可以放在同一个塑料袋内再次做密 封。所有容器必须有生物危险标识。
感病毒对热很敏感 • 标本管标识明确：医院名称，标本号，患者姓名，性别，
采样日期 • 标本采集后尽量在24小时内送到实验室进行病毒分离。
24小时内未能进行病毒分离的标本应放-70 ℃或以下
血清学标本注意事项
• 血清学最好采集急性期和恢复期的双份血清塑料管里， 拧紧；
膜与鸡胚胎的另一面形成明显的界限 标记出鸡胚的气室与尿囊的界限、胚胎头部
的位置 如果鸡胚是死胚、没有受精、有裂痕、发育
不全、或表面有好多渗水孔，应弃掉
流感病毒操作要求生物安全规程
禁止在同一实验室，同一时间处理接种未知临床 标本和已知标准病毒
禁止在同一实验室，同一时间处理接种采自不同 动物的标本
国家流感中心 张烨
标本种类
临床标本
鼻拭子、咽拭子、鼻咽吸取物、漱口液等
血清标本
病人的急性期和恢复期血清双份血清
临床样本的选择
采样对象：流感样病例（没有服用过抗病毒药物 ）、人禽流感待 查病例
流感样病例:发热（体温≥38℃），伴咳嗽或咽痛之一者， 而缺乏其它的实验室确定诊断依据
采集时间：病人发病后的头三天
RT-PCR 组成成分
PCR的基本原理
• PCR反应条件 • PCR过程 • PCR的特点
94 温 度 72 （℃）
流感诊断的金标准
流感诊断的金标准
流感即流行性感冒，诊断的金标准通常被认为是病毒分离培养。
这种方法可以直接从患者体内分离出流感病毒，是确诊流感的最可靠方法。
然而，由于病毒分离培养需要一定的时间和实验条件，因此在实际操作中，医生通常会结合患者的流行病学史、临床症状以及其他实验室检查结果进行综合判断。
流感诊断的金标准是通过实验室检测直接从患者体内分离并鉴定出流感病毒。
具体来说，包括以下几个步骤：
1. 病毒核酸检测：实时荧光定量PCR（RT-PCR）是目前临床最常用的流感病毒检测方法，它能直接检测到患者呼吸道分泌物（如鼻咽拭子、喉咙拭子或痰液样本）中流感病毒的核酸（RNA），从而确定是否感染了流感病毒。
2. 病毒分离培养：在特殊细胞上培养患者的呼吸道分泌物标本，并观察是否有病毒生长和特征性的细胞病变效应，然后进一步通过免疫学或分子生物学技术鉴定病毒种类。
3. 血清学检测：虽然不是即时诊断手段，但在疾病恢复期采集血清进行抗体检测，对比发病初期和恢复期双份血清中的抗流感病毒抗体滴度变化，若4倍以上升高则有助于回顾性诊断。
根据国家卫生健康委员会发布的流感诊断标准，结合病人的流行病学史（如近期接触史、疫区旅行史等）和临床表现（如突发高热、咳嗽、头痛、肌痛、乏力等症状），可以初步怀疑流感。
但最终确诊
通常依赖于上述实验室检查的结果。
特别是在流感流行季节或者发生流感样症状的群体中，实验室检测是必不可少的确诊环节。
总之，流感诊断的金标准是病毒分离培养，但在实际操作中，医生需要综合考虑患者的流行病学史、临床症状以及实验室检查结果进行综合判断。
流感病毒分离标准操作规程
流感病毒分离标准操作规程(SOP)病毒分离分离病毒是诊断病毒性疾病最常用,并且高度敏感的方法之一。
分离出的病毒须经免疫学、基因分析或电子显微镜等进一步鉴定确诊。
病毒可长期保存,亦可用来作抗原性、基因特性或药物敏感性等分析。
病毒分离亦受一定限制。
目前用于分离病毒的组织细胞种类有限,每种细胞只能用来分离培养一或数种病毒。
