原生质体的制备
原生质体制备
拟南芥原生质体制备转化方法选取开花前生长良好情况的拟南芥（Columbia型）叶片，用刀片切成0.5-1 mm宽的叶条；浸于配置好的酶解液中（每5-10 mL酶解液约10-20片叶子）；暗箱抽真空，30 min；转移至室温，继续黑暗酶解3-5 h；当酶解液变绿时轻轻摇晃培养皿促使原生质体释放；加入等量的W5溶液稀释酶解液；用60-100目筛子（W5溶液润湿）过滤酶解液；将滤液转移至30 mL eppendorf管，500-700 g离心1-2 min，弃上清；加入10 mL预冷的W5溶液轻柔重悬原生质体；放于冰上静置30 min；保持室温在23℃以下；500 g离心8-10 min，弃上清；加入1 mL MMG溶液重悬原生质体（使其终浓度约在2×105个/mL）；即得到原生质体溶液。
用移液器吸取100 L的以上原生质体溶液于1.5 mL eppendorf管，加入10L DNA（10-20 g的质粒DNA），轻柔混合后，加入110 L PEG溶液，轻柔拍打eppendorf管使其混合完全；室温下诱导转化5-15 min；加入400-440 L W5溶液稀释转化混合液，轻柔颠倒，使之混合完好以终止转化反应；500 g离心2 min，弃上清；加入1 mL W5溶液悬浮清洗，500 g 离心2 min，弃上清；再用1 mL WI溶液轻柔重悬原生质体；室温（20-25℃）下，诱导载体表达18小时以上。
相关溶液配制PEG4000溶液（现用现配）组分用量PEG4000 1 g1 M CaCl20.25 mL0.8甘露醇0.625 mL水0.75 mL纤维素酶解液试剂15 mL酶液体系1-1.5 % Cellulase R10 (YaKult Honsha) 0.225 g 纤维素酶0.2-0.4 % Mecerozyme R10 (YaKult Honsha) 0.045 g 果胶酶0.4 M 甘露醇 1.09 g甘露醇干粉20 mM KCl 1 mL 0.3 M KCl20 mM MES, pH5.7 1 mL 0.3 M MES，pH5.7加水10 mL55℃水浴加热10 min，冷却至室温后加入以下试剂10 mM CaCl2 1 mL 0.15 M CaCl20.1% BSA 1 mL 1.5 % BSA5 mM β-巯基乙醇1mL 75 mM β-巯基乙醇用0.45 m滤膜过滤后即可使用。
一株内生真菌的原生质体制备及再生过程研究
一株内生真菌的原生质体制备及再生过程研究
材料准备：
内生真菌菌株
无菌工作台和器具（如培养皿、显微镜片、移液器等）无菌培养基（如琼脂、乳糖酸钠琼脂培养基等）
无菌培养液（如培养基溶液）
去离子水或无菌PBS缓冲液
培养基制备：
根据内生真菌的要求配制适宜的无菌培养基。
煮沸溶液中加入琼脂，并搅拌至溶解。
转移至培养器并加盖，进行高压灭菌。
菌种处理：
在无菌条件下，将内生真菌分离出来。
用无菌培养液或去离子水洗涤菌株，去除杂质。
原生质体制备：
将清洗后的菌株转移到含有少量无菌培养液的培养皿中。
用显微镜检查，确保菌株没有受到污染。
在无菌条件下，用移液器将菌株转移到新的培养皿中。
将培养皿置于振荡器中，以帮助分离真菌的原生质体。
过一段时间后，观察原生质体的形成情况。
原生质体再生：
将形成的原生质体转移到含有适宜培养基的培养皿中。
在适宜的温度（一般为25-30摄氏度）下，进行培养。
定期观察并记录原生质体再生的过程。
根据需要，可以进行进一步的培养和分离。
生物药物综合实验----植物原生质体的制备
实验原理
植物原生质体是指包在植物细胞壁内的生活物质， 植物原生质体是指包在植物细胞壁内的生活物质， 可通过混合酶液消化细胞壁而获得。 可通过混合酶液消化细胞壁而获得 。 原生质体经适宜的培 养能合成新壁，并进行细胞分裂， 养能合成新壁 ， 并进行细胞分裂 ， 经特殊诱导可生成完整 植株。 除去细胞壁后为原生质所包围的“裸露细胞”，是 植株。 除去细胞壁后为原生质所包围的“裸露细胞” 开展基础研究的理想材料。 开展基础研究的理想材料 。 其中酶解法分离原生质体是一 个常用的技术，其原理是植物细胞壁主要由纤维素、 个常用的技术 ， 其原理是植物细胞壁主要由纤维素 、 半纤 维素和果胶质组成，因而使用纤维素酶、 维素和果胶质组成 ， 因而使用纤维素酶 、 半纤维素酶和果 胶酶能降解细胞壁成分，除去细胞壁。 胶酶能降解细胞壁成分，除去细胞壁。
