大鼠视网膜神经细胞的原代培养(译文)

合集下载

新生大鼠小脑颗粒神经元原代培养与鉴定

［要］摘目的：立一种较为理想的小脑颗粒神经元原代培养方法。方珐：新生５～建取７天ＳＤ大鼠，离小脑皮质，酶消化后分胰
差速贴壁，植在预先涂有左旋多聚赖氨酸的培养板内，３天加入阿糖胞苷纯化神经元；用神经元特异性烯醇化酶免疫细种第采胞荧光技术鉴定神经元。结果：胞存活率达（８±１０）；４ｈ内基本贴壁；３天细胞突起增多、长；细９．７％２第变培养６～８天，胞细突起交织成网，成典型的神经细胞网络；经元特异性烯醇化酶鉴定神经元细胞占９％左右。结论：验获取神经元纯度形神０实较高，是小脑颗粒神经元体外培养的一种较理想的方法。［关键词］神经元；小脑颗粒神经元；细胞，养的；鼠培大［国图书资料分类法分类号］Ｒ３２８中２．５［献标识码］Ａ文
ｇａｕｅｎｕｏｒｅａｅｒｍ —７ｄａｌｒｇ — ｗｌｙｒｔｐｓ，ｈｅｅｌａｗａｅｄｏｎｎｅｍｉｅｔｓｎｚｄ，ｒｎｌｅｒｎｓｗｅｅｐｒｐｒｄｆｏ５ｙｏｄＳｐａｕｅＤａｅａｕｐｔｅｃｒｂｅｌｓｆｅｆｍｅｉｇｓ，ｎｃｄ，ｒｉｉｅｒｙｐｔｎｔｅｌｓｓｅｉｎｗａｅａｅｏｆｎｆｒｒｍｏｅａｙｇｉｌｃｌｓｄｉｓｃａｅｃｌｓｗｅｅｓｅｄｔｐａｅｈｅｈｅｃｌｕｐｎｓｏｓｐｒｐｌｔｄｆｒ３０ｎｏｅｖｎｌａｅｌ，ｓｏｉｔｄｅｌｒｅｄｅａｌｔｓｗｈｉｈｈｄｂｅｎｉｃａｅｐｒ — ｏｔｄｗｉｌ— ＬｓｎａａｎｏｙｃｔｓｎｅｗａｄｄｄｔｈｕｔｅｍｅｉｅｃａｅｔＰｏｙＬ— ｙｉｅ．ｒｂｉｓｌｙｏｉｓａｅｏｔｅｃｌｕｒｄｕｍｎｄａｆｅｅｄｉｇｆｒｉｈｉｉｉｎｏｏｎｕｏａｈｏｙ３ａｔｒｓｅｎｏｎｂｔｆｎｎ— ｅｒｎｌｏｃｌｖｓｏＮｅｒｎｓｗｅｅｉｅｉｅｕｏｓｃｆｃｅｌｓｍｎｎｆｕｒｓｅｅｔｃｉＲｅｕｔＴｈｕｒｉａａｅｏｈｅｃｌｓｗａｅｌｄｉｉｉｎ．ｕｏｒｄｎｔｄｂｙｎｅｒｎ—ｐｅｉｎｏａｅｉｍｏｏｅｃｎｃｅｈｎｃ．ｓｌｓ：ｅｓｖｖｌｒｔｆｔｅｌｓｉｆｉｌ

大鼠皮层神经元原代培养方法的改进

【关键词】细胞；培养的；神经系统；鼠大【中国图书分类法分类号】３８Ｒ３【文献标识码】Ａ【收稿日期】０７０ — ９２０ — １０
Ｉｒｖｍｅｔｆｒｃｌｒｆｐｉｒｅｒｎｆｎｗｂｒａｏｔａｉｓｅｍｐｏｅｎｏｕｔｅｏｒｕｍａｙｎｕｏｓｏｅｏｎｒｔｃｒｃｌｔｕｉｓ
【ｅｏｄ】ｅｓＣｌｒｄＮｒｏｓｓｓｍ；ａｓＫｙｗｒｓＣｌ；ｕｕｅ；ｅｖｕｙｔＲｔｌｔｅ
原代神经元具有良好的生物可利用性。被越来越多地用做试验对象，其体外培养已成为神经科学尤其是神经药理学的重要手段之一。以往多用胎鼠进行神经细胞培养【但由于动物胚胎因饲养原因ｌ】，对母鼠不分别交配，胎鼠的胎龄不易掌握，故以及胎脑的面积亦较小，因此近年来用新生鼠代替胎鼠进行神经元原代培养的实验１渐增多，由于各种３但方法其说不一，的使用Ｂ７培养基添加剂［有的有２２１。使用阿糖胞苷，糖胞苷浓度亦有很大差异４为阿１，了寻求一种简单而理想的原代神经元培养方法，我们在以往培养方法的基础上对取材、化、械操消机作等方面进行了改进，得到了较理想的培养结果。
维普资讯
一
３２一９

进展研究一种新的纯化SD大鼠视网膜Müller细胞方法

进展研究一种新的纯化SD大鼠视网膜Müller细胞方法【摘要】目的探讨两种提纯SD大鼠视网膜Müller细胞培养方法的效率。

方法采用完全胰酶消化传代法和反复不完全胰酶消化传代法对SD大鼠视网膜Müller细胞进行纯化培养，1个月后行荧光激活流式细胞分选、RT-PCR和免疫荧光细胞化学检测，对Müller细胞的阳性率及纯度进行统计学分析。

结果荧光激活流式细胞分选检测显示，完全胰酶消化传代法获得视网膜Müller细胞的纯度为73.59%，而反复不完全胰酶消化传代法获得视网膜Müller细胞的纯度高达98.32%；荧光显微镜10倍下各分别选取10个非重叠视野，计算表达GS的细胞阳性率。

完全胰酶消化传代法GS阳性表达率为83.2%±5.16%，反复不完全胰酶消化传代法GS的阳性表达率为98.5%±1.08%，采用两样本近似t检验统计学分析，t=-8.94，P<0.005，两种方法差异有统计学意义。

结论反复不完全胰酶消化传代法更易获得高纯度的Müller细胞，具有细胞密度大、数量多、耗时短且细胞分布均匀等特点，该方法法是一种简单、快速、有效的原代细胞培养技术，可推广应用。

