植物组织培养学课件 (9)
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植物组织培养ppt课件
问题
3
植物自然条件下的繁殖方法有哪些？ 种子繁殖 无性繁殖
4
各种形态的种子
5
种 子 和 果 实 的 产 生
无性繁殖6
植物组织培养的基本原理
7
1902年，德国植物学家哈伯兰特细胞全能性的理论是植 物组培的理论基础。
1958年，美国植物学家斯蒂瓦特等人，用胡萝卜韧皮部 的细胞进行培养，终于得到了完整植株，并且这一植株 能够开花结果，证实了哈伯兰特在五十多年前关于细胞 全能的预言。
结论：生长素及细胞分裂素的比例可影响细胞的脱 分化及再分化。
pH ——一般控制5.8 无菌 ——操作台、培养基、实验仪器等
2 植物组织培养过程
17
根
离体的植物器官、 组织或细胞
脱分化
（外植体）
愈 伤 组 织
芽
再分化 胚 状
植 物 体
体
植物组织培养过程示意图
18Βιβλιοθήκη ①叶片接种到培养基上②产生愈伤组织
③愈伤组织增殖
④愈伤组织开始分化
⑤愈伤组织分化出芽
⑥培养基中的试管苗
能性表达的前提，再分化是细胞全能性表达的最终体现。
二、植物组织培养技术
14
1 培养条件
MS培养基配方 单位（mg/L）
15
KNO3
1900
NH4NO3
1650
KH2PO4
170
MgSO4.7H2O
370
CaCl2.2H2O
440
Na2.EDTA
37.3
FeSO4.7H2O
27.8
盐酸硫胺素（VB1） 0.1
20世纪80年代，每一个植物细胞具有该植物的全部遗传信息，在适 当条件下可表达出该细胞的所有遗传信息，分化出植物有机体所有不同 类型细胞，形成不同类型的器官甚至胚状体，直至形成完整再生植株。
植物组织培养 PPT
5、移栽锻炼 将生根的苗从锥形瓶中移至草炭土或蛭石中，用玻璃罩或 塑料布保持80%以上的湿度，2-3天后打开玻璃罩逐渐降 低湿度进行锻炼，直到将罩全部打开处于自然湿度为止。
6、定植 苗健壮后移至土中培养（定植），即可长成植株并开花。
例题：右图是实验室进行植 物组织培养的一般过程。请 回答下列问题：
(3)基本过程
①愈伤组织：由离体的植物组织或细胞经 脱分化 形成的一 种 相对没有分化 的活的薄壁细胞团组成的新生组织。 ②脱分化：又叫去分化，是由_高__度__分__化___的植物组织或细胞产 生_愈__伤___组__织__的过程。 ③再分化：愈伤组织继续培养，重新分化成_根__或___芽__等器官的 过程。
2、下面是宁夏农林科学院进行苹果试管苗培养的一般过程:
⑴请填写a～c所表示的内容。a. 脱分化 ； b. 愈伤组织 ；c. 再分化 。
⑵实验室一般使用保存的培养基母液来制备MS固体培养基,配制母液 时, 大量元素 、 微量元素 和有机物要浓缩5～10倍。 细胞分 ⑶该过程中a、c的启动关键在于培养基中所加 生长素 和 裂素 的浓度配比。
MS培养基中各成分的作用
植物激素和人工合成的植物激素
植物中存在的天然激素都有相应的使之分解的酶，这样，天 然激素在植物体内作用和存在的时间就较短，而人工合成的 激素在植物中没有相应分解它的酶，所以作用和存在的时间 长，作用效果明显。
大家应该也有点累了，稍作休息
大家有疑问的，可以询问和交流
生长素和细胞分裂素在植物组织培养中的相互作用
诱导芽的形成 愈伤组织不分化 诱导根的形成
菊花组织培养操作步骤:
生芽 生根
消毒
无菌水
1
酒精灯火焰 封口膜
生芽
植物组织培养(PPT)
接种针 镊子 解剖刀
二、实验基本操作技术
（一）洗涤技术
1、洗涤液 的配制
2、洗涤方法
（1）玻璃器皿洗涤 A、新购买的玻璃器皿 表面常附着有游离的
碱性物质，可先用0.5％的去污剂洗刷，再用 自来水洗净，然后浸泡在1％～2％盐酸溶液 中过夜（不可少于四小时），再用自来水冲洗， 最后用无离子水冲洗两次，在100℃～120℃ 烘箱内烘干备用。
植物组织培养
一、实验室设置及仪器设备
（一）实验室设置 实验室是进行组培研究的主要场所，应能 满足清洗、培养基制备、储藏、无菌操作、 培养、鉴定等多方面的工作。
组织培养实验室设置的总体要求：
便于隔离 便于操作 便于灭菌 便于观察
实验室 组成
基本实验室
准备室 缓冲室 无菌操作室 培养室
细胞生物学实验室 辅助实验室 温室
4、用70－75％的酒精拭擦台面并消毒双手。 试验用具也应该用酒精消毒。点燃酒精灯，将 金属器械在其火焰上灼烧，冷却待用。 注意：所有操作应在火焰近处并经过灼烧进行。 金属器械不能过度灼烧，以防退火。移液管不 能灼烧，培养瓶口、塑料材料、橡胶材料过火 焰不能时间太长。
