04 实验四 酶的性质
合集下载
相关主题
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
We can observe enzyme specificities by using effect of alkaline protease and amylase catalyzing different substrates including the casein and starch in the experiment. Casein and starch are catalyzed by corresponding enzyme. We can identify starch hydrolysis by the color reaction of starch and iodine solution. The tyrosine, the hydrolysis produce of casein，can be testified by Folin reagent.
⑶ 稀释的唾液
【实验操作】
1．漱口后收集唾液，用小漏斗加脱脂棉过滤，用蒸馏水稀释5～20 倍(根据各人的酶活性而定)，混匀后备用。
2．取试管2支，各加稀释唾液2ml，一管直接加热煮沸，另一管置 冰浴中预冷5分钟。
3．另取4支试管，编号序号，按下表添加试剂：
步骤
1
试管编号
2
3
4
第一步
加1%淀粉液 20滴
本实验以蛋白酶和淀粉酶对相应底物蛋白质及淀粉的作用为例。来观察酶的特异性，实验 结果的检查根据酪蛋白水解生成酪氨酸，酪氨酸与福林试剂呈蓝色反应，淀粉能与碘起蓝色或
兰紫色反映来确定。
【实验材料】
1. 实验器材 试管及试管架；移液管； 烧杯；恒温水浴锅； 温度计 2. 实验试剂 ⑴ 1% 淀粉溶液：将1g淀粉溶解于100ml蒸馏水中。
实验四 酶的性质
【实验目的】
1.加深对酶的性质的认识。
2.掌握影响酶活力的各种因素及其原理。
一、酶的特异性
【实验原理】
酶的特异性是指酶对它所催化的反应以及底物结构有严格选择性，一种酶只对一种物质或 一类结构相似的物质起作用。酶比一般催化剂特异性强，因酶是一种蛋白质，结构复杂，在其 精细的空间构象中，存在一个特殊部分“活性部位”，能专一地与对应的底物结合，体现酶的特 异性。
1.0 1.0 1.0
pH10 缓冲液(ml)
1.0
蒸馏水 (ml)
2.0
1.0 1.0 1.0
1% 淀粉溶液(ml)
1.0 1.0
1/2000碱性蛋白酶 溶液(ml)
1.0
1.0
1/2000淀粉酶溶液 (ml)
1.0 1.0
2．将各管充分摇匀后，于40℃水浴中保温15分钟。 3．于3、4号管中各加碘溶液2滴，观察实验现象，做好记录。 4．于对照管及1、2号管各加入3.0mL 0.4M 三氯醋酸溶液，摇匀， 分别过滤，各吸取滤液1.0ml，加0.4M碳酸钠溶液5.0ml，福林试剂 1.0ml，摇匀，于40℃水浴保温15分钟。取出后观察三管的现象，并记 录。
⑺
福林试剂:
在1L容积的磨口回流瓶中加入50g钨酸钠
(Na2W04·2H20)、125g钼酸钠(Na2Mo04;2H20)、350ml蒸馏水、25ml 85％磷酸及50ml浓盐酸，充分混匀后回流10h。回流完毕，再加25g硫酸 锂、25ml蒸馏水及数滴液体溴，开口继续沸腾15分钟，以便驱除过量的 溴，冷却后定容到500ml，过滤，置于棕色瓶中暗处保存。使用前加4倍
⑵ 1%酪蛋白溶液: 称取酪蛋白1克于研钵中，先用少量蒸馏水湿润后， 慢慢加入 0.2mol/L NaOH 4ml，充分研磨，用蒸馏水洗入100ml容量瓶 中，放入水浴中煮沸15分钟,溶解后冷却，定容至100ml，保存于冰箱 内。
⑶ 1/2000碱性蛋白酶溶液: 精确称取干酶粉2克，加入pH10硼砂氢氧化钠 缓冲溶液10ml，在小烧杯中溶解，并用玻璃棒搅拌，静止片刻后，将上 层液小心倾入容量瓶中，残渣部分再加入少量缓冲液，如此反复搅拌溶 解4次，最后全部移入200ml容量瓶中。用缓冲溶液定容至刻度，充分摇 匀，用二层纱布或四层纱布过滤，吸取滤液5ml，移入100ml容量瓶中， 用蒸馏水稀释至刻度，所得液为稀释2000倍的酶液。 ⑷ pH10 硼砂氢氧化钠缓冲液：
【思考题】
1．什么是酶的最适温度、最适pH值？有何实际意义？ 2．影响酶的催化活性的因素有哪些？简要说明作用原理。
3．酶学实验必须注意控制哪些条件？为什么？
Experiment 4 Properties of Enzyme
【Purpose】
1．Intensify the knowledge of properties of enzyme. 2．Master the methods and principles of testing enzyme properties, and master enzyme specificities.