【关键词】传代；纯化；视网膜Müller细胞；胰酶消化Study of Purification culture of SD rat retinal retinal Müller cellsWANG Yu-jue，LI Xin，ZHANG Xue-yong（Department of Ophthalmology，Xiangya Hospital，Central South University，Changsha，Hunan Provice，410008，P.R.China，）Abstract：【Objective】 To compare the efficiency of two methods of purity culture of SD rat retinal Müller cells in vitro. 【Methods】 To purify SD rat retinal Müller cells，traditional pancreatic enzyme passage method and novel repeated pancreatic enzyme passage method were adopted，respectively. A month later，retinal Müller cells was detected by fluorescence-activated cell sorter（FACS），immunohistochemistry technology and RT-PCR to determine the purity. The purity of Müller cells cultured through two methods mentioned above was analyzed by SPSS13.0. 【Result】 FACS showed that the purity of Müller cells from traditional pancreatic enzyme passage method（Group A）was 73.59%，but from repeated pancreatic enzyme passage method（Group B）was 98.32%. Under the fluorescence microscope，about 81.8%±4.87% of the cells were GS positive in Group A，and about 97.6%±1.21% of the cells were GS positive in Group B. The two-sample approximate test analysis demonstrated that the difference between group A and group B was statistically significant（t=-8.94，<0.005）. 【Conclusion】 Repeated incomplete pancreatic enzyme passage method is a more simple and efficiently way to purify retinal Müller cells.Keywords：passage；purification；retinal Müller cell；trypsinizationMüller细胞是人和哺乳动物视网膜中最主要的神经胶质细胞，该细胞从内界膜延伸到外界膜，贯穿于整个视网膜，其突起广泛分布于视网膜内各类神经元胞体和纤维之间，与各神经元密切接触，使得其在维持视网膜神经元正常功能中发挥着重要的作用[1]。

大鼠脊髓神经元的原代无血清培养及鉴定

但由于血清成分复杂，在许多未知因素，存有时会干扰实验结
果，掩盖培养细胞潜在的生理功能。无血清培养的细胞活性及生理特性保持良好，具有较大的优越性。本课题组为了研究药物对脊髓损伤的保护作用，无血清培养方法，用建立了Ｗｉａ大鼠胎鼠的脊髓神经元体外分散培养模型，ｓｒｔ并对其进行了形态学观察，为今后的相关研究奠定了基础。
长良好，７天神经元纯度达９％以上。结论第５机械分离无血清培养神经元的方法具有简便可行，结果稳定的优点，可作
ｍｎ吸除消化液，ｉ，用含血清的培养基终止消化，加完全培养基
反复吹打制成单细胞悬液。２０目不锈钢筛网过滤，细胞０使充分分离。取１ｌ０细胞悬液与等量４％台盼蓝｝匀后计数昆活细胞数，调整细胞密度至４×１・～，０Ｌ接种于涂有多聚赖氨酸的２４孔培养板，每孔加５ｌ０细胞悬液，再分别加４０５ｌ完全培养基，细胞接种密度为４×１・Ｌ使０～。培养板置恒温培养箱中３ ℃ ，％Ｃ：饱和湿度条件下进行开放培养。７５Ｏ，２后，４ｈ全量换１Ｔ％ＩＳ的无血清培养液。以后每隔２— ３ｄ进行１２量换液。选取不同时间点神经元在相差显微镜下观察／其形态变化并进行显微摄影。１４免疫组化染色．培养至第７天的细胞，进行神经元特异
圆形，体积小，透亮，无突起。在培养１２～２４ｈ后观察可见大
部分细胞贴壁，形态变得扁平，胞体呈椭圆形，围出现光晕，周

原代神经元培养

神经细胞原代培养从动物（大鼠或小鼠等）的胚胎或新生动物的脑组织取下某一局部区域，分离细胞，培养在培养容器后不再移植，常称为原代神经细胞培养。

一、培养前准备1. 器械和器皿器械：外科剪、镊子、虹膜剪等、小剪刀、细镊子和虹膜小刀等各种金属器械如解剖器械，使用后及时刷洗干净，用酒精棉球擦拭后晾干，或经60℃烘干，以防生锈。

由于湿热消毒对手术器械容易可用70－80％酒精浸泡1小时以上消毒。

器皿：1)玻璃瓶及相应的胶塞或胶木螺旋盖，2)用于分装血清、多聚赖氨酸、解剖液、各种盐溶液和培养液等。

3)培养瓶、盖玻片4)培养用的盖玻片必须不含铅、不发霉，可用0.2N盐酸浸泡10分钟，用蒸馏水洗2次，每次10分钟，然后移入丙酮或乙醇浸泡10分钟，再用双蒸水洗2次，每次10分钟，烘干待消毒。