MDCK(狗肾细胞)是目前用于分离培养流感病毒最常用的细胞系。
分离流感病毒最常用的活体是鸡胚,目前有些实验室用MDCK细胞代替鸡胚分离培养流感病毒。
由于MDCK细胞属肿瘤细胞系,故用该细胞分离的病毒不能用于疫苗生产。
各实验室应同时采用鸡胚和MDCK两种方法分离病毒,不应放弃用鸡胚分离病毒的方法。
流感病毒细胞分离标准操作规程材料:1、细胞瓶或细胞管培养成片的MDCK细胞2、TPCK处理胰酶(牛胰腺来源XIII型)Sigma Cat. # T-86423、HEPES 缓冲液, 1 M 母液GIBCO BRL Cat. # 15630-0234、D-MEM培养基,GIBCO BRL Cat. # 11965-0925、青、链霉素母液(10,000 U/ml 青霉素G; 10,000 μg/ml 硫酸链霉素) ,GIBCO BRL Cat. # 15140-0236、牛血清白蛋白组分V, 7.5%溶液,GIBCO BRL Cat. # 15260-0117、放置于2ml wheaton 小瓶中的临床样品8、T-25培养瓶用于病毒培养,(组织培养管也可被应用,若样本量大的话应选用培养瓶,细胞数量按规定调整。
)9、1ml 滴管10、10ml 滴管培养基和试剂的准备:(建议:要求经常检查试剂使用的有效期)500 ml D-MEM液中加入:青、链霉素母液5 ml (终浓度达: 100 U/ml 青霉素and 100 μg/ml 链霉素) 牛血清白蛋白12.5 ml (终浓度: 0.2 %)HEPES缓冲液12.5 ml (终浓度: 25 mM)病毒生长液:每500毫升不含血清的D-MEM液之中加0.5 ml of TPCK-胰酶(母液浓度为2mg/ml )使TPCK-胰酶的浓度为2 μg/ml。
全国流感监测技术指南(2017年版)
附件1全国流感监测技术指南（2017年版）为进一步规范我国流感监测工作技术环节，科学指导全国流感监测网络和各级疾病预防控制机构做好流感监测工作，依据《全国流感监测方案（2017年版）》, 特制定本指南。
一、监测目的（一）实时监测流感活动水平和流行趋势；（二）实时追踪流感病毒变异，及时发现新型流感病毒，并做出预警；（三）为全球及我国流感疫苗株的推荐及抗病毒药物的使用提供依据；（四）为流感大流行的准备和应对提供技术支撑。
二、流感样病例监测（一）监测病例定义流感样病例：发热（体温≥38℃），伴咳嗽或咽痛之一者。
出现发热的时间应在本次急性发热病程内，体温认定包括患者自测体温和医疗机构检测体温。
（二）监测时间所有流感样病例监测哨点医院和流感监测网络实验室均全年开展流感样病例监测。
流感监测周历编排标准参照ISO8601，按照公历的周一到周日编排，周一为每周第一天（周历注释：如1月1日为周一至周四，该周属于新年第一周；如1月1日为周五至周日，该周则属于上一年最后一周；监测年度注释：每年第十四周为监测年度起始周；下一年的第十三周则属于监测年度终止周。
）。
（三）哨点医院监测诊室的设置1．综合医院在内科门诊、内科急诊、发热门诊和（或）儿内科门诊、儿内科急诊开展流感样病例的监测。
2．儿童医院在儿内科门诊、儿内科急诊和（或）发热门诊开展流感样病例的监测。
3．所有国家级流感样病例哨点监测医院都应按要求规范设置监测诊室，不能仅将发热门诊设为监测诊室。