蒸馏水稀释。
⑻ 1/2000淀粉酶溶液：用蒸馏水作稀释溶剂，配制方法同碱性蛋白酶液相同。
⑼ 碘-碘化钾溶液: 称取碘10克，碘化钾20克，同溶于100m1蒸馏水
中，贮于棕色瓶内。使用前稀释10倍。
【实验操作】
1.取五支试管, 编号，按下表加入试剂：
试管编号
试剂
对照 1
2
3
4
1% 酪蛋白溶液(ml)
【注意事项】
1．每个人的唾液淀粉酶活性并不相同，有时差别很大，因此稀释 倍数可因个人情况而定。 2．少量的激动激或抑制剂就能影响酶的活性。但激动剂和抑制剂 不是绝对的，有些物质在低浓度时为某种酶的激动剂，而在高浓度时则 为该酶的抑制剂。对一种酶是激动剂，对另一种酶是抑制剂。 3．反应时间要准确，做酶学实验所用的器皿必需洁净、干燥，定 量准确。
加1%淀粉液20 滴
加1%淀粉 加1%淀粉液 液20滴 20滴
第二步
置于冰浴5分钟
置于37℃水浴5分钟
第三步
加预冷的唾液10滴
加唾液10 加煮沸唾液
滴
10滴
第四步
摇匀置于冰浴10分钟
摇匀置于37℃水浴10分 钟
移置37℃水浴
第五步 实验现象
10分钟 加碘液1滴
加碘液1滴
三、pH对酶活力的影响
【实验原理】
【实验操作】
取三支试管, 按下表加入试剂：
试管编号
试剂
1
2
3
1% 酪蛋白溶液(ml)
1.0
1.0
1.0
pH10 缓冲液(ml)
1.0
—
—
0.1M HCl(ml)
—
1.0
—
0.2M NaOH 溶液(ml)
—
—
1.0
1/2000碱性蛋白酶溶 液(ml)
1.0
1.0
1.0
实验现象
混合均匀后，于40℃水浴中保温15分钟。 然后每管各加入0.4M 三氯醋酸溶液3.0ml，分别过滤，各吸取滤液1.0ml，加0.4M碳酸钠溶液 5.0ml，福林试剂1.0ml，摇匀，于40℃水浴保温15分钟，观察现象，比 较在不同pH下，碱性蛋白酶活力的大小。
二、温度对酶活力的影响 【实验原理】 与大多数化学反应一样，温度对酶活性有显著影响。在一 定的温度范围，酶的活性通常随着温度的升高而升高，因为有 更多的分子成为活化分子。反之，下降。通常温度每升高 10℃，反应速度加快一倍左右，最后反应速度达到最大值。另
一方面，酶是一种蛋白质，温度提高可引起蛋白质变性，导致
酶活力受环境pH的影响，在一定pH下，酶表现最大活力，
高于或低于此pH，酶活力降低，通常把表现出酶最大活力的pH
称为该酶的最适pH。pH影响酶活力的主要原因有以下几个方
面，首先，pH影响酶分子活性部位上有关基团的解离，另外，
也影响底物的解离状态，从而影响酶活性中心与底物的结合或
催化。其次，有关基团解离状态的改变影响酶的空间构象，甚
―
―
1.0
1/2000碱性蛋白酶溶
1.0
1.0
1.0
液(ml)
实验结果
混合均匀后，于40℃水浴中保温15分钟. 然后每管各加入0.4M 三 氯醋酸溶液3.0ml，分别过滤，各吸取滤液1.0ml，加0.4M碳酸钠溶液 5.0ml，福林试剂1.0ml，摇匀，于40℃水浴保温15分钟。显色后用721 型分光光度计，在波长680nm处测定光密度（比色时，以蒸馏水作空 白）并记录。
至会使酶变性。尽管有一些酶能忍受较大的pH的变化，但大多
数酶保持活性的pH值范围很窄。正因如此，生物体使用缓冲液
调节体内的适宜pH值。 【实验材料】
1. 实验器材 试管及试管架；漏斗及滤纸；恒温水浴锅；温度计；移液管
2. 实验试剂
⑴ 1% 酪蛋白溶液：同酶的特异性实验
⑵ 1/2000碱性蛋白酶溶液：同酶的特异性实验 ⑶ pH10 硼砂氢氧化钠缓冲液: 同酶的特异性实验 ⑷ 0.1mol/L盐酸 ⑸ 0.2 mol/L 氢氧化钠溶液 ⑹ 0.4 mol/L碳酸钠溶液 ⑺ 0.4 mol/L三氯醋酸溶液 ⑻ 福林试剂: 同的酶特异性实验