凡组织学用过的旧盖玻片一般不用。

5)移液管、吸管、烧杯、离心管和培养皿。

6)塑料培养皿（35mm）、塑料培养板（6、24、96孔）。

辅助工具：放置试管、吸管和玻璃瓶等的架子。

2. 培养基和培养用液的配制1) 培养基质：有多聚赖氨酸、牛皮胶原和鼠尾胶原。

本室目前常用分子量为7-140000多聚赖氨酸（Poly-L-lysine，浓度为0.1mg/ml。

2) 平衡盐溶液：主要以无机盐和葡萄糖配制而成。

各种平衡盐溶液主要的不同点在于NaCl的浓度、离子浓度及缓冲系统的不同，可根据实际需要选用适当的平衡盐溶液。

3) 培养液：目前已有现成的干粉出售，按说明书进行配制即可。

神经细胞培养需高糖，培养液应含有或加葡萄糖至6g/L。

目前培养海马神经元可选用B27无血清培养液。

4) 血清：有胎牛血清、小牛血清和马血清等。

分装成小瓶，4℃保存备用（分装前需56℃灭活30分钟）。

5) 胰蛋白酶溶液：用于分离细胞。

先用少量灭菌三蒸水将胰蛋白酶粉末溶成糊状，然后补水至2.5%浓度，振荡摇匀，4℃过夜，待完全溶解后用滤器过滤灭菌，并分装成1-2ml冻存。

用前以D-Hanks平衡盐水或其他无钙镁离子溶液溶解稀释至0.25%或0.125%。

大鼠大脑皮层星形胶质细胞原代培养及传代

大鼠大脑皮层星形胶质细胞原代培养及传代、试剂Poly-L-lysine (Sigma,P2636)DMEM (Invitrogen,11995-065)二、器械手术器械：眼科剪x2、眼科镊直、弯各x2、显微镊x2 （金钟，WA3050）、显微剪x13ml 移液管( Biologix, 30-0138A1)南京军区总院神经内科实验室许丽丽 2012-12-011) 2) 3) FBS (Invitroge,10099-141)4) HBSS, no Calcium, no Magnesium (Invitrogen, 14170-112)5) 0.25% Trypsin-EDTA ( Invitrogen, 25200-056)6) DPBS (HyClone ，SH30028.01B )7) dd H 2O8) 75％酒精1) 2) 100 ml 小烧杯3) 200 目不锈钢筛4) 细胞计数器（求精）5) 50ml 离心管( Corning ， 430828)、 15ml 离心管( Corning ， 430790)6) 25ml 培养瓶( Corning ， 430639)或 75ml 培养瓶( Corning ， 430641)7) 100ml 玻璃瓶（蜀牛）8) 直径为 60mm 的培养皿 LabServ,310109010)9)10) 过滤器( Millex-GP, SLGP033R)B11) 注射器：50ml、5ml 各112) Pipette and pipette tips13) 冰袋、手套、口罩Day 11、消毒1.1 将解剖器械、枪头高温高压消毒15 分钟，消毒结束后放入烘箱中烘干待第二天使用。

1.2 打开操作台紫外线灯消毒30 分钟。

2、包被培养板2.1 戴手套，用酒精棉球擦拭操作台、移液枪，点燃酒精灯。

2.2取PLL用DPBS将其稀释至100 pg/ml 。

2.3以PLL包被培养瓶，量以覆盖培养瓶底面为宜。

大鼠神经元细胞的原代培养

实验五：大鼠神经元细胞的原代培养2010级硕士研究生，周二组，严森，122010000178原代培养的细胞会不可避免地存留少量异质细胞一同生长．为了后续实验结果的针对性和准确性，一般都需要对培养物进行纯化。

纯化神经元的方法有很多种，最简便及常用的是采用有丝分裂抑制剂阿糖胞苷来抑制异质细胞的存活和生长。

神经元的分化增殖完成于胚胎期，大部分神经元在出生后即为永久的分裂后细胞，但其他细胞则仍然不断地进行分裂增殖，使用有丝分裂抑制剂后，非神经元的细胞生长会受到抑制及淘汰，神经元由此得到纯化实验材料：Hanks液，DMEM培养基10ml，有刻度吸管两只，弯头吸管两只，无刻度吸管一只，新生乳鼠（24小时）0.05%胰酶，1%双抗，10%胎牛血清，培养皿，小烧杯，空的离心管，镊子，剪刀，酒精灯，酒精棉，实验前准备工作：肥皂洗手，新吉尔灭擦手，开通风柜，将吸管从套筒中取出放入各自对应的试管内，将橡皮塞安装到各自吸管上，酒精灯分别迅速灼烧，1配液Hanks液近40ml加1%双抗1ml，加完双抗的小吸管留作计数，在DMEM培养基中加10%胎牛血清（已配好，全部加入），从离心管取一滴碳酸氢钠调节pH值至溶液呈紫色，一离心管0.05%胰酶，2.取材。

乳鼠新生24小时。

3，洗涤剪碎，在培养皿中加入少许Hanks液洗涤，将乳鼠头部用酒精棉擦拭消毒，在乳鼠头部位置剪一个工字型切口，将皮肤颅骨沿着切口依次剪开剥离，取出大脑组织，并去除乳鼠的血管脑膜，用弯头吸管将Hanks液与剥离干净的脑组织移走到另一个干净的培养皿中，用弯头吸管洗走洗液，弯头吸管将含有脑组织的Hanks移入到小烧杯中剪碎，每个组织块近似一立方毫米，静置后洗走上面的Hanks液，（吸取Hanks液时勿将下面的组织块洗走），同样方法再用Hanks液洗涤一次4．酶解，加一离心管0.05%胰酶，将上述小烧杯中的组织液移入空置的离心管中，37摄氏度水浴10分钟，观察组织块是否变小，静置2分钟，使组织沉淀下来，弃掉上请胰酶后，加DMEM培养基（全部倒入）来中和胰酶，吹散组织液5.离心1200转每分钟，离心5分钟，弃掉上清液，沉淀后加Hanks液吹散重悬组织液，用同样的转速和时间在离心一次，加完全培养基3-4mL吹散，静置1分钟，以便消化大块组织6.计数，取0.1ml离心后的细胞液加入苔盘蓝染色，加样抢加0.1微升与计数板计数，同时剩余细胞液加入培养瓶中进行培养接种，标注好组别和时间，培养细胞的名称37摄氏度，二氧化碳培养箱中，下周实验课观察细胞培养情况。

大鼠大脑皮层神经元细胞原代培养

大鼠大脑皮层神经元细胞原代培养大鼠大脑皮层神经元细胞原代培养南京军区总院神经内科实验室许丽丽2012年10月一、试剂1)Poly-L-lysine（Sigma,P2636）2)DMEM（Invitrogen,11995-065）3)FBS（Invitroge,10099-141）4)Neurobasal（Invitrogen, 21103-049）5)B27（Invitrogen ,17504-044）6)GlutaMAX （Invitrogen ,35050-061）7)HBSS, no Calcium, no Magnesium（Invitrogen, 14170-112）8)0.25% Trypsin-EDTA （Invitrogen, 25200-056）9)DPBS（HyClone，SH30028.01B）10)dd H2O11)10％水合氯醛12)75％酒精二、器械1)手术器械：组织剪x2、组织镊x1、直弯镊各x1、眼科剪x2、眼科镊直、弯各x2、显微镊x2（金钟，WA3050）、显微剪x12)200 ml小烧杯（盛放胎鼠）3)200目不锈钢筛4)细胞计数器（求精）5)50ml离心管（Corning，430828）、15ml离心管（Corning，430790）6)6孔板（Corning，3516）或24孔板（Corning，3524）96孔板（cosrer,3599）7)直径为60mm的培养皿（LabServ,310109010）8)3ml移液管（Biologix, 30-0138A1）9)过滤器（Millex-GP, SLGP033RB）10)注射器：50ml、5ml各 111)Pipette and pipette tips12)冰袋、手套、棉球、棉签Day 11、消毒1.1 将解剖器械、枪头高温高压消毒15分钟，消毒结束后放入烘箱中烘干待第二天使用。

