叶绿体分离与荧光染色观察

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科目细胞生物学实验题目叶绿体分离与荧光染色观察学号

叶绿体分离与荧光染色观察

一．实验目的

1．通过植物细胞叶绿体的分离与纯化，了解细胞器分离与纯化的原理和方法。

2．熟悉荧光显微镜的使用方法，观察叶绿体的自发荧光和次生荧光。

二．实验原理

1．叶绿体分离的原理

匀浆破碎细胞，利用差速离心方法分离等渗介质中的悬浮颗粒，收集类叶绿体大小的颗粒，得到叶绿体。

差速离心：颗粒在离心场中的沉降速率取决于颗粒的大小、形状和密度，也同离心力以及悬浮介质的粘度有关。在一给定的离心场中，同一

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时间内，密度和颗粒大小不同的颗粒其沉降速率不同。

依次增加离心力和离心时间，就能使非均一悬浮液中的颗粒按其大小、密度先后分批沉降在离心管底部，分批收集即可获得各种亚细胞组分。

叶绿体的分离应在等渗溶液（0.35mol/L的氯化钠或0.4mol/L的蔗糖溶液）中进行，以免渗透压的改变使叶绿体受到损伤。分离过程最好在0-5℃的条件下进行，如果在室温下，要迅速分离和观察。

2．差速离心

特点：介质密度均一，速度由高到低，逐级离心；

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用途：分离大小相差悬殊的细胞和细胞器；

沉降顺序：核----线粒体----溶酶体与过氧化物酶体----内质网与高尔基体---核蛋白体，可将细胞器初步分离，常需进一步通过密度梯度离心再行分离纯化。

3．荧光的概念

光致发光：某些物质在照射下，吸收光能进入激发态，当从激发态回到基态时，可以以电磁辐射的形式释放出吸收的光能，这种现象称为“光致发光”。紫外辐射、可见光及红外辐射均可引起光致发光，如磷光与荧光。

荧光：在光致发光中，如果一定波长的短波光（如紫外光）照射某种物质，这种物质吸收光能后进入激发态，并且立即退激发在极短的时间

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内能发射出比照射光波更长的光（如可见光），这种光就称为荧光。一旦停止入射光，发光现象也随之立即消失。荧光分为自发荧光或诱发荧光（次生荧光、续发荧光、间接荧光）。某些物质受激发光照射后可直接发出荧光，如叶绿素、血红素的火红色荧光或木质素的黄色荧光的等，称为自发荧光（直接荧光）某些物质本身不发荧光，但它经荧光染料染色后，再通过紫外线照射同样也能发出荧光，这样荧光称为诱发荧光，如叶绿体被咩啶橙染色后可发桔红色荧光。

4．荧光显微镜的操作及注意事项

（1）接通电源，打开启动装置开关；

（2）按starter按钮3-5秒以启动激发光源。注意starter键不能超过5秒。启动2-3分钟后

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方可稳定，启动15分钟内不得关闭电源，一旦关闭汞灯，3分钟内不得重启，用完后关闭main switch；

（3）选择相对应的激发虑片、阻断虑片和双色镜。放置样品，先在普通光镜下选择好要观察的视野；

（4）关闭普通光源后，撤开UV挡板，即可观察到样品的萤光情况，需要照相时，要及时拍照，否则可能拍不到萤光照片；

（5）观察结束后，关闭main switch，切断电源。

三．实验材料

1．材料

新鲜菠菜。

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2．试剂

（1）0.35mol/L的NaCl等渗溶液；

（2）0.01%吖啶橙（acridine orange）称取0.1g吖啶橙加蒸馏水100ml做母液，储存于棕色瓶，置4℃冰箱保存。临用前取1mL母液加1/15mol/L磷酸缓冲液（pH4.8）9mL。

3．器材

普通或高速离心机（九阳豆浆机）、荧光显微镜、研钵、滴管、漏斗、离心管，天平，量筒，纱布。

四．实验步骤

1．选取新鲜嫩绿的菠菜叶，去叶梗及其粗脉，洗净擦干，称取30g放于150ml0.35M.的NaCl 溶液中；

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2．将叶和液体同时装入组织捣碎机中（豆浆机中），匀浆3-5min，转速5000r/min；

3．将匀浆用纱布（6层）过滤于500ml烧杯中；4．将滤液4ml在1000r/min下离心2min；5．取上清液在3000r/min下离心5min（沉淀为叶绿体和细胞核混合物）；

6．将沉淀用2-3ml0.35M.的NaCl液悬浮；7．取一滴悬液滴片，加盖玻片后显微镜下观察；

8．另外取一滴悬液滴片，再加一滴0.01%的吖啶橙染料混匀，盖上盖玻片，在荧光显微镜下观察。

五．实验结果

1．实验结果如下图所示：

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图中

圆形

或椭图1普通光镜下叶绿体形态（10×40）

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图2荧光显微镜下叶绿体的自发荧光

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图3（1）荧光显微镜下叶绿体的次生荧光