（四）流感样病例的报告1．报告内容和程序（1）哨点医院监测诊室的医务人员，按照流感样病例的定义，对每天在所有监测诊室就诊的病例进行诊断，每天按科室登记各年龄组的流感样病例数和门急诊病例就诊总数，填写“医院科门（急）诊流感样病例数和门急诊病例就诊总数原始登记表”（附表1），报医院主管科室。
原始登记表中“流感样病例数”和“门急诊病例就诊总数”可分科室、诊室，由各科室确定专人每日进行登记。
流感病毒的分离技术操作规范
流感病毒的分离技术操作规范病毒分离培养是流感样病例病原学监测的基础，是流感病毒检测最常用和最可靠的方法之一。
目前多采用鸡胚和MDCK细胞进行流感病毒分离。
通过鸡胚分离的流感毒株与原始标本的抗原性和基因特性可能会有所不同，而通过MDCK细胞所分离的流感病毒与原始标本相似。
另外由于“O”相毒株的重现，MDCK细胞对“O”相毒株的敏感性远高于鸡胚，所以MDCK细胞已成为流感病毒分离不可缺少的一种宿主系统。
但是目前全球主要使用鸡胚进行流感疫苗生产，MDCK分离的病毒在很多国家尚未批准用于疫苗生产，因此鸡胚分离仍然发挥着举足轻重的作用。
具备流感病毒分离能力的流感监测网络实验室收到哨点医院的常规监测标本后，要求利用状态良好的MDCK 细胞和（或）鸡胚进行病毒分离。
若同时进行MDCK细胞和鸡胚分离，为减少工作量，可先用MDCK细胞对原始标本进行筛选，MDCK细胞病毒分离结果为阳性后，再将另外一份-70℃或以下温度保存的原始标本进行鸡胚双腔接种（羊膜腔和尿囊腔），进行病毒分离。
（一）实验室生物安全级别和生物安全规定1. 流感病毒分离实验室生物安全级别：季节性流感病毒和2009甲型H1N1流感病毒生物安全二级；高致病性禽流感病毒生物安全三级。
2. 流感病毒分离实验室生物安全规定应当遵守生物安全实验室的有关生物安全的规定。
（二）流感病毒的细胞分离标准操作规程（所列试剂生产厂家及货号仅供参考）1. 试验材料（1）刚75-90％成片的MDCK细胞，T-25细胞瓶（2）TPCK处理胰酶（牛胰腺来源Ⅷ型）（SIGMA T8802）（3）HEPES缓冲液,1M母液（4）D-MEM培养基（高糖，含有L-谷氨酰胺），Hank's 液（5）青、链霉素母液(10,000U/mL青霉素G，10,000µg/mL硫酸链霉素)（6）牛血清白蛋白组分Ⅴ，7.5%溶液（GIBCO Cat No 15260）（7）处理好的临床标本0.5mL（标本处理参见附件1第一部分）（8）无菌移液管：1mL和10mL2. 培养基和试剂的准备（建议：经常检查试剂的有效期）（1）500mLD-MEM液中加入：a) 青、链霉素母液5mL(终浓度达：100U/mL青霉素和100µg/mL链霉素)b) 牛血清白蛋白组分V12.5mL(终浓度:0.25％)c) H EPES缓冲液12.5mL(终浓度:25mM)d) 加入7.5%NaHCO310-15mL（终浓度：2-3%)（2）病毒生长液：再向上述培养液中每500mL加入0.5mL的TPCK-胰酶（母液浓度为2mg/mL）使TPCK-胰酶的浓度为2µg/mL。
流感病毒采集规范
流感病毒采集规范第一篇：流感病毒采集规范附件5：流感监测实验技术操作规范一、流感监测临床标本的采集、运送、处理及流感病毒株的运输（一）、流感临床标本的采集病毒分离成功与否很大程度上取决于临床标本的质量，及其保存运输等环节。
多数标本取自患者上呼吸道鼻咽腔，其次为气管和支气管分泌物及尸检组织。