1.2 打开操作台紫外线灯消毒30分钟。

新生大鼠视网膜神经元的改良培养及鉴定

广
州
医
药
２１００年第４１卷第３期
・
・
３・
实验研究・
新生大鼠视网膜神经元的改良培养及鉴定
郭梦翔冯光强

广州市妇女儿童医疗中心眼科（１１０５０２）
【摘要】目的探讨新生大鼠视网膜神经元获取和体外培养的方法，为视网膜神经细胞的基础研究提供合
ｗｒｂａｎｄｂｎｙｉｅｔｎ，ｃｌｒｄｉｄａｏｅｅｏｔｉｅｙｅｚｍｅｄｇｓｉｏｕｔｅｎｍｅｉｆＤＭＥｕＭ／Ｆ２，ｉｖｓｉａｅｙｉｖｒｅｃｏｃｐｎ１ｎｅｔｔｄｂｅｔｄｍｉｒｓｏｅａｄｉｇｎｍｍｕｏｉｔｃｅｎｈｓｈｍ— ｏｉｔｔｉ．ｓｒｓａｎｙＲｅｕｔＲｅｉａｅｒｌｅｌｃｕｄｂｉｅｓｄａｎｅｌｓｓｅｓｎｂ．５％ｔｐｉｎ．２ｅｈｌｎｉ — ｓｓｌｔｌｕａｌｏｌｅｄｓｒｅＳｕｉａｕｐｎｉｙ０２ｎｎｃｓｐｌｏｒｓａｄ００％ｔｙｅｅｄａｙｎ
ｐｏｒｔｄｌｆｒｔｅｆｎａｎａｅｅｒｈｏｅｉａｅｒｌｃｌ．ｒｐｉｅｍｏｅｏｈｕｄｍｅｔｒｓａｃｆｔｌｎｕａｅｌａｌｒｎｓＭｅｈｏｓＲｅｉｎｅｒｌｅｌｆｐｓｎｔｌｔｄｔｌｎｕａｌｏｏｔａａａｃｓ７～８ｄｙａａｓｒｔ

神经胶质细胞的原代培养

星形胶质细胞和小胶质细胞的原代培养
1、取新生24h内的C57BL/6J乳鼠，在超净工作台中用75％乙醇浸泡3～5min消毒，断头，无菌条件下用眼科剪小心剪开头骨，取两侧大脑，体视镜下剥除脑膜，取出大脑皮质置于盛有HBSS液的无菌培养皿内。

2、用预冷的HBSS液漂洗2次，剪碎大脑皮质制成糜状，以0.25％的胰酶液，1:4与不完全培养基混合，37℃消化15min，并用含有10％胎牛血清的DMEM/F12-K完全培养基终止消化，轻轻吹打。

3、800g离心5min，弃上清。

4、用DMEM／F12完全培养基制成单细胞悬液，以70目滤网过滤，吸取细胞悬液接种至预先已包被多聚赖氨酸的细胞培养瓶内，置37℃、5％CO2培养箱中培养。

0.5h后将培养基移至已包被多聚赖氨酸的细胞培养瓶内继续培养。

5、24h后轻柔换液。

以后每隔2～3d换一次培养液，且每次换液前用HBSS 液剧烈振荡洗涤2次，并在倒置显微镜下观察细胞生长情况。

6、7至8天后，当星形胶质细胞汇合并且覆盖的小胶质细胞暴露在星形胶质细胞层上或已经与星形胶质细胞层分离时，在轨道摇床上以180rpm摇动T25烧瓶120分钟以分离收集小胶质细胞。

加入新鲜的细胞培养基，并在240rpm下16小时继续摇动烧瓶以除去少突胶质细胞前体细胞（OPC）。

7、胰酶消化后的细胞移至培养皿中传代，培养2d后可用免疫荧光的方法进行细胞鉴定。

大鼠小胶质细胞原代培养及分离纯化实验方案

大鼠小胶质细胞原代培养及分离纯化实验方案经过相关文献阅读，参考了众多对于小胶质细胞培养方案，对比了不同方案的利弊优缺，整合了相对符合本实验室条件和实验要求的方法，如有其他变更方案，以修改后为准。

1.实验材料剪刀、小镊子、小毛刷、DMEM/F12培养液、胎牛血清、0.05% 胰蛋白酶、PBS液、恒温细胞培养箱、倒青霉素、链霉素、培养皿离心管、50 mL 细胞培养瓶、CO2置相差显微镜、细胞板、小鼠抗大鼠OX42单克隆抗体、SP免疫组化试剂盒和新生SD大鼠等2.实验步骤2.1小胶质细胞的混合培养取新生SD大鼠若干只(出生24h内),在无菌条件下断头, 迅速剪开颅骨, 取出脑组织至盛有冷PBS 液的培养皿中反复冲洗以去除血污; 再把全脑移入另一盛有PBS 液的培养皿中, 用小毛笔轻轻刷去脑表面的脑膜和血管, 用PBS液冲洗后剪去脑干仅留大脑半球; 用小剪刀充分剪碎脑组织, 加入比组织块总量多30~50倍的0.05% 胰酶, 再移入50 mL 离心管, 用吸管反复吹打消化至肉眼观察无明显的脑组织团块; 加入DMEM/F12 完全培养基(含10%胎牛血清、100U/mL 青霉素和100 ug/mL 链霉素) 终止消化, 再次反复吹打制成单细胞悬液, 配平, 1000 r/ min, 离心5min, 弃上清; 加定量完全培养液再次制成细胞悬液, 更具实验需要接种入若干个50 mL细胞培养瓶或者培养皿中, 置于5%CO恒温细胞培养箱( 372度) 培养; 3 h 后更换1 次培养液, 以后每3 d 换1 次液, 并在镜下观察细胞的生长和存活情况。

2.2小胶质细胞的分离和纯化细胞培养18 d~20d左右, 在倒置相差显微镜下可观察到混和胶质细胞培养物中出现细胞分层现象, 即底层为扁平、多种形状的、具有多个突起的大细胞(星型胶质细胞) , 而上层细胞明显偏小呈类圆形、折光性强, 附着于星型胶质细胞表面生长(小胶质细胞) ; 倒掉培养液, 用0.05%胰酶2~ 3 mL 消化, 边观察边轻轻晃动培养瓶, 等到贴附在星形胶质细胞上的小胶质细胞脱离下来, 将含漂浮的小胶质细胞的消化液转入10 mL离心管, 立刻用完全培养基终止消化。