四、激动剂和抑制剂对酶活力的影响
【实验原理】
许多物质能影响酶的催化活性，能加速酶的催化作用的物质称为激
动剂，能抑制酶的催化作用的物质称为抑制剂。本实验分别考察MnCl2 和HgCl2对碱性蛋白酶的激动和抑制作用。
【实验材料】
1. 实验器材
试管及试管架；漏斗及滤纸；恒温水浴锅；温度计；移液管；721分光光度计
2. 实验试剂
⑴ 1% 酪蛋白溶液：同酶特异性实验
⑵ 1/2000碱性蛋白酶溶液：同酶特异性实验
⑶ pH10 硼砂氢氧化钠缓冲液: 同酶特异性实验
⑷ 8×10-3M MnCl2溶液 ⑸ 8×10-3M HgCl2溶液 (6) 0.4 mol/L碳酸钠溶液
⑺ 0.4 mol/L三氯醋酸溶液
甲液（0.05moL/L硼砂溶液）：取硼砂(Na2B4O7·10H2O) 19克，用 蒸馏水溶解并定容至1000ml 。
乙液：0.2moL/L氢氧化钠溶液。 配制pH10硼砂-氢氧化钠溶液：吸取甲液50ml，再加入乙液21ml， 用蒸馏水定容至200ml。 ⑸ 0.4 mol/L碳酸钠溶液 (6) 0.4 mol/L三氯醋酸溶液
⑻ 福林试剂: 同酶的特异性实验
【实验操作】
取三支试管, 按下表加入试剂：
试管编号
试剂
1
2
3
1% 酪蛋白溶液(ml)
1.0
1.0
1.0
pH10 缓冲液(ml)
1.0
1.0
1.0
8×10-3M MnCl2 溶液
1.0
―
―
(ml)
8×10-3M HgCl2 溶液
―
1.0
―
(ml)
蒸馏水(ml)
粉酶催化淀粉水解生成各种不同大小分子糊精及麦芽糖，它们
遇碘各呈不同的颜色。从而判断淀粉酶是否存在及其酶活性大
小。 【实验材料】
1. 实验器材 试管及试管架；漏斗；烧杯；恒温水浴锅；温度计
2. 实验试剂 ⑴ 1% 淀粉溶液：同酶特异性实验
⑵ 碘-碘化钾溶液: 称取碘4克，碘化钾6克，同溶于100ml蒸馏水中， 贮于棕色瓶内。
酶活性逐渐丧失。因此，每种酶都有它的最适温度，即酶促反
应速度达最大值时的温度。如果反应温度超过最适温度，随着
温度的升高，反应速度逐渐下降，以至完全停止反应。通常酶
的最适温度接近于它所存在的生物体的温度，比如，人体中的
大多数酶的最适温度是37℃左右。本实验以唾液淀粉酶在不同
温度下对淀粉的作用为例，观察温度对酶活性的影响, 唾液淀
ⅠEnzyme Specificity
【Principle】
Enzymes are highly specific both in the reactions that they catalyze and in their choice of reactants, which are called substrates. An enzyme usually catalyzes a single chemical reaction or a set of closely related reactions. Catalysis takes place at a particular site on the enzyme called the active site .The specificity of an enzyme is due to the precise interaction of the substrate with the active site of the enzyme. This precision is a result of the intricate three-dimensional structure of the enzyme protein.