5、取流水冲洗（至少30min）过的外植体，用 一定的消毒剂浸泡消毒，用无菌水冲洗3~4次， 放入无菌培养皿中，置于酒精灯火焰下方，用无 菌的接种器械进行分离、切割或其他处理。
皿 和 玻璃器皿
用 具
接种用具
培养基：湿热
外部细菌：用水冲洗→化学药剂处理 培
养
材 内部细菌 茎尖培养
料
加抗生素：青霉素、利福平
操作的空气：洗刷地板、95%酒精擦超净工作台 用化学试剂薰蒸
1、实验器具和材料的准备 2、用75%的酒精擦拭超净工作台，然后室内及 超净工作台用紫外灯杀菌20min-30min。注意： 台面上的用品不要放置太多或重叠放置，以免降 低灭菌效果。 3、关紫外灯、打开风机，过5-10min进入缓冲 间，以75%洗手和手臂，更换无菌服、帽子和口 罩。进入接种室。（注：没有特别情况，尽量不 要下工作台）
二、实验基本操作技术
（一）洗涤技术
1、洗涤液 的配制
2、洗涤方法
（1）玻璃器皿洗涤 A、新购买的玻璃器皿 表面常附着有游离的
碱性物质，可先用0.5％的去污剂洗刷，再用 自来水洗净，然后浸泡在1％～2％盐酸溶液 中过夜（不可少于四小时），再用自来水冲洗， 最后用无离子水冲洗两次，在100℃～120℃ 烘箱内烘干备用。
植物组织培养
一、实验室设置及仪器设备
（一）实验室设置 实验室是进行组培研究的主要场所，应能 满足清洗、培养基制备、储藏、无菌操作、 培养、鉴定等多方面的工作。
组织培养实验室设置的总体要求：
便于隔离 便于操作 便于灭菌 便于观察
实验室 组成
基本实验室
准备室 缓冲室 无菌操作室 培养室
细胞生物学实验室 辅助实验室 温室
4、用70－75％的酒精拭擦台面并消毒双手。 试验用具也应该用酒精消毒。点燃酒精灯，将 金属器械在其火焰上灼烧，冷却待用。 注意：所有操作应在火焰近处并经过灼烧进行。 金属器械不能过度灼烧，以防退火。移液管不 能灼烧，培养瓶口、塑料材料、橡胶材料过火 焰不能时间太长。
5、取流水冲洗（至少30min）过的外植体，用 一定的消毒剂浸泡消毒，用无菌水冲洗3~4次， 放入无菌培养皿中，置于酒精灯火焰下方，用无 菌的接种器械进行分离、切割或其他处理。
皿 和 玻璃器皿
用 具
接种用具
培养基：湿热
外部细菌：用水冲洗→化学药剂处理 培
养
材 内部细菌 茎尖培养
料
加抗生素：青霉素、利福平
操作的空气：洗刷地板、95%酒精擦超净工作台 用化学试剂薰蒸
1、实验器具和材料的准备 2、用75%的酒精擦拭超净工作台，然后室内及 超净工作台用紫外灯杀菌20min-30min。注意： 台面上的用品不要放置太多或重叠放置，以免降 低灭菌效果。 3、关紫外灯、打开风机，过5-10min进入缓冲 间，以75%洗手和手臂，更换无菌服、帽子和口 罩。进入接种室。（注：没有特别情况，尽量不 要下工作台）
植物细胞组织培养(PPT)
2
06.10.2020
主要有:
➢ 原生质体（Protoplast）培养 ➢ 悬浮细胞培养 ➢ 组织（愈伤组织Callus、茎尖分生组织）培
养 ➢ 器官（胚，花药，子房，根和茎）培养
其中最常见的是愈伤组织培养。
06.10.2020
3
06.10.2020
植物细胞组织培养范畴：
（广义）又叫离体培养：指从植物体分离出 符合需要的组织、器官或细胞、原生质体等， 通过无菌操作，在人工控制条件下进行培养 以获得再生的完整植株或生产具有经济价值 的其他产品的技术。
06.10.2020
14
三、植物组织培养的生理依据
植物生长调节物质对于植物细胞组织的分化和决定具 有关键性作用。它包括：生长素类、细胞分裂素类、 赤霉素、脱落酸、乙烯等
生长素类主要用于愈伤组织的形成，体细胞胚的产生及试管 苗的生根。常用的有2,4-D、NAA、IBA、IAA等。其作用强 弱为2,4-D>NAA>IBA>IAA。
细胞分裂素类则有促进细胞的分裂与分化，延迟组织的衰老， 促进芽的产生等作用。常用的有Zip(异戊烯腺嘌呤)、KT、6BA、ZT等作用强弱顺序为。Zip>KT>6-BA>ZT。
赤霉素则有促进已分化的芽伸长生长，打破种子休眠的作用。 常用的为GA3。
06.10.2020
15
四、植物组织培养的原理
★植物细胞全能性（Cellular totipotency）： 任何具有完整细胞核的植物细胞，都拥有形成
种子培养
10
06.10.2020
3. 组织或愈伤组织培养(tissue， callus culture) ：是对植物体的各部分
组织进行培养，如茎尖分生组织、形成层、 木质部、韧皮部、表皮组织、胚乳组织和薄 壁组织等等；或对由植物器官培养产生的愈 伤组织进行培养，二者均通过再分化诱导形 成植株.