新生大鼠海马神经元的原代培养方法

维普资讯
３Ｏ பைடு நூலகம்９
第３６卷第５期２００２年１０月
哈尔滨医科大学学报
ＪＯＵＲＮＡＬＯＦＨＡＲＮ艇ＤＩＢＩＣＡＬＵＮＶＥＲ１ＩＳＴＹ
Ｖｏ．６．１３Ｎｏ．５Ｏｃ．ｔ．
新生大鼠海马神经元的原代培养方法
用膜片钳全细胞记录方法观察培养好的神经元电生理学特性。结果培养的神经元胞体清晰，晕光明显，达了多表种电／－￣ｆ控和化学门控离子通道。结论Ｊ本实验方法简单、可靠，保持了神经元结构和功能特性。
［关键词】海马；原代培养方法；子通道离［中图分类号】４１Ｑ２［文献标识码】Ａ［文章编号】１０１０（０） — ３０００ — ９５２２００９ — ２００５
ｕｅａｕｎｔｈｒｃｅｓｔｒｄｆｃ．ｎｃａａｔｒ．ｎｉｏＫｅｒ：ｈｐｏａｕ，ｒｍａｙｃｌｒｔｄ，ｏｈｎｌｙｗｏｄｓｉｐｅｍｐｓｐｉｒｕｔｅｍｅｈｏｉｎｃａｎｅｕ、
ｔｒ．ＲｅｕｔＣｌｖｔｄｎｕｏｓｗｒｌａｄｅｐｅｓｄｄｆｒｎｏｔｇ－ａｅｄｃｅｃｌｇｔｄｉｎｕｅｓｌｓｕｔａｅｅ＿ｎｅｃｅｒａｘｒｓｅｉｅｔｖｌｅｇｔｄａｈｍｉａａｅｏｉｒｅｎｅａｎｃａｎｌ．ｎｌｓｏＴｅｍｅｈｄｗｅｉｔｄｃｅｅｉｓｌｄｔｓｂｅＮｕｏｓｋｐｈｏｄｓｕ — ｈｎｅｓＣｏｃｕｉｎｈｔｏｒｕｅｈｒｓｉｅａｕｔｌ．ｅｒｎｅｔｔｅｎｍｕｔｃｎｏｍｐｎｒａｒ

大鼠视网膜Müller细胞的培养与鉴定

室条件，报告如下。现
度按３１种于置于５培养瓶中。于３ × ０接Ｏｍｌ置７℃ 、Ｃ２５Ｏ的培养箱孵育，胞贴壁后换液。２３周后，胞到８以细～细Ｏ上融合，时可进行消化传代。此
１２２Ｍｔｌ．．ｉｅｌｒ细胞的传代培养：瓶内培养液吸出，）将ＩＩＨａｋ液冲洗贴壁细胞后，人０２的胰蛋白酶１５ｍｌｎｓ加．５．，３７℃ 消化约３５ｍｉ，～ｎ当细胞周边收缩，人含血清的培养加
维普资讯
ＪＵＮＯＵＮＸＤＣＵＩＥＳＴ２０ ‘ ；４２ＯＲＡＦＧＡＧＩＬＭＥＩＡＮＶＲＩＹ０７Ａｐ２（）ＬｒＲＳＩ
广
医
科
大
学
报
・２３・２
能参与多种病理过程如增殖性玻璃体视网膜病变、殖性糖增尿病视网膜病变，视网膜的病理、理过程中起着重要的在生
吹打消化１ｎ１Ｏ目筛网过滤，０ｍｉ，５然后常温下１００ｒｍｉ，０／ｎ离心５ｍｉ，集细胞沉淀，上清，含２胎牛血清的ｎ收弃用Ｏ
ＤＭＥ重悬细胞沉淀，打分散为单细胞悬液，整细胞密Ｍ吹调
作用［。ＭＯｌ细胞的体外培养技术可为视网膜病变的细１］ｉｒｅ胞生物学、育学和电生理学的研究提供一个重要的平台。发在本研究中，们参考国内外有关文献，本实验室探索、我在优化体外培养ＭＯｌｒ胞的技术和方法，后续研究建立实验ｉ细ｅ为

新生SD大鼠心肌细胞的原代培养

脏促血管生成作用的研究［Ｊ］．中西医结合心脑血管病杂志，２００５，
３（１１）：９６４—９６６．
作者简介：张彤，女，副主任医师，现工作于山东中医药大学附属医院（邮
编：２５００１１）；刘元峰、宋宪波，工作于山东中医药大学；苏文革、吴波、戴国华（通讯作者），工作于山东中医药大学附属医院（邮编：２５００１１）。（收稿日期：２０１３—０４ —０３）（本文编辑王雅洁）
［３］ＢｕｒａｓｈｎｉｋｏｖＡ，ＡｎｔｚｅｌｅｖｉｔｃｈＣ．ＢｌｏｃｋｏｆＩ（Ｋｓ）ｄｏｅｓｎｏｔｉｎｄｕｃｅ
ｅａｒｌｙａｆｔｅｒｄｅｐｏｌａｒｉｚａｔｉｏｎａｃｔｉｖｉｔｙｂｕｔｐｒｏｍｏｔｅｓｂｅｔａ— ａｄｒｅｎｅｒｇｉｃ
ｖａｓｃＥｌｅｃｔｒｏｐｈｙｓｉｏ１．２０００，１１（４）：４５８—４６５．
平，达到修复内皮功能的目的，提示其在治疗心肌梗死等严重缺血性疾病中有着较好的应用前景，但其促进ＥＰＣ归巢到心肌的
关键词：心肌细胞；原代培养；心肌细胞鉴定；Ａｃｔｉｎ免疫组化

反复胰蛋白酶消化法培养SD大鼠视网膜Muller细胞

沈阳医学院学报第１１卷３０ｍｉｎ，ＰＢＳ冲洗，过氧化氢阻断内源性过氧化物酶，ＰＢＳ冲洗，非免疫动物血清封闭１０ｒａｉｎ，滴加谷胺酰胺合成酶（ＧＳ，１：１００）（上海优宁维公司），４℃孵育过夜，ＳＰ二步法显色试剂盒（福建迈新公司），ＡＥＣ显色。

１．３形态学观察将不同生长时期的的Ｍｕｌｌｅｒ细胞置于荧光显微镜下，观察其贴壁状况和融合时间。

２结果接种４８ｈ内即有细胞贴壁，贴壁细胞长出突起，换液后细胞分裂旺盛，３天后细胞融合。

反复胰蛋白酶消化并弃去悬浮的细胞后，绝大多数细胞形态较一致，呈典型的扇状细胞形态。

传代３次后，胞体呈扁平不规则状，胞体较大胞浆丰富。

２．１免疫组织化学染色结果细胞传３代后，９０％的细胞谷胺酰胺合成酶染色阳性（图１）。

图１原代培养的Ｍｕｌｌｅｒ细胞荧光显微镜下的形态（ｘ２０）２．２形态学观察结果荧光显微镜下可见Ｍｕｌｌｅｒ细胞的胞体和突起逐渐在培养瓶壁上伸展，呈现出胞体较大、突起明显的细胞形态（图２）。

