苹果茎痘病毒梨分离物和苹果茎沟病毒基于单克隆抗体的血清学检测技术

苹果茎痘病毒梨分离物和苹果茎沟病毒基于单克隆抗体的血清

学检测技术

近年来,果树病毒病在全世界广泛发生流行,造成水果产业的产量和品质严

重下降,甚至带来毁灭性的经济损失。其中,引起苹果茎痘病的苹果茎痘病毒(Apple stem pitting virus,ASPV)和引起苹果茎沟病的苹果茎沟病毒(Apple stem grooving Virus,ASGV)是果树病毒病中两种非常重要的病毒。

果树一旦感染病毒则终生带毒,且无药剂可防治,所以建立病毒的检测技术

和监控体系是果树病毒病防控的关键。血清学方法具有操作简单、快速、灵敏、

高通量等优点,是果树病毒检测和调查最实用的方法。

鉴于目前我国还没有建立ASPV和ASGV这两种病毒的血清学检测技术的现状,本论文利用杂交瘤技术分别制备了 ASPV和ASGV的单克隆抗体,并以制备单抗为核心分别建立这两种病毒的特异、灵敏的血清学检测技术,从为这两种病毒的果园诊断和检测、流行病学研究和科学防控体系建立提供物质和技术支撑。 1.ASPV 的单抗制备及其血清学检测技术:将ASPV梨分离物的外壳蛋白基因(CP)用原核表达载体pET-28a在大肠杆菌中进行表达,并用Ni2+-NTAagarose胶纯化,纯化蛋白作为免疫原免疫BALB/c小鼠。

经过细胞融合、筛选和克隆后获得4株分泌抗ASPV单抗的杂交瘤细胞株

(2H2,14C3,20G6和20F9)4株杂交瘤细胞分泌的单抗腹水的间接ELISA效价达

10-6,抗体类型及亚型为IgG1、κ链。Western blot分析表明,4株单抗均能与ASPV重组外壳蛋白和感染ASPV的梨树病叶中的病毒衣壳蛋白发生特异性免疫反应,不与感染ASGV、ACLSV和感染ASPV苹果分离物的苹果病叶和健康果树叶片发

生免疫反应。

以单抗为核心建立了检测ASPV的dot-ELISA、TAS-ELISA和DAS-ELISA方法,它们的检测感染ASPV梨病叶粗提液的灵敏度分别达到了 1:1,280、1:10,240和1:10,240倍稀释(w/v,g/ml)。应用建立的血清学方法对采自湖北武汉、北京和

陕西西安和浙江杭州的168份疑似病毒病样品进行检测,结果发现用血清学方法

检测到共有96份样品感染ASPV,且血清学方法的检测结果与RT-PCR检测结果的符合率达到94.8～96.9%,说明建立的血清学方法能有效、准确地检测梨树中的ASPV,且该病毒在我国果园发生普遍。

ASPV单抗的制备及其血清学检测技术的建立对我国ASPV梨分离物的检测、诊断和防控具有重要意义。 2.ASGV的单抗制备及其血清学检测技术:利用大肠杆菌原核表达的ASGV外壳蛋白作为抗原免疫小鼠和兔子,制备了两株抗ASGV的特异性单抗(9B10和19B10)和1个ASGV CP蛋白的兔多抗。

9B10和19B10单抗腹水的间接ELISA效价均达到10-7。2株单抗的抗体类

型及亚型均为IgG1、κ链。

单抗的特异性分析发现,2株单抗均能与感染ASGV果树病叶和重组表达的ASGV CP蛋白发生特异性免疫反应,而不与感染ASPV和ACLSV的果树病叶组织、健康苹果、梨树和柑橘的叶片组织粗提液发生任何免疫反应。以单抗为核心建立了检测ASGV的dot-ELISA和TAS-ELISA两种血清学方法。

其中dot-ELISA方法检测感染ASGV苹果和梨病叶粗提液的灵敏度达到了

1:640倍稀释,检测感染ASGV柑橘病叶的灵敏度达到1:2,560倍稀释(w/v,g/ml),而TAS-ELISA方法检测感染ASGV苹果和梨病叶的灵敏度达到了 1:5,120倍稀释(w/v,g/ml),检测感染ASGV柑橘病叶的灵敏度达到1:10,240倍稀释(w/v,g/ml)。对采自湖北、陕西、北京、浙江各地的187份疑似果树病叶样品进行血清学方法

的检测,共检测到79份样品显示ASGV阳性,且dot-ELISA和TAS-ELISA的检测结果和RT-PCR的结果符合率达到96.3%以上,说明建立的检测ASGV的血清学方法能有效、准确地检测果树中的ASGV。

ASGV单抗的制备及其血清学技术的建立为我国ASGV的诊断和检测、流行病学研究和无毒种苗的生产提供技术支撑。