植物组织培养 PPT课件
我国第一个T-DNA 插入突变体库的构建和研究为我国水稻功能基 因组学研究奠定了良好的技术和材料基础，由中国水稻研究所农业部 水稻生物学重点开放实验室和中科院上海植物生理研究所合作，通过 建立大规模、高效的农杆菌介导的转基因技术体系，将玉米转座子 Ac-Ds 等外源基因导入水稻未成熟胚和种子诱导的愈伤组织，获得了 1.2 万个独立的T-DNA 插入株系，并构建了水稻突变体的数据库。
植物细胞全能性的发现和证实，为植物种质资源的长期保存开辟 了一条新途径。采用液氮超低温保存技术，能保持很高的存活率，并 且能再生出新植株和保持原来的遗传特性。如建立茎尖分生组织培养 物的超低温保存种质库，不仅可以防止种质的遗传变异和退化，而且 可以长期保存无病毒的原种。
• <6>植物组织培养与转基因技术的应用
试管苗大规模培养
• <2>目前进展较多的大概还有胚状体形成、离体胚培养、高频 再生系 统建立、药用植物细胞培养、染色体检测、抗性研究等， 随着与其他 学科的相互渗透，植物组织培养的前景也将越来越宽广
5.植物组织培养的应用现状
• <1>植物快速繁殖和无病毒种苗生产
目前，通过离体培养获得小植株并且具有快速繁殖潜力的植物已有 100 多科1000 种以上，有的已经发展成为工业化生产的商品。世界 上80% ～ 85% 的兰花是通过组织培养进行脱毒和快速繁殖的。利用 组织培养进行植物快速繁殖及无病毒种苗生产，不仅能够挽救珍惜濒 危物种，而且能够解决植物野生资源缺乏的问题。
植物组织培养
生命科学学院0802班梅定兰2008114010239
植物组织培养
1.植物组织培养技术的历史 2.植物组织培养的原理 3.植物组织培养技术的研究应用现状 4.植物组织培养技术存在的问题及对策
植物细胞全能性的发现和证实，为植物种质资源的长期保存开辟 了一条新途径。采用液氮超低温保存技术，能保持很高的存活率，并 且能再生出新植株和保持原来的遗传特性。如建立茎尖分生组织培养 物的超低温保存种质库，不仅可以防止种质的遗传变异和退化，而且 可以长期保存无病毒的原种。
• <6>植物组织培养与转基因技术的应用
试管苗大规模培养
• <2>目前进展较多的大概还有胚状体形成、离体胚培养、高频 再生系 统建立、药用植物细胞培养、染色体检测、抗性研究等， 随着与其他 学科的相互渗透，植物组织培养的前景也将越来越宽广
5.植物组织培养的应用现状
• <1>植物快速繁殖和无病毒种苗生产
目前，通过离体培养获得小植株并且具有快速繁殖潜力的植物已有 100 多科1000 种以上，有的已经发展成为工业化生产的商品。世界 上80% ～ 85% 的兰花是通过组织培养进行脱毒和快速繁殖的。利用 组织培养进行植物快速繁殖及无病毒种苗生产，不仅能够挽救珍惜濒 危物种，而且能够解决植物野生资源缺乏的问题。
植物组织培养
生命科学学院0802班梅定兰2008114010239
植物组织培养
1.植物组织培养技术的历史 2.植物组织培养的原理 3.植物组织培养技术的研究应用现状 4.植物组织培养技术存在的问题及对策
植物的组织培养课件
光照控制
提供适宜的光照强度和时间，以满足植物细胞对光的需求。
气体交换与湿度控制
保持培养室内良好的气体交换和湿度条件，以利于植物细胞的生 长和发育。
03
植物组织培养的遗传与变异
细胞全能性与基因表达
细胞全能性
指一个细胞含有该生物全部的遗传信息，在适当的条件下可以发育成完整的生 物个体。
基因表达
在植物组织培养过程中，细胞需要重新获得或关闭某些基因的表达，以适应新 的生长环境。
05
植物组织培养的挑战与前景
技术瓶颈与创新发展
要点一
技术瓶颈
植物组织培养技术在实际应用中面临诸多挑战，如培养基 的优化、外植体的选择与处理、污染防控等。
要点二
创新发展
针对这些技术瓶颈，研究者不断探索新的方法和手段，如 采用新型生物材料、改进培养基配方、引入基因编辑技术 等，以提升植物组织培养的效率和成功率。
伦理与法律问题
伦理问题
植物组织培养技术涉及到生命伦理问题，如胚胎干细胞研究、基因编辑等，需要遵循严 格的伦理规范和审查机制。
法律问题
植物组织培养技术的知识产权保护、生物安全法规等方面也存在一定的法律风险和挑战， 需要遵守相关法律法规。
植物组织培养在农业可持续发展中的作用与前景
作用
植物组织培养技术对于农业可持续发展具有 重要意义，可以快速繁殖优良品种、保护濒 危植物资源、提高农作物的抗逆性和产量等 。
植物组织培养中的基因编辑技术
基因编辑技术
在植物组织培养中，基因编辑技术如CRISPR-Cas9等被广泛应用于对植物基因进行精确编辑和改造。
基因编辑的应用
通过基因编辑技术，可以实现对植物抗病、抗虫、抗逆等性状的改良，提高农作物的产量和品质。
提供适宜的光照强度和时间，以满足植物细胞对光的需求。