标本采集后应立即放入适当的采样液中低温保存。
采样液常用的采样液有以下五种：普通肉汤、pH7.4～7.6的Hank's、Eagle's、水解乳蛋白液或不加抗菌素的生理盐水（漱喉液）。
为防止采样液生长细菌和真菌，在采样液中需加入抗菌素，加入庆大霉素，其终浓度为0.1mg/ml,和抗真菌药物，其终浓度为2mg/ml。
加入抗菌素以后重新调节pH值为7.4，配制好以后，分装每个采样管4ml,-20℃冻存。
采样方法有以下几种：1)鼻拭子：将带有聚丙烯纤维头的拭子轻轻插入鼻道内鼻腭处，停留片刻后缓慢转动退出。
以另一拭子拭另侧鼻孔。
将拭子头浸入采样液中，尾部弃去。
2)咽拭子：用带有聚丙烯纤维头的拭子擦拭双侧咽扁桃体及咽后壁，同样将拭子头浸入采样液中，尾部弃去。
注：亦可将鼻、咽拭子收集于同一采样管中，以便提高分离率，减少工作量。
3)鼻咽抽取物：用与负压泵相连的收集器从鼻咽部抽取粘液。
先将收集器头部插入鼻腔，接通负压，旋转收集器头部并缓慢退出。
收集抽取的粘液，并用采样液5ml涮洗收集器3次。
4)漱口液：用10 ml 生理盐水漱喉。
漱时让患者头部微后仰，发“噢”声，让生理盐水在咽部转动。
然后，用平皿或烧杯收集洗液5)鼻洗液：患者取坐姿，头微后仰，用移液管将5 ml生理盐水注入一侧鼻孔，嘱患者同时发K音以关闭咽腔。
然后让患者低头使生理盐水流出，用平皿或烧杯收集洗液。
重复此过程洗两侧鼻孔。
（二）、临床标本运送新鲜的临床采集标本应在4℃条件下24小时内运送至全国流感监测网络实验室。
未能24小时内送至实验室的，应置-70℃或以下保存。
流感病毒细胞分离培养ppt课件
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3、MDCK细胞保存及复苏
MDCK细胞对流感病毒的敏感性随其代数增加 而下降，故各实验室应液氮冻存代数较低的细胞 作为种子。一般保存液为含10%二甲基亚砜和90% 小牛血清。
• （ 2 ） 已 成 片 的 MDCK 细 胞 ， 将 其 生 长 液 倒 掉 。 用 Versene洗2遍。
• （3）把Versene与0.25%胰酶按7∶1比例配成消化液。
• （4）置37℃恒温箱5—10min，当细胞变圆，细胞与 细胞间互不相联，表明消化时间已到。如细胞仍连成 片，表明消化时间未到。
4、MDCK细胞对流感病毒敏感性测试
MDCK细胞对病毒的敏感性随其代数增
加而下降。故MDCK细胞在实验室传20代以
上时，一般需测试一下其对流感病毒的敏
感性。其具体测试法：选一株对MDCK细胞
较敏感的流感病毒株。在同一条件下，用
早代与要测试的MDCK细胞对其进行TCLD50
测定。如果测试的TCLD50比早代的低2个或
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2、单细胞的制备（略）
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3．细胞培养的基本条件：
• （1）细胞接种数：细胞量越大繁殖的速度越快，
接种传代细胞一般为10—30万/ml。
• （ 2 ） 合 成 培 养 液 ： 如 Eagle 氏 液 ， RPMI1640 ，
Eagle’s MEM。 不同培养液各有其特点，但往往也 适用于各种细胞培养，其主要成分为氨基酸、碳水