图２原代培养的Ｍｕｌｌｅｒ细胞谷氨酰胺合成酶的阳性表达（×加）３讨论３．１实验动物的选择ＳＤ大鼠作为研究Ｍｕｌｌｅｒ细胞的实验动物有其自身特点，虽然其视网膜上Ｍｕｌｌｅｒ细胞的表达水平较低，但由于其相对经济、取材容易，我们又对以往的取材方法加以改进，仍能得到较满意的Ｍｕｌｌｅｒ细胞。

３．２培养方法的改进常规的Ｍｕｌｌｅｒ细胞培养方法主要有组织块培养法和蛋白酶消化法两种。

在细胞的纯化方面主要是利用Ｍｕｌｌｅｒ细胞较其他细胞紧贴这一特点，采用机械的吹打方法：即在细胞贴壁后，用吸管反复吹打，使贴壁不紧的细胞和组织块悬浮，从而达到纯化的目的旧’３ｊ。

国内有用恒温摇床的方法纯化细胞，其原理基本一致Ｈ－。

我们考虑到Ｍｕｌｌｅｒ细胞在ＳＤ大鼠视网膜表达数量较低的特点，略去了机械吹打的中间步骤，并适当延长其贴壁时间，目的是首先获取数量较多的贴壁细胞，再在此基础上加以反复的胰蛋白酶消化，因为神经元等细胞相对脆弱，而Ｍｕｌｌｅｒ细胞对胰酶的耐受力较强，从而获得较多量稳定的Ｍｕｌｌｅｒ细胞。

大鼠肠神经系统神经元的原代培养及鉴定

二烯化，使无活性的Ｒｈｏ，Ｒａｓ蛋白在细胞质中积聚。导致细胞膜结构改变，阻断细胞信号传递、转录因子活化、基因表达、细胞增殖及凋亡等细胞的重要生理功能，从而发挥非降脂效应依赖的肾脏保护作用］。临床观察提示三组患者中Ｂ组和Ａ组治疗后尿１微球蛋白（ｅｔｌ — ＭＧ）、尿转铁蛋白（ＴＲＦ）和尿微量白蛋白（ＭＡ）比较水平均降低，差异有统计学意义（Ｐ均＜０．０１）。ｃ组和Ｂ组治疗后尿ｄ１微球蛋白（１．ＭＧ）、尿转铁蛋白（ＴＲＦ）和尿微量白蛋白（ＭＡ）
刘力生．中国高血压防治指南２０１０［Ｊ］．中华心血管病杂志．
ＴｙｌｉｃｋｉＬ，ＭａｎｉｔｉｕｓＪ，Ｌｙｓｉａｋ — ＳｚｙｄｌｏｗｓｋａＷ，ｅｔ１．ａＴｕｂｕｌａｒｉｎｊｕｒｙ：
Ｍｏｎｉｔ，２００３，９：１３５ — １４１．
ＳｋｏｖＫ，ＭｕｌｖａｎｙＭＪ．ＳｔｒｕｃｔｕｒｅｏｆｒｅｎａｌＡｆｆｅｒｅｎｔａｒｔｅｉｒｏｌｅｓｉｎｔｈｅ
・
３７４８・
齐齐哈尔医学院学报２０１６年第３７卷第３０期
ＪｏｕｒｎａｌｏｆＱｉｑｉｈａｒＵｎｉｖｅｒｓｉｔｖ０ｆＭｅｄｉｃｉｎｅ．２０１６．Ｖ０Ｉ．３７．Ｎｏ．３０

原代细胞的培养

原代细胞的培养原代细胞的培养不知道遭到多少研究生及博士生吐槽，其真实情况是，一边在超净工作台上哭，一边手上还在不停地提取原代细胞。

相比较细胞系细胞而言，原代细胞的培养周期长、成本高、摸索困难。

从大鼠的筛选分笼到母鼠受精怀孕，从孕育周期的看护到胎鼠的出生降临，从胎鼠脑组织的提取到神经细胞的培养，到最后的药物对原代细胞的作用机制研究。

这种复杂和辛苦的原代培养过程，其实也是最能反应药物在实验小白鼠上作用机制和效果最真实的反应。

1、大鼠的筛选和分笼首先是一个大笼子里放6只大鼠（5雌性，1雄性），每隔两天喂水和繁殖饲料，一星期给大鼠换一次垫料（给大鼠换垫料是体力活）。

舒适的空间和环境能让大鼠更好地繁殖，产下更多的胎鼠用于科学研究。

2、原代细胞的提取及培养原代细胞的提取一般是将胎鼠先用纯净水冲洗干净，在放进超净工作台处理。

先将胎鼠放入75%酒精消毒1min,再用手术剪刀将胎鼠的脑组织提取出来，放入遇冷的D-Hank's液中。

用手术剪刀将皮层的脑组织剪碎，加入等体积的0.25%胰酶进行消化，置于二氧化碳培养箱37℃培养。

（1）新生大鼠原代海马组织中神经干细胞的培养取新生24h内新生大鼠，75%乙醇浸泡消毒5min，用剪刀将头颅取下，剥离颅骨，暴露皮质下海马组织，于冰上快速取出组织放在遇冷的DMEM/F12或者PBS缓冲液中清洗，吸出置于15mLEP中，加入ACCUTASE1.5-2.0mL置于培养箱中，37℃、5%CO2混匀消化10min，取出混匀吹打组织块，1000r.5min-1离心，加入培养基重悬细胞过200目细胞筛（70μm），置于37℃、5%CO2培养箱中悬浮培养。

通过Nestin染色鉴定星形胶质细胞以确保纯度。

（2）大脑皮层原代星形胶质细胞培养细胞制备和培养从1 日龄新生Sprague-Dawley 大鼠的大脑皮层制备原代星形胶质细胞。

简而言之，分离大脑皮质并用0.25% 胰蛋白酶在37°C下消化15 分钟，然后通过70 μm 细胞过滤器过滤。

新生大鼠皮层神经元原代培养及糖-氧剥夺损伤模型的建立

新生大鼠皮层神经元原代培养及糖-氧剥夺损伤模型的建立目的建立较为简便的新生大鼠皮层神经元细胞原代培养方法并建立糖-氧剥夺细胞损伤模型。

方法取新生的大鼠（24 h）大脑皮层组织，消化后种植在多聚-L-赖氨酸包被的六孔培养皿上，用含10%胎牛血清DEME-HG液种植，4~8 h 后换再用含有B27的Neurobasal培养基维持饲养。