气体交换与湿度控制
保持培养室内良好的气体交换和湿度条件，以利于植物细胞的生 长和发育。
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植物组织培养的遗传与变异
细胞全能性与基因表达
细胞全能性
指一个细胞含有该生物全部的遗传信息，在适当的条件下可以发育成完整的生 物个体。
基因表达
在植物组织培养过程中，细胞需要重新获得或关闭某些基因的表达，以适应新 的生长环境。
05
植物组织培养的挑战与前景
技术瓶颈与创新发展
要点一
技术瓶颈
植物组织培养技术在实际应用中面临诸多挑战，如培养基 的优化、外植体的选择与处理、污染防控等。
要点二
创新发展
针对这些技术瓶颈，研究者不断探索新的方法和手段，如 采用新型生物材料、改进培养基配方、引入基因编辑技术 等，以提升植物组织培养的效率和成功率。
伦理与法律问题
伦理问题
植物组织培养技术涉及到生命伦理问题，如胚胎干细胞研究、基因编辑等，需要遵循严 格的伦理规范和审查机制。
法律问题
植物组织培养技术的知识产权保护、生物安全法规等方面也存在一定的法律风险和挑战， 需要遵守相关法律法规。
植物组织培养在农业可持续发展中的作用与前景
作用
植物组织培养技术对于农业可持续发展具有 重要意义，可以快速繁殖优良品种、保护濒 危植物资源、提高农作物的抗逆性和产量等 。
植物组织培养中的基因编辑技术
基因编辑技术
在植物组织培养中，基因编辑技术如CRISPR-Cas9等被广泛应用于对植物基因进行精确编辑和改造。
基因编辑的应用
通过基因编辑技术，可以实现对植物抗病、抗虫、抗逆等性状的改良，提高农作物的产量和品质。
《植物组织培养技术》课件
04 植物组织培养技术的应用实例
快速繁殖技术
快速繁殖技术是指利用植物组 织培养技术，快速、大量繁殖
植物种苗的一种方法。
该技术广泛应用于花卉、果树 、林木等植物的快速繁殖，能 够大大缩短繁殖周期，提高繁
殖系数。
快速繁殖技术还可以通过控制 培养条件，实现植物的定向繁 殖，如矮化、无病毒等。
快速繁殖技术具有高效、环保 、可重复利用等优点，是现代 农业和林业生产的重要手段之 一。
濒危植物保护与复壮是保护生 物多样性和维护生态平衡的重 要手段之一，具有深远的社会 意义和生态意义。
05 植物组织培养技术的挑战与前景
技术瓶颈与解决方案
技术瓶颈
目前植物组织培养技术面临的主要瓶颈包括培养基的优化、外植体的选择与处 理、污染控制以及基因转化效率等。
解决方案
针对这些问题，研究者们正在探索新型的培养基成分、优化外植体的选择标准 、开发新型的消毒方法以及改进基因转化技术，以期提高植物组织培养的效率 和成功率。
指任何一个植物细胞都包含该物种的 全套遗传信息，具有发育成完整个体 的潜在能力。
植物细胞全能性证明
植物细胞全能性的应用
植物组织培养技术利用植物细胞的全 能性，通过离体培养获得完整的植株 ，广泛应用于植物繁殖、品种改良、 基因工程等领域。
许多植物细胞如胡萝卜、烟草、草莓 等在适宜条件下能够发育成完整的植 株，证明了植物细胞的全能性。
技术发展趋势与展望
发展趋势
随着生物技术的不断发展，植物组织培 养技术也在不断进步和完善。未来，该 技术将更加注重与基因编辑、合成生物 学等新兴技术的结合，以实现更为精准 和高效的植物育种和种质资源保护。
VS
展望
未来，植物组织培养技术有望在农业、园 艺、林业等领域发挥更大的作用，为解决 全球粮食安全、生态恢复等问题提供有力 支持。
植物组织培养ppt课件
36
三、植物组织培养的发展简史
四个阶段
探索阶段（1902-1929年） 奠基阶段（1930-1960年） 迅速发展阶段（1960-1980） 生产上广泛应用阶段(1980-今）
37
1. 探索阶段（1902-1929年）
Haberlandt：
贡献： 提出细胞全能性假说 首次进行离体细胞培养
有不同的培养反应。 （6）植物种类的差异。 一般双子叶植物比单子叶植物
及裸子植物容易。
25
4、愈伤组织（Callus）培养
①愈伤组织生长过程
在脱分化的过程中，多形成Callus, 其细胞结构无明 显极性。
• （1）诱导期：细胞准备进行分裂， 细胞大小几乎不变，
生理生化变化大，迅速合成蛋白质和核酸。
RNA
27
28
③愈伤组织的继代培养 在多数情况下，随着培养时间的延长，Callus长势
下降、褐变、分化和形态发生能力下降甚至死亡。主 要原因：染色体畸变，基因突变， 生理因素（代谢产 物），细胞或组织内激素平衡的改变，细胞对外源生 长物质的敏感性改变，培养基损耗等。
29
④愈伤组织形态发生 （1）准备：外层细胞分裂逐渐减慢并停止；内部较深
19
2 、细胞分化（Cell differentiation）
①概念
（1） 分化：是指植物体各个部分出现异质性的现象，