⑶ 稀释的唾液
【实验操作】
1．漱口后收集唾液，用小漏斗加脱脂棉过滤，用蒸馏水稀释5～20 倍(根据各人的酶活性而定)，混匀后备用。
2．取试管2支，各加稀释唾液2ml，一管直接加热煮沸，另一管置 冰浴中预冷5分钟。
3．另取4支试管，编号序号，按下表添加试剂：
步骤
1
试管编号
2
3
4
第一步
加1%淀粉液 20滴
本实验以蛋白酶和淀粉酶对相应底物蛋白质及淀粉的作用为例。来观察酶的特异性，实验 结果的检查根据酪蛋白水解生成酪氨酸，酪氨酸与福林试剂呈蓝色反应，淀粉能与碘起蓝色或
兰紫色反映来确定。
【实验材料】
1. 实验器材 试管及试管架；移液管； 烧杯；恒温水浴锅； 温度计 2. 实验试剂 ⑴ 1% 淀粉溶液：将1g淀粉溶解于100ml蒸馏水中。
实验四 酶的性质
【实验目的】
1.加深对酶的性质的认识。
2.掌握影响酶活力的各种因素及其原理。
一、酶的特异性
【实验原理】
酶的特异性是指酶对它所催化的反应以及底物结构有严格选择性，一种酶只对一种物质或 一类结构相似的物质起作用。酶比一般催化剂特异性强，因酶是一种蛋白质，结构复杂，在其 精细的空间构象中，存在一个特殊部分“活性部位”，能专一地与对应的底物结合，体现酶的特 异性。
1.0 1.0 1.0
pH10 缓冲液(ml)
1.0
蒸馏水 (ml)
2.0
1.0 1.0 1.0
1% 淀粉溶液(ml)
1.0 1.0
1/2000碱性蛋白酶 溶液(ml)
1.0
1.0
1/2000淀粉酶溶液 (ml)
1.0 1.0
2．将各管充分摇匀后，于40℃水浴中保温15分钟。 3．于3、4号管中各加碘溶液2滴，观察实验现象，做好记录。 4．于对照管及1、2号管各加入3.0mL 0.4M 三氯醋酸溶液，摇匀， 分别过滤，各吸取滤液1.0ml，加0.4M碳酸钠溶液5.0ml，福林试剂 1.0ml，摇匀，于40℃水浴保温15分钟。取出后观察三管的现象，并记 录。
⑺
福林试剂:
在1L容积的磨口回流瓶中加入50g钨酸钠
(Na2W04·2H20)、125g钼酸钠(Na2Mo04;2H20)、350ml蒸馏水、25ml 85％磷酸及50ml浓盐酸，充分混匀后回流10h。回流完毕，再加25g硫酸 锂、25ml蒸馏水及数滴液体溴，开口继续沸腾15分钟，以便驱除过量的 溴，冷却后定容到500ml，过滤，置于棕色瓶中暗处保存。使用前加4倍
⑵ 1%酪蛋白溶液: 称取酪蛋白1克于研钵中，先用少量蒸馏水湿润后， 慢慢加入 0.2mol/L NaOH 4ml，充分研磨，用蒸馏水洗入100ml容量瓶 中，放入水浴中煮沸15分钟,溶解后冷却，定容至100ml，保存于冰箱 内。
⑶ 1/2000碱性蛋白酶溶液: 精确称取干酶粉2克，加入pH10硼砂氢氧化钠 缓冲溶液10ml，在小烧杯中溶解，并用玻璃棒搅拌，静止片刻后，将上 层液小心倾入容量瓶中，残渣部分再加入少量缓冲液，如此反复搅拌溶 解4次，最后全部移入200ml容量瓶中。用缓冲溶液定容至刻度，充分摇 匀，用二层纱布或四层纱布过滤，吸取滤液5ml，移入100ml容量瓶中， 用蒸馏水稀释至刻度，所得液为稀释2000倍的酶液。 ⑷ pH10 硼砂氢氧化钠缓冲液：
【思考题】
1．什么是酶的最适温度、最适pH值？有何实际意义？ 2．影响酶的催化活性的因素有哪些？简要说明作用原理。
3．酶学实验必须注意控制哪些条件？为什么？
Experiment 4 Properties of Enzyme
【Purpose】
1．Intensify the knowledge of properties of enzyme. 2．Master the methods and principles of testing enzyme properties, and master enzyme specificities.
