植物组织培养学课件 (9)

据统计，目前已有49个科，146个属的320
多种植物经原生质体培养得到了再生植株 （1993） 其趋势仍以农作物和经济作物为主，但从 一年生向多年生、草本向木本、高等植物 向低等植物扩展
三、原生质体研究的意义

基础理论研究的实验体系 体细胞杂交 做为遗传转化的受体 无性系变异及突变体的筛选 分离细胞器
第三节 原生质体培养
原生质体培养基
原生质体培养方法
愈伤组织形成和植株再生
Байду номын сангаас影响原生质体培养的因素
一、原生质体培养基
1.无机盐 大量元素浓度 NH+4 和 NO-3 Ca2+浓度
2.有机成分 维生素、氨基酸、 糖及糖醇等，酵母 提取物、水解酪蛋 白
3.激素—生长素先高后低 4.渗透压—培养基渗透压与细胞渗透压等渗
3.愈伤组织形成
大多数情况下原生质体培养2
周后，形成多细胞的细胞团， 3周后形成肉眼可见的小细胞 克隆，大约6周后形成直径 1mm小愈伤组织 原生质体培养7～10天后必须 及时添加新鲜培养基，否则 形成的细胞团不继续生长。 待小愈伤组织长至1mm左右 时及时转移到固体培养基上 使其进一步生长
第六章 原生质体培养
研究概况
分离纯化
培养技术
再生植株遗 传与变异
性细胞原生 质体研究进 展
原生质体的 生理问题
第一节 原生质体研究概况
原生质体的概念
原生质体研究进展
原生质体研究的意义
一、原生质体的概念
原生质体(protoplast)：指除去细胞壁后的细胞 或者说一个被质膜所包围的裸露细胞 亚原生质体(subprotoplast)：在原生质体分离 过程中，有时会引起细胞内含物的断裂而形成一 些较小的原生质体就叫做亚原生质体（它可以具 有细胞核或没有细胞核） 核质体(nuclearplast)：由原生质膜和薄层细胞 质包围细胞核形成的小原生质体，也称为微小原 生质体(miniprotoplast)
Creisson等测定了200个马铃薯叶肉原生质体再生植株
的染色体数，其中具有正常染色体数（2n=48）的植株 占57％，非整倍体植株占43％，而且还有染色体结构的 变异 Fish等（1986）从178个马铃薯叶肉原生质体再生植株 中观察到具有正常染色体数（2n=48）的植株占63.6%， 非整倍体占36.4%，其中染色体数接近48的占8.4%，接 近96的占多数
缺点：操作要求严格，尤其是混合时温度掌握必须 合适，温度偏高则影响原生质体的活力，温度偏低 则琼脂糖凝固太快原生质体不易混合均匀
琼脂糖珠培养
将含有原生质体的液态琼脂糖培养基用吸管以 大约50μ l一滴的量滴于直径6cm的培养皿，待 其固化后向其中添加3ml液体培养基并与摇床上 低速旋转培养（Thompson等，1986）
培养过程中，通过调整液体培养基的渗透压来 调节培养物的渗透压以利于其进一步的生长和
发育。这种方法由于改善了培养物的通气和营 养环境，从而促进了原生质体的分裂和细胞团 的形成
悬滴培养法 微滴培养法 饲养层培养法
培养条件
培养温度保持在25-27℃，光照16h/d左右，
静置为主，但为了不使细胞聚集，最初几 天需经常轻轻摇动，以助通气
缺点：不易观察细胞的发育过程
固体平板培养
固体培养也就是琼脂糖包埋培养。低熔点的琼脂糖 可在30℃左右融化与原生质体混合而不影响原生质 体的生命活动。混合后含有原生质体的培养基铺于 培养皿底部，封口后进行培养
优点：可以跟踪观察单个原生质体的发育情况，易 于统计原生质体的分裂频率和植板率
4.植株再生 原生质体形成的愈伤组织直接转移到分化 培养基上可一步成苗 然而，越来越多的试验证明，两步成苗法 更适合大多数植物原生质体再生植株 首先将愈伤组织培养于含低浓度生长素培 养基上，让其增值和调整状态，再将其转 移到分化培养基上分化成苗
1天
5天
7天
10天
夜来香原生质体培养
量的比值
三、原生质体的发育与植株再生
细胞壁再生
细胞分裂与生长
愈伤组织形成
植株再生
1.细胞壁再生
原生质体培养数小时后开始再生新的细胞壁，