包括细胞分化、组织分化和器官分化。
（2）细胞分化：指同一来源的细胞逐渐产生出形态结 构、功能特征各不相同的细胞类群的过程，其结果是 在空间上细胞产生差异，在时间上同一细胞与其从前 的状态有所不同。
35
②影响细胞再分化因素： 从理论上讲，在离体培养条件下经过再分化可获 得各种
三、植物组织培养的发展简史
四个阶段
探索阶段（1902-1929年） 奠基阶段（1930-1960年） 迅速发展阶段（1960-1980） 生产上广泛应用阶段(1980-今）
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1. 探索阶段（1902-1929年）
Haberlandt：
贡献： 提出细胞全能性假说 首次进行离体细胞培养
有不同的培养反应。 （6）植物种类的差异。 一般双子叶植物比单子叶植物
及裸子植物容易。
25
4、愈伤组织（Callus）培养
①愈伤组织生长过程
在脱分化的过程中，多形成Callus, 其细胞结构无明 显极性。
• （1）诱导期：细胞准备进行分裂， 细胞大小几乎不变，
生理生化变化大，迅速合成蛋白质和核酸。
RNA
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28
③愈伤组织的继代培养 在多数情况下，随着培养时间的延长，Callus长势
下降、褐变、分化和形态发生能力下降甚至死亡。主 要原因：染色体畸变，基因突变， 生理因素（代谢产 物），细胞或组织内激素平衡的改变，细胞对外源生 长物质的敏感性改变，培养基损耗等。
29
④愈伤组织形态发生 （1）准备：外层细胞分裂逐渐减慢并停止；内部较深
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2 、细胞分化（Cell differentiation）
①概念
（1） 分化：是指植物体各个部分出现异质性的现象，
包括细胞分化、组织分化和器官分化。
（2）细胞分化：指同一来源的细胞逐渐产生出形态结 构、功能特征各不相同的细胞类群的过程，其结果是 在空间上细胞产生差异，在时间上同一细胞与其从前 的状态有所不同。
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②影响细胞再分化因素： 从理论上讲，在离体培养条件下经过再分化可获 得各种
园艺植物组织培养ppt课件
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15
植物组织培养的应用原理
▪ 细胞的分化和形态建立：由脱分化的 细胞再分化出完整植株有两种途径：一 种叫做不定器官形成(adventitious organ formation)或叫做器官形成 (organogenesis)，即在愈伤组织的不 同部位分别形成独立形成不定根和不定 芽，另一种叫做体细胞胚胎发生 (somatic embryogenesis) ，即在愈 伤组织的表面形成类似于合子胚的结构， 我们称其为为体细胞胚，不定胚 (adventitious embryo)或胚状体 (embryo )，体细胞胚胎所经历的发育 阶段与合子胚相似，一般经历球形胚、 心型胚、鱼雷形胚和子叶胚4个发育阶段。
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21
奠基阶段
▪ 20世纪50年代开始以后
1952年Morel和Martin
1953-1954年Muir 1955年Miller 1957年skoog和Miller
1958年Steward
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22
迅速发展阶段
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1
绪论 第一章、实验室设备和基本操作技术 第二章、植物组织器官培养 第三章、茎尖分生组织 第四章、单倍体细胞培养 第五章、细胞培养 第六章、种质保存 第七章、组培苗工厂化生产的经营与管理
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2
参考书
✓ 植物细胞组织培养， 刘庆昌、吴国良，中国农业大 学出版社，2003.1
11
组织培养类型
➢ 根据培养方法
1 平板培养 2 微室培养 3 悬浮培养 4 单细胞培养
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12
组织培养类型
➢ 根据培养基的作用 :1 诱导培养; 2 增殖培养; 3 生根培养 ➢ 根据培养目的: 1 脱毒繁殖; 2 微体快繁; 3 试管育种;试管嫁接 ➢ 根据培养条件:1 光培养; 2 暗培养 ➢ 根据培养过程:1 初代培养;2 继代培养