流感的病毒分离和鉴定知识培训课件
分离后病毒的保存与运
低温保存
将分离到的病毒保存在低温环境 下，如-70℃或液氮中，以保持病 毒的活性。
包装与运输
根据国家相关规定，对病毒样本 进行包装和运输，确保安全可靠 。
分离技术的优缺点
细胞培养法的优点是操作简便、敏感性高，缺点是细胞株的来源和质量可能影响实 验结果。
鸡胚接种法的优点是操作简便、成本低，缺点是鸡胚的来源和质量可能影响实验结 果。
碎片。
病毒分离
将处理后的样本接种到敏感细胞 或鸡胚中，进行病毒的分离培养
。
病毒鉴定
通过病毒形态观察、免疫学检测 、核酸检测等方法对分离的病毒
进行鉴定。
实验操作中的常见问题与处理
样本污染
在实验操作过程中，要严格控制样本 的采集、运输和预处理，避免交叉污 染。如发生样本污染，应立即停止实 验，重新采集样本。
病毒鉴定的应用场景与选择
总结词
根据不同的应用场景选择合适的鉴定方法。
详细描述
在流感病毒的分离与鉴定过程中，应根据实际需求和应用场景选择合适的鉴定方法。形态学鉴定方法简单、快速 ，适用于初步筛选；免疫学鉴定方法特异性强、灵敏度高，适用于病毒抗原和抗体的检测；分子生物学鉴定方法 准确度高、分型能力强，适用于病毒核酸序列的分析。
免疫学方法的优点是灵敏度高、特异性强，缺点是抗体试剂的质量和实验操作可能 影响实验结果。
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流感病毒鉴定技术
形态学鉴定
总结词
通过观察病毒形态、大小、染色特性 等指标，对病毒进行初步鉴定。
详细描述
形态学鉴定通常采用显微镜观察病毒 粒子，了解其形状、大小、染色特性 等特征，从而对病毒进行初步分类和 鉴定。
的竞争力。
法律法规要求
流感病毒的分离培养与鉴定
流感病毒的分离培养与鉴定一．实验目的1.掌握临床呼吸道病毒感染标本的采集、处理及送检原则。
2.掌握病毒滴度测定—红细胞凝集试验原理。
3.熟悉流感病毒的分离培养---鸡胚尿囊腔接种技术。
4.熟悉鸡胚尿囊液收集方法；红细胞凝集试验操作方法、结果观察及病毒滴度判定。
二．实验原理1.病毒分离是流感诊断最常用和最可靠的方法之一,流感监测最主要的目的为:及时发现并抓住有意义的流感病毒新变种,尤其大流行株，用于诊断试剂的制备、疫苗的生产及疫情预报，因此,在流感诊断中任何方法都不能完全替代病毒分离这一方法，通常多用鸡胚来分离流感病毒。
2.3.血球凝集试验原理：某些病毒（如流感病毒、副流感病毒、腮腺炎病毒、脑炎病毒等）能选择性地凝集多种哺乳类动物和鸟类的红细胞,出现红细胞凝集现象，简称血凝现象。
这是由于流感病毒表面的血凝素是糖蛋白成分，红细胞表面有糖蛋白的受体,流感病毒血凝素结合在红细胞表面的糖蛋白受体上,从而发生红细胞凝集。
三．实验步骤1.标本采集→杀灭杂菌→接种→鉴定病毒类型2.培养：(1)取孵育10~12d鸡胚,在检卵灯下画出气室界线,于胚胎附近无大血管处画出标记作为注射入口。
(2)将卵置于卵架上,消毒标记处,用无菌剪刀尖在标记处打一小孔。
(3用灭菌注射器吸取流感病毒液0.2ml,由小孔刺入0.5cm后,进行注射。
(4)注射后,用无菌胶布封孔,置35度温箱孵育。
(5)每日在灯下检视鸡胚情况(若鸡胚在接种后24h内死亡为非特异性死亡,应弃之)。