一至数天内便可形成完整的细胞壁 电镜观察发现，原生质体培养数小时后新壁 开始形成，先是质膜合成形成细胞壁主要成 分的微纤维，然后转移到质膜表面进行聚合 作用产生多片层结构，以后在质膜与片层结 构之间或在膜上产生小纤维丝，逐渐形成不 定向的纤维团，最后形成完整的细胞壁
添加新鲜培养基和转移培养物 缺点：原生质体分布不均匀，常常发生原生质体 之间的粘连现象而影响进一步的生长和发育。此 物，难以跟踪观察单个原生质体的发育情况
液体－固体双层培养
在培养皿底部铺一层琼脂糖固体培养基，再将原 生质体悬浮液滴于固体培养基表面
优点：固体培养基中的营养可以慢慢释放到液体 培养基中，如果在下层固体培养基中添加一定量 的活性炭，则可以吸附培养物产生的一些有害物 质，促进原生质体的分裂和细胞团的形成
2.渗透压的调节
必要性：为了维持酶液的渗透压与细胞内渗透压的平
衡，必须使原生质体处于一个等渗环境中。因此，酶 解液中必须加入渗透压调节剂
常用的渗透压调节剂
①糖溶液系统：葡萄糖、甘露醇和山梨醇等 ②盐溶液系统：包括KCl、MgS04和KH2PO4等
使用浓度据植物材料而定，一般为0.2-0.8 mol/L
第二节 原生质体的分离
基础材料准备
预处理与酶解
原生质体收集与纯化
原生质体活性测定
A Scheme of plant protoplast
一、用于分离原生质体的材料准备
材料来源：细胞分裂旺盛的外植体，如幼嫩
小苗的根、胚轴、子叶、幼叶等；处于快速 生长期的愈伤组织或悬浮细胞
对于容易培养、再生能力较强的双子叶植物
4周
5周
7周
夜来香原生质体培养
四、影响原生质体培养的主要因素 1.基因型
通过番茄与秘鲁番茄有性杂交后对性状分离的遗 传分析，证明其愈伤组织的再生能力是2个显性 基因所决定的（Koomneef M等，1987） Cheng和Veilleux（1991）对芙薯（S.Phurja） 原生质体的培养能力也做过遗传分析，并证明从 原生质体培养到形成愈伤组织是受到2个独立位 点的显性基因所控制（Cheng 等，1991）
沉降法：甘露醇作为渗透压调节剂时
漂浮法：蔗糖作为渗透压调节剂时
梯度离心：利用比重不同的溶液，经离心后使原 生质体处在两液相的界面之间
完整的原生质体
四、原生质体活力测定
FDA染色法（荧光素二醋酸酯染色法）
酯酶 水解 荧光素
紫外光
荧光素
FDA
FDA
细胞核
完整、有活力 的原生质体
荧光增白剂（CFW）染色法
Rohm and Hass Co., Philadelphia, PA 19105, USA
来 源
绿色木霉 绿色木霉 绿色木霉 绿色木霉 根霉 黑曲霉 黑曲霉
生产厂家
Yakult Honsha Co. Ltd., Tokyo, Japan Yakult Honsha Co. Ltd., Tokyo, Japan
Grosser等（1984）报道三叶草叶肉原生质体再生植株为
二倍体（2n＝16），而由培养细胞分离的原生质体再生的 植株为四倍体（2n＝32）
原生质体再生植株的变异还与植物种类有关
佘建明等对粳型水稻77-170品系原生质体再生 植株R2代96株的根尖染色体数目进行了鉴定， 结果表明染色体倍性稳定，全部为二倍体 马铃薯原生质体再生植株的染色体变异程度较大
这说明
①基因型不同对培养反应不同 ②原生质体来源不同培养难易不同 ③培养基与培养条件仍需不断完善
第四节 原生质体再生植株遗传及变异
染色体变异
植株表形性状变异
染色体变异
原生质体再生植株的倍性与分离原生质体的起始材 料有关 由茎尖、叶肉细胞分离的原生质体能较好地保持原 来的倍性 用悬浮培养细胞特别是长期继代培养的细胞系分离 的原生质体，较易出现染色体倍性及数目的变化
2.细胞分裂和生长
一般原生质体培养 2～7d后开始第一次分裂，但 开始第一次分裂的时间随植物的种类、分离原生 质体的材料、原生质体的质量、培养基的成分和 培养条件而异
用幼苗的下胚轴和子叶、幼根、悬浮培养的细胞、 未成熟种子的子叶等为材料分离的原生质体，一