《植物组织培养》课件
《植物组织培养》PPT课 件
通过植物组织培养，我们可以在无菌条件下培养和繁殖植物细胞、组织和器 官。这种技术在农业和科学研究中具有重要的意义。
培养的定义和意义
1 定义
植物组织培养是一种无菌条件下培养和繁殖植物细胞、组织和器官的技术。
2 意义
植物组织培养可以实现植物繁殖和改良，加快育种速度，解决病虫害和环境胁迫等问题。
植物组织培养的未来发展方向
基因工程
利用植物组织培养技术进 行基因编辑和转基因繁殖， 加速育种进程。
环境修复
利用植物组织培养技术繁 殖适应环境的植物品种， 用于环境修复和产药用植物和人工合成药 物，为医疗领域带来新的 可能性。
植物组织培养的历史和研究方法
1
历史
植物组织培养起源于20世纪50年代，经过多年的发展和研究，如今已广泛应用 于植物学和农业领域。
2
研究方法
常用的植物组织培养方法包括悬浮培养、固体培养、愈伤组织培养等，每种方法 都有其适用的场景。
植物激素的作用
生长素
促进细胞分裂和分化，调 控植物生长和发育。
赤霉素
促进植物伸长和营养物质 的转运。
细胞分裂素
促进细胞分裂和植物器官 的生长。
植物花卉组织培养技术及其应用
技术
植物花卉组织培养技术包括愈伤组织培养、鲜花 切花养护、芽体分化培养等，广泛应用于花卉生 产和观赏。
应用
植物花卉组织培养应用于兰花、玫瑰等种类的繁 殖和育种，有效提高了花卉产量和改良品种。
植物细胞休眠和复苏技术
1
休眠
植物细胞休眠是植物适应环境变化而
复苏
2
进入的一种休息状态，存在于种子、 芽和各种组织中。
植物细胞在适宜的环境条件下，从休
通过植物组织培养，我们可以在无菌条件下培养和繁殖植物细胞、组织和器 官。这种技术在农业和科学研究中具有重要的意义。
培养的定义和意义
1 定义
植物组织培养是一种无菌条件下培养和繁殖植物细胞、组织和器官的技术。
2 意义
植物组织培养可以实现植物繁殖和改良，加快育种速度，解决病虫害和环境胁迫等问题。
植物组织培养的未来发展方向
基因工程
利用植物组织培养技术进 行基因编辑和转基因繁殖， 加速育种进程。
环境修复
利用植物组织培养技术繁 殖适应环境的植物品种， 用于环境修复和产药用植物和人工合成药 物，为医疗领域带来新的 可能性。
植物组织培养的历史和研究方法
1
历史
植物组织培养起源于20世纪50年代，经过多年的发展和研究，如今已广泛应用 于植物学和农业领域。
2
研究方法
常用的植物组织培养方法包括悬浮培养、固体培养、愈伤组织培养等，每种方法 都有其适用的场景。
植物激素的作用
生长素
促进细胞分裂和分化，调 控植物生长和发育。
赤霉素
促进植物伸长和营养物质 的转运。
细胞分裂素
促进细胞分裂和植物器官 的生长。
植物花卉组织培养技术及其应用
技术
植物花卉组织培养技术包括愈伤组织培养、鲜花 切花养护、芽体分化培养等，广泛应用于花卉生 产和观赏。
应用
植物花卉组织培养应用于兰花、玫瑰等种类的繁 殖和育种，有效提高了花卉产量和改良品种。
植物细胞休眠和复苏技术
1
休眠
植物细胞休眠是植物适应环境变化而
复苏
2
进入的一种休息状态，存在于种子、 芽和各种组织中。
植物细胞在适宜的环境条件下，从休
本科课件-植物组织培养(完整)
• 1922年，植物离体组织培养取得了一些进展。德国人Kotte 和美国人Robbins两人同时分别独立地将分生组织作为外植 体。Kotte研究切下的根尖，如豌豆、玉米根尖，将它们放 在含有Knop溶液盐成分、葡萄糖、含氮化合物如天冬酰氨 酸、丙氨酸以及肉汁的各种营养液中。Kotte观察到根尖生 长持续了2周，但他没有进行继代培养。另一方面Robbins 通过继代，将玉米根尖离体培养了更长的时间，但随着时 间延长，生长量减少，最后消失。
① 组培技术是无菌操作技术。 ② 组培材料处于完全的异养状态。 ③ 组培材料可以是离体状态的器官、组织、细胞
或原生质体。 ④ 组织培养物可以形成克隆（clone，无性繁殖
系），也可以进行茎芽增殖或生根。
⑤ 组培容器内的气体和环境气体可通过封口材 料进行交换，相对湿度通常是几乎100％，因 此，组培苗叶片表面一般都无角质层或蜡质 层，且气孔保卫细胞功能缺乏，气孔始终都 是张开的。
• 外植体（explant）：用于离体培养的那部分植物 器官、组织或细胞。
• 愈伤组织（callus） ：是指外植体因受伤或在离体 培养时，其细胞进行活跃的分裂增殖而形成的一 种无特定结构和功能的组织。
0.1.2 植物组织培养的特点
• 采用微生物学的实验手段来操作植物离体 的器官、组织和细胞。
具体表现为以下方面：
0.2 植物组织培养的形成和发 展
开创阶段 （上世纪初－上世纪30年代末）
1. Schleiden 和Schwann