蒸馏水稀释。
⑻ 1/2000淀粉酶溶液：用蒸馏水作稀释溶剂，配制方法同碱性蛋白酶液相同。
⑼ 碘-碘化钾溶液: 称取碘10克，碘化钾20克，同溶于100m1蒸馏水
中，贮于棕色瓶内。使用前稀释10倍。
【实验操作】
1.取五支试管, 编号，按下表加入试剂：
试管编号
试剂
对照 1
2
3
4
1% 酪蛋白溶液(ml)
【注意事项】
1．每个人的唾液淀粉酶活性并不相同，有时差别很大，因此稀释 倍数可因个人情况而定。 2．少量的激动激或抑制剂就能影响酶的活性。但激动剂和抑制剂 不是绝对的，有些物质在低浓度时为某种酶的激动剂，而在高浓度时则 为该酶的抑制剂。对一种酶是激动剂，对另一种酶是抑制剂。 3．反应时间要准确，做酶学实验所用的器皿必需洁净、干燥，定 量准确。
加1%淀粉液20 滴
加1%淀粉 加1%淀粉液 液20滴 20滴
第二步
置于冰浴5分钟
置于37℃水浴5分钟
第三步
加预冷的唾液10滴
加唾液10 加煮沸唾液
滴
10滴
第四步
摇匀置于冰浴10分钟
摇匀置于37℃水浴10分 钟
移置37℃水浴
第五步 实验现象
10分钟 加碘液1滴
加碘液1滴
三、pH对酶活力的影响
【实验原理】
【实验操作】
取三支试管, 按下表加入试剂：
试管编号
试剂
1
2
3
1% 酪蛋白溶液(ml)
1.0
1.0
1.0
pH10 缓冲液(ml)
1.0
—
—
0.1M HCl(ml)
—
1.0
—
0.2M NaOH 溶液(ml)
—
—
1.0
1/2000碱性蛋白酶溶 液(ml)
1.0
1.0
1.0
实验现象
混合均匀后，于40℃水浴中保温15分钟。 然后每管各加入0.4M 三氯醋酸溶液3.0ml，分别过滤，各吸取滤液1.0ml，加0.4M碳酸钠溶液 5.0ml，福林试剂1.0ml，摇匀，于40℃水浴保温15分钟，观察现象，比 较在不同pH下，碱性蛋白酶活力的大小。
二、温度对酶活力的影响 【实验原理】 与大多数化学反应一样，温度对酶活性有显著影响。在一 定的温度范围，酶的活性通常随着温度的升高而升高，因为有 更多的分子成为活化分子。反之，下降。通常温度每升高 10℃，反应速度加快一倍左右，最后反应速度达到最大值。另
一方面，酶是一种蛋白质，温度提高可引起蛋白质变性，导致
酶活力受环境pH的影响，在一定pH下，酶表现最大活力，
高于或低于此pH，酶活力降低，通常把表现出酶最大活力的pH
称为该酶的最适pH。pH影响酶活力的主要原因有以下几个方
面，首先，pH影响酶分子活性部位上有关基团的解离，另外，
也影响底物的解离状态，从而影响酶活性中心与底物的结合或
催化。其次，有关基团解离状态的改变影响酶的空间构象，甚
―
―
1.0
1/2000碱性蛋白酶溶
1.0
1.0
1.0
液(ml)
实验结果
混合均匀后，于40℃水浴中保温15分钟. 然后每管各加入0.4M 三 氯醋酸溶液3.0ml，分别过滤，各吸取滤液1.0ml，加0.4M碳酸钠溶液 5.0ml，福林试剂1.0ml，摇匀，于40℃水浴保温15分钟。显色后用721 型分光光度计，在波长680nm处测定光密度（比色时，以蒸馏水作空 白）并记录。
至会使酶变性。尽管有一些酶能忍受较大的pH的变化，但大多
数酶保持活性的pH值范围很窄。正因如此，生物体使用缓冲液
调节体内的适宜pH值。 【实验材料】
1. 实验器材 试管及试管架；漏斗及滤纸；恒温水浴锅；温度计；移液管
2. 实验试剂
⑴ 1% 酪蛋白溶液：同酶的特异性实验
⑵ 1/2000碱性蛋白酶溶液：同酶的特异性实验 ⑶ pH10 硼砂氢氧化钠缓冲液: 同酶的特异性实验 ⑷ 0.1mol/L盐酸 ⑸ 0.2 mol/L 氢氧化钠溶液 ⑹ 0.4 mol/L碳酸钠溶液 ⑺ 0.4 mol/L三氯醋酸溶液 ⑻ 福林试剂: 同的酶特异性实验