般比叶肉分离的原生质体容易诱导分裂，第一次 分裂出现的时间较快
二、原生质体的研究进展
植物原生质体培养研究中几个值得提出的重要成就
1880年，Hanstein首次起用原生质体(protoplast）一


词 1892年，Klercher用机械方法首次从藻类中分离得到原 生质体 1960年，Cocking首次应用酶法制备番茄根原生质体获 得成功 1971年，Takebe等首次得到烟草叶肉原生质体培养的 再生植株 1985年，Fujimura等获得第一例禾谷类作物－水稻原生 质体培养再生植株 1986年，Spangenberg等单个原生质体培养再生植株 在甘蓝型油菜上获得成功
酶解
酶解时间
酶浓度
酶解温度
原则：利用尽可能低的酶浓度和尽可能短的酶解
时间来获得大量有活力的原生质体
酶 解 分 离 原 生 质 体
三、原生质体的收集和纯化
酶解后为将杂质和酶液去除，一般先将酶解
混合物通过一定孔径的筛网过滤，除去未消 化的细胞团和组织块等较大杂质，收集滤液 于离心管中 进一步分离纯化
• 通过检测细胞壁的形成而确定原生质体的活力
酚藏花红染色法 伊凡蓝染色法 其它：胞质环流、呼吸代谢强度、光合活
性等
影响原生质体活力的因素
分离材料的生理状态 酶解的条件：酶质量、浓度、酶解温度和
时间、酶溶液的渗透压 分离条件：离心次数、离心速度、纯化方 法、分离持续时间 环境条件：操作环境的温度、分离用具的 影响
3.酶解
材料预处理
有菌材料，则必须进行表面消毒处理
用黑暗处理、低温处理和不同光质照射等方法，
可提高某些材料原生质体的产量和活力 不同植物及材料类型预处理的方法不同
• 龙胆试管苗的叶片只有用4℃低温处理 • 甘蔗植株只有先在黑暗条件下培养12小时后分离的原生质
体才能分裂 • 马铃薯试管苗叶片需在黑暗下处理48h后分离原生质体， 才会获得较高的产量
原生质存活、率密度及产量的测定
（一）双醋酸盐维生素
1.FDA活性染色 2.测定原生质体存活率 存活率=存活原生质体数/总原生质体数×100%
（二）测定原生质体的密度
原生质体的密度（个/ml）=（原生质体数/区域数） ×104 ×稀释倍数
（三）原生质体产量测定 原生质体产量指每克鲜重材料制备所得存活原生质体
2.原生质体的来源
禾本科植物在使用悬浮系细胞作为原生质
体来源后很快在水稻中获得成功 1993年，Cupta等用6个水稻品种8天龄的 无菌苗叶基和叶鞘原生质体进行液体/固体 饲喂培养，从4个品种中得到了再生植株
3.起始密度培养密度与培养基 起始密度：适宜密度为1×105/ml左右 培养基激素水平 密度与培养基营养成分完全性
（如烟草、菊花、胡萝卜、矮牵牛等）也可 用完全展开的叶片作材料
用于分离原生质体的植物材料要培养在最佳
的光温条件下
二、预处理与酶解
酶
渗透压 调节
酶解
1.原生质体分离常用的商品酶
酶
纤维素酶类 Onozuka R-10 Onozuka RS Cellulysin Driselase 果胶酶类 Macerozyme R-10 Pectinase Pectolyase Y-23 半纤维素酶 Rhozyme HP-150 黑曲酶
Calbiochem., San Diego, CA 92037, USA Irpex lutens Kayowa Hakko Kogyo Co., Tokyo, Japan
Yakylt Honsha Co. Ltd.,Tokyo, Japan Sigma Chemical Co., St. Louit, MO 63178,USA Kikkoman Shoyu Co.，Japan
培养基糖醇变化对马铃薯原生质体细胞和出芽率 的影响
1.在只含甘露醇、蔗糖和肌醇的培养基中培养7d； 2.在含蔗糖、纤维二糖、葡萄糖、甘露醇、肌醇、木糖 醇和山梨醇的培养基中培养7d
二、原生质体培养方法
液体浅层培养
将含有原生质体的培养液在培养皿底部铺一薄层， 封口后进行培养
优点：操作简单，对原生质体的损伤小，且易于