共聚焦显微镜简介及免疫荧光染色

荧光探针的选择
选择荧光探针的主要步骤： 1、根据实验目的确定需要检测的目标； 2、确定可供选择的荧光探针的范围； 3、考察荧光探针的特性是否符合荧光样品的制备 要求； 4、荧光探针与所用共聚焦显微镜系统的匹配情况。
样品要求
样品经荧光标记 组织切片在载玻片上，用盖玻片封片 固定的或活的贴壁培养细胞应培养在共聚焦专用 小培养皿或盖玻片上 悬浮细胞，甩片或滴片后，用盖玻片封片
二、间接免疫荧光染色（FITC标记）
（4）滴加二抗 次日用PBS（5min×3）冲洗后，滴加用 PBS稀释的FITC标记的羊抗兔/鼠二抗， 37℃孵育60 min（避光）。 （5）染核并封片 用PBS（5min×3）冲洗后，滴加DAPI染 核5min, PBS冲洗（5min×3），滴加抗荧 光淬灭封片液。 （6）激光共聚焦显微镜拍照
LAS AF软件的基本界面
在生物医学中的主要应用
（一）原位鉴定细胞或组织内生物大分子、观察细胞及亚 细胞形态结构 1.细胞原位检测核酸 2.原位检测蛋白质、抗体及其他分子 3.检测细胞凋亡 4.细胞器观察及测定 5.观察细胞骨架 6.检测细胞融合 7.检测细胞内脂肪 （二）活体细胞或组织功能的实时动态监测 1.细胞内离子动态变化的测量 2.膜电位的测量 3.细胞内PH值的测定 4.检测细胞内活性氧物种的产生 5.检测药物等跨膜进入组织或细胞过程及其定位
（1）将A549细胞细胞培养于35 mm 激光共聚焦 培养皿中间的圆形凹槽里； （2）染色前吸除培养皿的培养液，用PBS洗2-3 次； （3）向培养皿中轻轻滴入Lyso-Tracker Red或 Fluo-4/AM工作液200μL，使其覆盖凹槽里 全部细胞； （4）37 ℃、5%CO2 培养箱中孵育30 min； （5）吸除染液，用PBS洗2-3次； （6）再用800μL的PBS覆盖凹槽里全部细胞， 用激光扫描共聚焦显微镜观察Ca2+的变 化。
日常保养及注意事项
短时间的停顿工作时，无需关闭系统。 只是做一些分析图片等工作时，无需打开激光器控 制钥匙，以减少激光器的损耗。 请避免使用外界存储设备（U盘，移动硬盘等）， 以免电脑受病毒感染。 请不要安装包含杀毒软件在内的任何未经软件生产 商授权和经Leica工程师认可的软件。
样品要求
载玻片厚度应在0.8～1.2mm之间，盖玻片应光洁， 厚度在0.17mm左右 标本不能太厚，如太厚激发光大部分消耗在标本 下部，而物镜直接观察到的上部不能充分激发 尽量去除非特异性荧光信号 封片剂多用甘油：PBS混合液（9：1)
激光共聚焦适用的器皿及要求
一、活细胞直接免疫荧光染色（溶酶体或钙离子）
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日常保养及注意事项
按照手册正确操作。如有疑问请及时联系 Leica 工程师，寻求专业帮助。 保证外部电源供应稳定。 由于环境的变化会影响各部件的相对位等，无论 工作与否请保持室内恒温，清洁，干燥。室温 22-25 摄氏度，相对湿度80%以下为宜。 使用一段时间后，精密器件可能会由于环境等因 数引起偏移，为保证仪器正常使用，请与 Leica 的专业工程师联系，及时调较仪器。 使用显微镜油镜后请用无水乙醇清洁镜头前部。
激光扫描共聚焦显微镜的基本特点
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观察方式：以荧光为主 光源：激光（紫外、可见光） 照明方式：点照明、逐点扫描 成像方式：共聚焦、逐点成像 输出：实时观测，数字化图像，可以进行 图像处理和定量分析 ������ 多重染色样品的观察
二、间接免疫荧光染色（FITC标记）
（1）收集细胞 收集细胞爬片，吸取各培养孔上清，PBS冲洗（ 5min×3），4%多聚甲醛固定20min，晾干后用。 （2）通透及封闭 取出细胞爬片，贴于载玻片上，用PBS（5min×3） 冲洗后，加入0.3% Triton X-100穿透细胞膜5min， PBS（5min×3），加入2% BSA封闭抗原30min。 （3）滴加一抗 滴加用PBS稀释的一抗，湿盒内4℃孵育过夜。每次 实验均作空对照白（PBS代替一抗）和同型对照（ 兔/鼠血清或IgG亚型代替一抗）。
共聚焦显微镜简介及免疫荧光染色
临床医学研究中心
德国Leica激光扫描共聚焦显微镜SP5 II简介
Fra Baidu bibliotek
基本参数
型号：德国Leica SP5 II 激光器：4个 发射波长400nm-800nm 物镜：10倍 20倍 63倍 通道：多通道 多色
系统：windows 7＋LAS AF 活体细胞装置：配有
基本功能
多荧光标记样品的高清晰度、高分辨率图像 采集 光学显微镜分辨率：0.25μm 共焦显微镜分辨率：0.18μm
基本功能
������ 定位、定量分析
基本功能
������ ������ 无损伤、连续光学切片，显微“CT” 三维重构成像
三维重构成像
基本功能
������ 像 活体细胞荧光染色的动态观察及快速扫描成