• 植物组织培养的理论基础源于德国植物学家 Schleiden和动物学家Schwann于1838-1839年提 出的细胞学说：一切生物都是由细胞构成，细 胞是生物体的基本功能单位，细胞只能由细胞 分裂而来。
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2.细胞分裂和生长
一般原生质体培养 2～7d后开始第一次分裂，但 开始第一次分裂的时间随植物的种类、分离原生 质体的材料、原生质体的质量、培养基的成分和 培养条件而异
用幼苗的下胚轴和子叶、幼根、悬浮培养的细胞、 未成熟种子的子叶等为材料分离的原生质体，一
般比叶肉分离的原生质体容易诱导分裂，第一次 分裂出现的时间较快
Rohm and Hass Co., Philadelphia, PA 19105, USA
来 源
绿色木霉 绿色木霉 绿色木霉 绿色木霉 根霉 黑曲霉 黑曲霉
生产厂家
Yakult Honsha Co. Ltd., Tokyo, Japan Yakult Honsha Co. Ltd., Tokyo, Japan
（如烟草、菊花、胡萝卜、矮牵牛等）也可 用完全展开的叶片作材料
用于分离原生质体的植物材料要培养在最佳
的光温条件下
二、预处理与酶解
酶
渗透压 调节
酶解
1.原生质体分离常用的商品酶
酶
纤维素酶类 Onozuka R-10 Onozuka RS Cellulysin Driselase 果胶酶类 Macerozyme R-10 Pectinase Pectolyase Y-23 半纤维素酶 Rhozyme HP-150 黑曲酶
3.酶解
材料预处理
有菌材料，则必须进行表面消毒处理
用黑暗处理、低温处理和不同光质照射等方法，
可提高某些材料原生质体的产量和活力 不同植物及材料类型预处理的方法不同
• 龙胆试管苗的叶片只有用4℃低温处理 • 甘蔗植株只有先在黑暗条件下培养12小时后分离的原生质
体才能分裂 • 马铃薯试管苗叶片需在黑暗下处理48h后分离原生质体， 才会获得较高的产量
培养过程中，通过调整液体培养基的渗透压来 调节培养物的渗透压以利于其进一步的生长和
发育。这种方法由于改善了培养物的通气和营 养环境，从而促进了原生质体的分裂和细胞团 的形成
悬滴培养法 微滴培养法 饲养层培养法
培养条件
培养温度保持在25-27℃，光照16h/d左右，
静置为主，但为了不使细胞聚集，最初几 天需经常轻轻摇动，以助通气
• 通过检测细胞壁的形成而确定原生质体的活力
酚藏花红染色法 伊凡蓝染色法 其它：胞质环流、呼吸代谢强度、光合活
性等
影响原生质体活力的因素
分离材料的生理状态 酶解的条件：酶质量、浓度、酶解温度和
时间、酶溶液的渗透压 分离条件：离心次数、离心速度、纯化方 法、分离持续时间 环境条件：操作环境的温度、分离用具的 影响
4周
5周
7周
夜来香原生质体培养
四、影响原生质体培养的主要因素 1.基因型
通过番茄与秘鲁番茄有性杂交后对性状分离的遗 传分析，证明其愈伤组织的再生能力是2个显性 基因所决定的（Koomneef M等，1987） Cheng和Veilleux（1991）对芙薯（S.Phurja） 原生质体的培养能力也做过遗传分析，并证明从 原生质体培养到形成愈伤组织是受到2个独立位 点的显性基因所控制（Cheng 等，1991）
缺点：不易观察细胞的发育过程
固体平板培养
固体培养也就是琼脂糖包埋培养。低熔点的琼脂糖 可在30℃左右融化与原生质体混合而不影响原生质 体的生命活动。混合后含有原生质体的培养基铺于 培养皿底部，封口后进行培养
优点：可以跟踪观察单个原生质体的发育情况，易 于统计原生质体的分裂频率和植板率
培养基糖醇变化对马铃薯原生质体细胞和出芽率 的影响
1.在只含甘露醇、蔗糖和肌醇的培养基中培养7d； 2.在含蔗糖、纤维二糖、葡萄糖、甘露醇、肌醇、木糖 醇和山梨醇的培养基中培养7d
二、原生质体培养方法
液体浅层培养
将含有原生质体的培养液在培养皿底部铺一薄层， 封口后进行培养
优点：操作简单，对原生质体的损伤小，且易于
Creisson等测定了200个马铃薯叶肉原生质体再生植株
的染色体数，其中具有正常染色体数（2n=48）的植株 占57％，非整倍体植株占43％，而且还有染色体结构的 变异 Fish等（1986）从178个马铃薯叶肉原生质体再生植株 中观察到具有正常染色体数（2n=48）的植株占63.6%， 非整倍体占36.4%，其中染色体数接近48的占8.4%，接 近96的占多数
二、原生质体的研究进展
植物原生质体培养研究中几个值得提出的重要成就
1880年，Hanstein首次起用原生质体(protoplast）一