3.鉴定：(1)取小试管9支（或采用塑料凹孔板）,于第一管加入生理盐水0.9毫升,其余各管均加入0.25毫升。
(2)于第一管注入羊水或尿囊液0.1毫升，充分混匀,吸出0.75毫升,于第二管注入0.25毫升,其余0.25毫升弃入消毒液中(切不可乱弃）。
从第2管起对倍稀释至第8管。
(3)各管加入0.5%鸡RBC 0. 25m1，摇匀后室温静置60分钟。
30分、45分、60分各观察结果一次,以阴性对照红细胞沉积结果为准。
犬流感病毒的分离鉴定及部分基因序列分析
犬流感病毒的分离鉴定及部分基因序列分析犬流感是一种由犬流感病毒引起的病毒性疾病，主要症状为发热、咳嗽、打喷嚏、流涕等症状。
随着人们对宠物狗的日益关注，犬流感病毒的研究也日渐重要。
本文介绍了对犬流感病毒的分离鉴定及部分基因序列分析。
病毒分离首先，需要获取患犬样本。
样本通常为喉拭子，应该在咳嗽和喉咙炎症状发作时采集，存放在RNA保护剂中，以免被破坏。
如果样本无法及时处理，冷冻保存也是可行的。
其次，将样本加入到合适的细胞培养基中，如犬肾细胞或犬胚细胞中，通过培养使病毒复制和扩增。
细胞在适宜的温度和营养条件下生长良好，可以发现透明液滴的形成，这被认为是病毒复制释放的标志。
收集透明液滴后，用PCR方法检测病毒的存在。
病毒检测检测病毒是分离病毒的重要步骤之一，最常用的分析方法是PCR。
PCR技术利用病毒的核酸在经过不断的复制和扩增后进行检测。
PCR不仅能提供病原体的存在与否的信息，还可以通过病毒的基因序列和物种，确定病毒的类型和亚型。
基因序列分析基因序列分析是对病毒的基因组进行研究的一种方法。
在犬流感病毒中，血凝素HA和神经氨酸酰胺酶NA是具有免疫原性的蛋白质，同时也是犬流感病毒疫苗的主要成分。
因此，对这些蛋白的基因组序列的分析可以提供在预防和控制犬流感病毒方面有用的信息。
基因序列分析可以通过比较同一病毒的不同株的基因组序列，或是不同病毒的基因组序列，从而了解病毒的变异和进化历史。
例如，犬流感病毒和人流感病毒同属于A型流感病毒，但两者的HA和NA基因序列却有很大的差异。
总之，分离鉴定和基因序列分析是研究犬流感病毒的关键步骤。
这些研究有助于加深我们对犬流感病毒作用机制的理解，为宠物狗的健康提供更好的预防和治疗方案。
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流感病毒的分离技术操作规范
病毒分离培养是流感样病例病原学监测的基础，是流感病毒检测最常用和最可靠的方法之一。
目前多采用鸡胚和MDCK细胞进行流感病毒分离。
通过鸡胚分离的流感毒株与原始标本的抗原性和基因特性可能会有所不同，而通过MDCK细胞所分离的流感病毒与原始标本相似。
另外由于“0”相毒株的重现，MDCK细胞对“0”相毒株的敏感性远高于鸡胚，所以MDCK细胞已成为流感病毒分离不可缺少的一种宿主系统。
但是目前全球主要使用鸡胚进行流感疫苗生产，MDCK分离的病毒在很多国家尚未批准用于疫苗生产，因此鸡胚分离仍然发挥着举足轻重的作用。
具备流感病毒分离能力的流感监测网络实验室收到哨点医院的常规监测标本后，要求利用状态良好的MDCK细胞和（或）鸡胚进行病毒分离。
若同时进行MDCK细胞和鸡胚分离，为减少工作量，可先用MDCK 细胞对原始标本进行筛选，MDCK细胞病毒分离结果为阳性后，再将另外一份-70℃或以下温度保存的原始标本进行鸡胚双腔接种（羊膜腔和尿囊腔），进行病毒分离。