四、激动剂和抑制剂对酶活力的影响
【实验原理】
许多物质能影响酶的催化活性，能加速酶的催化作用的物质称为激
动剂，能抑制酶的催化作用的物质称为抑制剂。本实验分别考察MnCl2 和HgCl2对碱性蛋白酶的激动和抑制作用。
【实验材料】
1. 实验器材
试管及试管架；漏斗及滤纸；恒温水浴锅；温度计；移液管；721分光光度计
2. 实验试剂
⑴ 1% 酪蛋白溶液：同酶特异性实验
⑵ 1/2000碱性蛋白酶溶液：同酶特异性实验
⑶ pH10 硼砂氢氧化钠缓冲液: 同酶特异性实验
⑷ 8×10-3M MnCl2溶液 ⑸ 8×10-3M HgCl2溶液 (6) 0.4 mol/L碳酸钠溶液
⑺ 0.4 mol/L三氯醋酸溶液
甲液（0.05moL/L硼砂溶液）：取硼砂(Na2B4O7·10H2O) 19克，用 蒸馏水溶解并定容至1000ml 。
乙液：0.2moL/L氢氧化钠溶液。 配制pH10硼砂-氢氧化钠溶液：吸取甲液50ml，再加入乙液21ml， 用蒸馏水定容至200ml。 ⑸ 0.4 mol/L碳酸钠溶液 (6) 0.4 mol/L三氯醋酸溶液
⑻ 福林试剂: 同酶的特异性实验
【实验操作】
取三支试管, 按下表加入试剂：
试管编号
试剂
1
2
3
1% 酪蛋白溶液(ml)
1.0
1.0
1.0
pH10 缓冲液(ml)
1.0
1.0
1.0
8×10-3M MnCl2 溶液
1.0
―
―
(ml)
8×10-3M HgCl2 溶液
―
1.0
―
(ml)
蒸馏水(ml)
粉酶催化淀粉水解生成各种不同大小分子糊精及麦芽糖，它们
遇碘各呈不同的颜色。从而判断淀粉酶是否存在及其酶活性大
小。 【实验材料】
1. 实验器材 试管及试管架；漏斗；烧杯；恒温水浴锅；温度计
2. 实验试剂 ⑴ 1% 淀粉溶液：同酶特异性实验
⑵ 碘-碘化钾溶液: 称取碘4克，碘化钾6克，同溶于100ml蒸馏水中， 贮于棕色瓶内。
酶活性逐渐丧失。因此，每种酶都有它的最适温度，即酶促反
应速度达最大值时的温度。如果反应温度超过最适温度，随着
温度的升高，反应速度逐渐下降，以至完全停止反应。通常酶
的最适温度接近于它所存在的生物体的温度，比如，人体中的
大多数酶的最适温度是37℃左右。本实验以唾液淀粉酶在不同
温度下对淀粉的作用为例，观察温度对酶活性的影响, 唾液淀
ⅠEnzyme Specificity
【Principle】
Enzymes are highly specific both in the reactions that they catalyze and in their choice of reactants, which are called substrates. An enzyme usually catalyzes a single chemical reaction or a set of closely related reactions. Catalysis takes place at a particular site on the enzyme called the active site .The specificity of an enzyme is due to the precise interaction of the substrate with the active site of the enzyme. This precision is a result of the intricate three-dimensional structure of the enzyme protein.