词 1892年，Klercher用机械方法首次从藻类中分离得到原 生质体 1960年，Cocking首次应用酶法制备番茄根原生质体获 得成功 1971年，Takebe等首次得到烟草叶肉原生质体培养的 再生植株 1985年，Fujimura等获得第一例禾谷类作物－水稻原生 质体培养再生植株 1986年，Spangenberg等单个原生质体培养再生植株 在甘蓝型油菜上获得成功
添加新鲜培养基和转移培养物 缺点：原生质体分布不均匀，常常发生原生质体 之间的粘连现象而影响进一步的生长和发育。此 物，难以跟踪观察单个原生质体的发育情况
液体－固体双层培养
在培养皿底部铺一层琼脂糖固体培养基，再将原 生质体悬浮液滴于固体培养基表面
优点：固体培养基中的营养可以慢慢释放到液体 培养基中，如果在下层固体培养基中添加一定量 的活性炭，则可以吸附培养物产生的一些有害物 质，促进原生质体的分裂和细胞团的形成
这说明
①基因型不同对培养反应不同 ②原生质体来源不同培养难易不同 ③培养基与培养条件仍需不断完善
第四节 原生质体再生植株遗传及变异
染色体变异
植株表形性状变异
染色体变异
原生质体再生植株的倍性与分离原生质体的起始材 料有关 由茎尖、叶肉细胞分离的原生质体能较好地保持原 来的倍性 用悬浮培养细胞特别是长期继代培养的细胞系分离 的原生质体，较易出现染色体倍性及数目的变化
量的比值
三、原生质体的发育与植株再生
细胞壁再生
细胞分裂与生长
愈伤组织形成
植株再生
1.细胞壁再生
原生质体培养数小时后开始再生新的细胞壁，
一至数天内便可形成完整的细胞壁 电镜观察发现，原生质体培养数小时后新壁 开始形成，先是质膜合成形成细胞壁主要成 分的微纤维，然后转移到质膜表面进行聚合 作用产生多片层结构，以后在质膜与片层结 构之间或在膜上产生小纤维丝，逐渐形成不 定向的纤维团，最后形成完整的细胞壁
Grosser等（1984）报道三叶草叶肉原生质体再生植株为
二倍体（2n＝16），而由培养细胞分离的原生质体再生的 植株为四倍体（2n＝32）
原生质体再生植株的变异还与植物种类有关
佘建明等对粳型水稻77-170品系原生质体再生 植株R2代96株的根尖染色体数目进行了鉴定， 结果表明染色体倍性稳定，全部为二倍体 马铃薯原生质体再生植株的染色体变异程度较大
2.渗透压的调节
必要性：为了维持酶液的渗透压与细胞内渗透压的平
衡，必须使原生质体处于一个等渗环境中。因此，酶 解液中必须加入渗透压调节剂
常用的渗透压调节剂
①糖溶液系统：葡萄糖、甘露醇和山梨醇等 ②盐溶液系统：包括KCl、MgS04和KH2PO4等
使用浓度据植物材料而定，一般为0.2-0.8 mol/L
酶解
酶解时间
酶浓度
酶解温度
原则：利用尽可能低的酶浓度和尽可能短的酶解
时间来获得大量有活力的原生质体
酶 解 分 离 原 生 质 体
三、原生质体的收集和纯化
酶解后为将杂质和酶液去除，一般先将酶解
混合物通过一定孔径的筛网过滤，除去未消 化的细胞团和组织块等较大杂质，收集滤液 于离心管中 进一步分离纯化
第二节 原生质体的分离
基础材料准备
预处理与酶解
原生质体收集与纯化
原生质体活性测定
A Scheme of plant protoplast
一、用于分离原生质体的材料准备
材料来源：细胞分裂旺盛的外植体，如幼嫩
小苗的根、胚轴、子叶、幼叶等；处于快速 生长期的愈伤组织或悬浮细胞
对于容易培养、再生能力较强的双子叶植物
Calbiochem., San Diego, CA 92037, USA Irpex lutens Kayowa Hakko Kogyo Co., Tokyo, Japan
Yakylt Honsha Co. Ltd.,Tokyo, Japan Sigma Chemical Co., St. Louit, MO 63178,USA Kikkoman Shoyu Co.，Japan
据统计，目前已有49个科，146个属的320
多种植物经原生质体培养得到了再生植株 （1993） 其趋势仍以农作物和经济作物为主，但从 一年生向多年生、草本向木本、高等植物 向低等植物扩展
三、原生质体研究的意义
基础理论研究的实验体系 体细胞杂交 做为遗传转化的受体 无性系变异及突变体的筛选 分离细胞器
沉降法：甘露醇作为渗透压调节剂时
漂浮法：蔗糖作为渗透压调节剂时
梯度离心：利用比重不同的溶液，经离心后使原 生质体处在两液相的界面之间
完整的原生质体
四、原生质体活力测定
FDA染色法（荧光素二醋酸酯染色法）
酯酶 水解 荧光素
紫外光
荧光素
FDA
FDA
细胞核
完整、有活力 的原生质体
荧光增白剂（CFW）染色法
原生质存活、率密度及产量的测定
（一）双醋酸盐维生素
1.FDA活性染色 2.测定原生质体存活率 存活率=存活原生质体数/总原生质体数×100%
（二）测定原生质体的密度
原生质体的密度（个/ml）=（原生质体数/区域数） ×104 ×稀释倍数