（-）实验室生物安全级别和生物安全规定
1.流感病毒分离实验室生物安全级别：季节性流感病毒和2009甲型H1N1流感病毒生物安全二级；高致病性禽流感病毒生物安全三级。
2.流感病毒分离实验室生物安全规定
应当遵守生物安全实验室的有关生物安全的规定。
（二）流感病毒的细胞分离标准操作规程（所列试剂生产厂家及货号仅供参考）
1.试验材料
（1）刚75-90%成片的MDCK细胞，T-25细胞瓶
（2）TPCK处理胰酶（牛胰腺来源VIiI型）（S1GMAT8802）
（3）HEPES缓冲液,IM母液
（4）D-MEM培养基（高糖，含有1-谷氨酰胺），Hank,s 液
（5）青、链霉素母液（10,000U∕m1青霉素
G,10,000μg∕m1硫酸链霉素）
（6）牛血清白蛋白组分V,7.5%溶液
（G1BCOCatNo15260）
（7）处理好的临床标本0.5m1（标本处理参见附件1第一部分）
（8）无菌移液管：Im1和Iom1
2.培养基和试剂的准备（建议：经常检查试剂的有效期）
（1）50Om1D-MEM液中加入：
a）青、链霉素母液5m1（终浓度达：100U∕m1青霉素和100μg∕m1链霉素）
b）牛血清白蛋白组分V12.5m1（终浓度025%）
c）HEPES缓冲液12.5m1（终浓度:25mM）
d）加入7.5%NaHCO310-15m1（终浓度：2-3%）
（2）病毒生长液：再向上述培养液中每50Om1加入0.5m1的TPCK-胰酶（母液浓度为2mg∕m1）使TPeK-胰酶的浓度为2μg∕m10
3.流感病毒MDCK细胞分离程序
所有有关流感病毒分离的操作都应在相应生物安全级别的实验室中进行，必须遵守生物安全规定，严格执行标准操作规程和废弃物管理规定，做好个人防护要求。
（1）75〜90%成片细胞的准备
a）用40倍光学显微镜镜观察细胞生长状态。
选择处于对数生长期的MDCK细胞用于病毒的分离。
b）轻轻倒出细胞生长液，用IOm1的无菌移液管吸
6m1pH747.6的HankS液清洗细胞3遍。
（2）接种于细胞培养瓶
a）用无菌的移液管将清洗细胞的HankS液从细胞培养瓶中移出。
b）用无菌的移液管吸取500μ1临床样品置于细胞培养
瓶中，温和摇动数次，使之均匀铺于细胞培养瓶底。
c）将步骤2）中的培养瓶放入35°C,5%Co2培养箱中吸附1〜2h。
d）从培养箱中取出细胞培养瓶，用IOm1的无菌移液管吸取6m1pH7.4-7∙6的HankS液清洗细胞，加入5m1含终浓度2μg∕m1TPCK-胰酶的病毒生长液于细胞培养瓶中。
e）放置于35°C5%CO2培养箱培养。
f）每日观察细胞病变情况（细胞病变的特征是细胞肿胀圆化，细胞间隙增大成网状，细胞核固缩或破裂，严重时细胞部分或全部脱落）。
（3）细胞培养物的收获
a）当75%~100%细胞出现病变时进行收获。
即使无细胞病变也应该于第7天收获。
b）进行红细胞凝集试验（HA）,用H1方法进行流感病毒的鉴定（具体方法参见附件1：五、红细胞凝集及红细胞凝集抑制试验）。
对于HAW8的细胞分离物,进行10-1〜0-3稀释后，再感染细胞继续进行细胞传代，直至HA28时才能利用H1方法进行病毒的鉴定。
经连续传代2次以上，HA<8者，可以用核酸检测方法鉴定分型。