于不同时间点在倒置相差显微镜下观察形态变化，用免疫组化方法对神经元特异性标记物NSE染色鉴定。

选取培养第7 d的神经元随机分为不作处理的对照组和过糖-氧剥夺建立细胞损伤模型组，Western blotting检测NSE蛋白表达。

结果2~8 h神经元细胞贴壁，随着时间的延长，形态呈多变，突起逐渐增多，神经元突起间相互接触形成网络，培养7~10 d时神经元胞体最为丰满，通过免疫组化验证证明所分离培养的是神经元细胞。

糖-氧剥夺细胞损伤模型组NSE蛋白表达量较对照组NSE蛋白表达量明显降低。

结论该神经元方法简单易行，神经元纯度较高，并成功的建立糖-氧剥夺神经元损伤模型。

标签：神经元；原代培养；neurobasal培养基；B27；糖-氧剥夺；细胞模型神经元细胞培养技术是一种常用的技术，广泛用于神经系统疾病的细胞模型[1]，可为神经系统的发病机制和神经保护性药物的筛选提供良好的平台。

在以往关于缺血/缺氧脑损伤的研究中，主要集中在动物体内研究，虽然在体试验更接近动物的实际状态，但易受到其他因素影响。

体外原代培养神经元细胞，可以得到比较均一的细胞，可根据实验要求控制神经元细胞的生成，有利于动态观察神经元细胞的形态学变化，从而避免了体内研究的许多复杂因素的影响[2]。

1资料与方法1.1一般资料出生后新24 h内的SD大鼠，购于新疆医科大学实验动物中心；Neurobasal培养液、B27培养基添加剂、胎牛血清、0.25%胰酶、（life technology-GIBCO）；DEME高糖培养基（Hyclone）；神经元特异性烯醇化酶（NSE）多克隆抗体（abcam公司）；多聚-L-赖氨酸、SP免疫组化试剂盒、DAB 显色试剂盒（北京中杉生物技术有限公司）。

1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。

大鼠视网膜神经细胞的原代培养摘要目的:在前人建立的方法上优化SD 大鼠视网膜神经细胞体外培养的技术和方法，为后续研究提供实验基础。

方法:使用胰酶消化法分离新生1 ～ 3d SD 大鼠视网膜神经细胞，以DMEM/F12 为培养基体外培养，免疫组织化学染色的方法进行鉴定。

结果:观察光镜下培养的细胞贴壁生长，部分细胞伸出突起，且有些突起相互连接。

免疫细胞化学染色显示，培养的细胞大多数抗神经元特异性烯醇化酶(NSE) 抗体反应阳性。

结论:视网膜神经细胞体外培养成功为进一步进行视网膜疾病的研究创造了条件。

关键词:细胞培养; 视网膜神经元; 胰蛋白酶消化法; 神经元特异性烯醇化酶引言一个世纪前，从青蛙身上剥离的神经管片段仍能在生理液中维持几天的活性，使得越来越多的神经纤维得到的实时观测以来，体外培养技术已经广泛的应用于生物技术领域。

【1】在没有了完整动物的复杂性，体外培养的方法可以大大提高对视网膜的基本属性和环境的适应性的了解。

在体外系统中，这个界定的实验条件可以很容易设定和维持。

这提供了一个稳定的辅助药理学和分子操纵的平衡，同时保持了完整的组织复杂表型特征。

在这里我们根据一些成功方法报告探讨一下大鼠视网膜神经细胞的原代培养技术。

【2-3】材料与方法动物：实验中使用的所有SD大鼠幼崽均是从青岛实验动物中心根据眼科和视觉研究中动物的ARVO声明，同时保留了出生后1-3SD大鼠的相对温度和湿度条件下获得的SD大鼠幼崽材料：DMEM/F12培养液和胎牛血清购自Gibco公司（美国），兔抗大鼠神经元特异性烯醇化酶（NSE）单克隆抗体，兔抗大鼠神经胶质纤维酸性蛋白（GFAP）多克隆抗体，羊抗兔IgG 和HRP-链霉亲和素购自中山Goldbridge生物技术有限公司（北京，中国）。

所有其他试剂均为Sigma公司（圣路易斯，密苏里州，美国）。

方法：预涂层的聚-D-赖氨酸组织培养皿为了使视网膜神经细胞，紧贴组织培养皿，聚-D-赖氨酸添加到被预先放置盖玻片的24孔板的孔中。

10分钟后，去除聚-D-赖氨酸，凝固聚-D-赖氨酸孔用无菌蒸馏水冲洗三次，在37℃培养箱隔夜干燥，然后立即使用该板块。

视网膜剥离 1-3天后处死前被麻醉的SD大鼠被转移到Hank，s平衡盐溶液。

在无菌条件的光学显微镜下，用注射器的针头刺穿角膜的边缘来打开SD大鼠的每只眼睛。

然后用剪刀和镊子剪开针口，小心取出眼睛前部的眼角膜。

移除眼球和大部分晶状体后，剩下的两个松散的联结组织和视网膜色素上皮细胞层，轻轻地剥离开来，用镊子轻轻捏开，从而完全取出视网膜视神经组织。

视网膜的分离和培养在37℃下将视网膜放在0.125%的胰蛋白酶溶液中消化15分钟。

消化时间结束后，去除消化液，将组织移入Dulbecco's改良Eagle培养基：含10％胎牛血清及营养成分混合的F-12（DMEM/F12培养液），过400目细胞筛，1500rpm离心5分钟，弃上清，将细胞悬浮在含10％胎牛血清的DMEM/F12培养液中研磨。

用血球计数板检查细胞密度，并把细胞接种在细胞密度为1.0×106个/cm2的涂有聚-D-赖氨酸（0.1mg/ml）的24孔板中，放在37℃，CO2浓度为5%的加湿培养箱中培养。