（三）流感病毒鸡胚分离标准操作规程
1.试验材料
(1)9~11日龄鸡胚
(2)照卵灯
(3)70%~75%酒精
(4)一次性注射器
(5)鸡蛋开孔器
(6)蜡、胶水或胶布
(7)IOm1试管和试管架
(8)IOm1移液管
(9)无菌镜子
2.流感病毒鸡胚分离程序
所有有关病毒分离的操作都应遵守生物安全规定，严格执行标准操作规程和废弃物管理规定。
进入生物安全实验室要求遵循生物安全实验室的个人防护要求。
(1)验卵
a)用照卵灯检测鸡胚，标记出鸡胚的气室与尿囊腔的界限、胚胎的位置。
如果鸡胚是死胚、没有受精、有裂痕、发育不全或表面有好多渗水孔，应弃掉。
b)如何判断鸡胚状态
血管：活胚血管清晰；死胚模糊，成淤血带或淤血块。
胎动：活胚有明显的自然运动，但是大于14天的胎动则不明显；死胚无胎动。
c)绒毛尿囊膜发育界限：血管密布的绒毛尿囊膜与鸡胚胎的
另一面(卵黄囊)形成明显的界限。
(2)鸡胚接种(照视下双腔接种法)
a）将鸡胚的气室朝上放置在蛋盘上，标记每个鸡胚,通常每个样本接种3个鸡胚。
b）用70%~75%酒精消毒鸡胚表面，在气室端钻孔，开约6x6mm裂口。
c）注射器装上16号针头，吸200μ1处理过的临床标本。
d）从裂口中滴入无菌的液体石蜡,然后轻轻晃动鸡胚,让液体石蜡在鸡胚壳膜内层（脏层）铺开大约ICm2面积（石蜡层不可将壳膜内层完全覆盖，会导致死胚），此时在照卵灯下即可清楚的看到鸡胚胎的位置。
将注射针头缓慢刺入胚胎的鄂下胸前，用针头轻轻拨动下颗及腿，当进入羊膜腔时,能看到鸡胚随着针头的拨动而动，即可注射100μ1临床标本。
将针头退出至1/2寸长度，将另外100μ1临床标本注入鸡胚尿囊腔。
e）用同一注射器和针头将同一标本依上法接种另外两枚鸡胚。
f）将针头弃于合适的生物安全装置中。
g）用消毒过的医用胶布封口。
h）33〜35℃温箱培养鸡胚2~3天。
一般A型流感病毒培
养2天，B型流感病毒培养3天，临床采样标本通常培养3
天。
鸡胚进行病毒分离培养时，每天检查鸡胚生长情况，24h内死亡的鸡胚，认为是非特异死亡应弃去。
（3）鸡胚尿囊液和羊水的收获
a）鸡胚在收获前应置4℃过夜或至少放置4h。
b）标记15m1无菌塑料管与相应的鸡胚编号一致。
用70%~75%酒精消毒鸡胚顶部。
c）用无菌镣子撕破鸡胚气室蛋壳，推开鸡胚尿囊膜。
用IOm1吸管吸取鸡胚尿囊液置于相应的收集管中。
用吸管或无菌镣子刺破鸡胚羊膜，吸取羊水放置于另外的管中。
羊水较少时也可以将3个鸡胚的羊水合并。
d）将鸡胚收获液300OrPm离心5min去除血液和细胞。
进行红细胞凝集试验。
没有红细胞凝集现象的标本，应再进行鸡胚盲传2次（对于相的毒株，需要连续传代多次才能具备在鸡胚中生长的特性）,盲传后HA滴度仍为阴性的标本,可按有关生物安全规定进行处理。
对于HA<8的鸡胚分离物进行10」〜10-3稀释后，继续进行鸡胚传代，HAN8时才能利用H1方法进行病毒的鉴定。
经连续传代2次后HA<8者，可以用核酸检测方法鉴定分型。
（四）注意事项
1.不要在・20℃条件下保存病毒分离物，因为该温度条件下流感病毒极不稳定。
2.流感病毒分离操作严格按照生物安全规程的要求。
禁止在同一实验室，同一时间处理和接种未知临床标本和已知病毒。
禁止在同一实验室，同一时间处理接种采自不同动物的标本；动
物标本（如猪、禽等）必须与人的标本分别保存。