培养的视网膜细胞也可能生长于盖玻片内的这些小孔之中。

在接种细胞后24小时,将5-溴-2'-脱氧尿苷（20μg /ml）加入培养基抑制非神经细胞。

48小时之后更换培养基。

以后，每两天更换一次培养基，每天用相差显微镜观察培养的细胞，随着时间的推移，观察比较所培养的细胞的形态的变化。

鉴定培养的视网膜神经细胞在体外培养三天后，一旦盖玻片上的单元格长有细胞，则该培养板作废，每个盖玻片用磷酸盐缓冲液（PBS）冲洗三次直至洗净。

培养的细胞在4％多聚甲醛固定20分钟，然后在3％过氧化氢中处理10分钟，以降低内源性过氧化物酶的活性再用PBS洗三次。

在室温下培养灭活5%正常山羊血清白蛋白10分钟，从而阻止其非特异性结合。

用鼠兔抗NSE单克隆抗体（1：50）和兔抗鼠GFAP的多克隆抗体（1：50）作为主要的抗体4℃保温培养过夜。

然后洗净盖玻片，再与生物素二抗（羊抗兔IgG抗体，1：100）处理30分钟，再在室温下与酶标链亲和素处理30分钟。

经过多次洗涤，颜色在3，3-二氨基四氢氯（DAB）作为辅助底物5分钟的作用下开始显现出来。

阴性对照，抗体被非免疫血清所取代。

使用显微镜检测盖玻片，并拍摄图片记录实验结果。

结果形态学结果刚开始细胞呈球形，均匀的分布在培养板上，4个小时之后，培养的细胞开始贴壁生长。

24个小时后，大部分细胞已经贴在培养板壁上，细胞形态从球形到三角形或多边形不断变化，未能贴壁的细胞将会被除去（如图1A所示）。

48个小时后，细胞都稳定的贴附在培养板上，并且在培养板上生长，这些都表现在细胞数量和细胞质的明显增加。

72个小时后，可以观察到小的神经轴突的生长，其中有一些彼此相互连接在一起（如图1B所示）。

在为期5天的细胞培养中，延伸的神经轴突和细胞数量逐渐较少（如图1C所示）。

7天之后，神经细胞死亡的比率开始增加，只有少数细胞存活（如图1D所示）。

免疫细胞化学染色检测结果当细胞培养3天后，大部分存活的细胞均为NSE阳性细胞，大约占91.5%，而GFAP阳性细胞仅占2.4%。

NSE阳性细胞有圆形或椭圆形，可以看到一些神经突起，GFAP阳性细胞呈扁平或梭形（如图2所示）。

阴性对照组无明显现象。

讨论在体外条件下视网膜组织在单层膜，分离的细胞，切片，重新聚合或移植培养的状态下均能够被培养。

在缺乏与其他类型的细胞相互作用的单个细胞的蛋白表达研究中，单层的视网膜培养是非常有效的。

此外，移植培养可保持在体外培养的视网膜细胞结构。

在组织三维重建和组织工程学中，视网膜重新聚合培养是十分重要的。

【4-5】上述培养体系具有自己的意义和优势，由于这种方法可以获得丰富的游离细胞，因此在进行细胞增值和凋亡检测时此种培养方法非常有效。

本文介绍的视网膜神经细胞培养体系的建立可以作为一个视网膜毒理学研究的一个模型系统。

原代培养的关键结果是所培养的细胞必须拥有足够长时间的功能和存活，以保证实验研究的进行。

在培养过程中，有一些重要的因素，可以影响的结果，其中视网膜细胞的分离就是最重要的一个因素。

酶消化法的常用来分离视网膜神经细胞。

最常用的酶是胰蛋白酶，但是胰蛋白酶的浓度和消化时间是影响细胞分离的关键因素，这在几个实验室有不同的实验报告。

【6-8】合适的胰蛋白酶浓度和消化时间可以产生数量相对较多且具有长时间活力和功能的神经细胞，反之，则会导致存活率降低，细胞膜损伤和细胞活性大大降低。

在实验中，我们使用0.125%的胰蛋白酶在0.02%的EDTA中反应15分钟。

结果表明，该方法效果十分显著。

在视网膜神经细胞培养过程中培养条件和培养基的选择是十分重要的通常选用DMEM/F-12培养基来对神经细胞进行培养。

DMEM/F-12不包含蛋白质，脂肪，或生长因子，因此，DMEM/F-12可能需要补充营养元素，通常用10％的胎牛血清（FBS），它的添加可以改善细胞的生长同时提高细胞在培养基中的生存能力。

但FBS中也有许多不确定因素，如外源性生长因子和激素，这会导致实验结果的巨大偏差。

因此，细胞培养中对无血清培养基的选用应该更加科学和谨慎。

此外，在体外细胞培养时，神经胶质细胞可以提供神经细胞的神经生长因子，以维持神经细胞的存活和促进神经轴突生长。

但是，胶质细胞的增生，能抑制神经细胞的生长和分化。

细胞接种24个小时后，向培养基中加入抑制非神经细胞和视网膜神经胶质细胞的5 - 溴-2'-脱氧尿苷( 20μg /ml)。

在许多不同的层面视网膜功能和疾病的研究会发现，从流行病学和种群遗传学到人类和整个动物实验的研究再到视网膜特定基因的个别碱基的作用，每种方法都有它的优点和缺点。

我们认为，采用离体的细胞培养系统进行研究，尤其是在原代神经细胞的培养能够成为一个极具价值的“水平”研究。

视网膜神经细胞体外培养成功有助于对视网膜疾病的研究。

参考文献1 Harrison RG． Obervation on the living developing nervefiber．Anat Rec 1970; 1( 2) : 116-1192 Leifer D，Dreyer EB，Lipton SA． Immunofluorescent characterization of retinal ganglion cell neuritis cultured on substrates coated with antibodies against Thy-1．Exp Neurol 199l; 113( 3) : 386-3903 Liu WW，Xu P，Huang Q． The cultivation of fetal and adult human retinal cells． Zhonghua Yandibing Zazhi 2002; 18( 4) : 279-2824 Layer PG， Willbold E． Regeneration of the avian retina by retinospheroid technology．Prog Retin Eye Res 1994; 13: 197-2295 Rieke M， Gottwald E， Weibezahn KF， Layer PG． Tissue reconstruction in3D-spheroids from rodent retina in a motion-free，bioreactor-based microstructure．Lab Chip 2008: 8( 12) : 2206-22136 Liu FL，Niu YJ，Wang JB，Qu H，Zhang L． Primary culture of retinal neuron cells of neonatal rat．Shandong Daxue Xuebao 2006; 44( 7) : 684-6887 Baptiste DC，Hartwiek AT． E，Jollimore CA． B，Baldridge WH， Chauhan BC， Tremblay F， Kelly M E． M． Comparison of the neuroprotective effects of adreneceptor drugs in retinal cell Culture and intact retina．Invest Ophthalmol Vis Sci 2002; 43( 8) : 2666-26768 Lilley S，Robbins J． The rat retinal ganglion cell in culture : An accessible CNS neuron．J Pharmacol Toxicol Methods 2005; 51( 3) : 209-220。