思考题名
1、简述植物原生质体制备的方法步骤； 简述植物原生质体制备的方法步骤； 按镜下观察绘制原生质体。 2、按镜下观察绘制原生质体。
实验结果
注意事项
1、从理论上讲，植物体的任何一部分都可以通过酶解作 从理论上讲， 用去除细胞壁而得到原生质体。但在实际操作中， 用去除细胞壁而得到原生质体。但在实际操作中，只有 幼嫩的组织才能完成去壁的过程。所以， 幼嫩的组织才能完成去壁的过程。所以，为了制备健康 的原生质体，一般选用根尖、茎尖、 的原生质体，一般选用根尖、茎尖、嫩叶及对数生长期 的愈伤组织为材料， 的愈伤组织为材料，一旦细胞具有木质化或次生加厚的 外壁，则不能被酶降解。因此， 外壁，则不能被酶降解。因此，取材成为实验成功与否 的首要问题。 的首要问题。 2、在离心过程中一定要注意转速。 在离心过程中一定要注意转速。
实验方法
1.材料称取与质壁分离 材料称取与质壁分离 称取0.5g材料，撕去叶下表皮，先切成大块， 0.5g材料 称取0.5g材料，撕去叶下表皮，先切成大块，蒸馏水 冲洗4 加入12%甘露醇，质壁分离0.5h 12%甘露醇 0.5h， 冲洗4-5次。加入12%甘露醇，质壁分离0.5h，滤去甘露醇 将材料用镊子夹取转入放有滤纸的培养皿中， ，将材料用镊子夹取转入放有滤纸的培养皿中，吸干叶片 表面水分，将材料切成0.5cm2 0.5cm2小块备用 表面水分，将材料切成0.5cm2小块备用
原生质体的制备
原生质体的制备
目的要求
掌握植物原生质体的分离制备
技术，观察原生质体的形态。
实验原理
分离原生质体常采用酶解法。其原理是根据由
纤维素酶、果胶酶和半纤维素酶配制而成的溶液对
细胞壁成分的降解作用，而使原生质体释放出来。 原生质体的产率和活力与材料来源、生理状态、酶 液的组成、以及原生质体收集方法有关。酶液通常 需要保持较高的渗透压，以使原生质体在分离前细
胞处于质壁分离状态，分离后不致膨胀破裂。渗透
剂常用甘露醇，山梨醇，葡萄糖或蔗糖。酶液中还 应含一定量的钙离子，来稳定原生质膜。游离出来
的原生质体可用过筛法收集。
实验用品
一、 材料
菠菜 二、器材
显微镜，擦镜纸，剪子，镊子，小平皿，吸管四 支，直式漏斗，300目尼龙网，10ml离心管，载 玻片，盖玻片。
三、试剂 1.洗涤液：甘露醇 0.6 M；CaCl2·2H2O 8 mM
NaH2PO4·H2O 2 Mm，pH 5.6
2.酶液：
实验方法
1、酶液的制备 2、材料准备 3、酶解
4、洗涤
观
察
纯 化 后 的 原 生 质 体
胚性愈伤组织亦是原生 质体分离的主要材料
思考题1、何为原生质体 Nhomakorabea2、分离得到的原生质体可有哪些用途？
3、为什么酶解材料时，酶解液要保持较 高的渗透压？
原生质体制备
原生质体的制备：1、选取3-4周长势良好的植株的展开叶片（通常选取第5~7片真叶）。
2、用新的锋利的刀子从叶片的中部切0.5-1 mm叶条，比较理想的情况下，每克新鲜叶片中大约含有107个原生质体（大约100-150个叶条在5-10 ml酶溶液中消化）。
对于常规实验，10-20个叶条消化在5-10 ml酶溶液中将得到0.5-1×106个原生质体，足够25-100个样品使用。
3、快速而温柔的转移叶条到准备好的酶溶液中（10-20叶条在5-10 ml酶液中），用平头镊子将叶条完全淹没。
4、用真空泵将叶条在黑暗中真空30 min。
5、室温下在黑暗中至少消化3 h（继续消化，不要摇晃）。
经过轻微转动后酶溶液应该变成绿色，这表明原生质体已经被释放。
6、用显微镜检查原生质体的释放（拟南芥叶肉的原生质体的大小大约为30-50μm）。
7、用等体积的W5溶液稀释酶溶液，通过过滤去除没有消化的叶片组织。
8、用水洗去75 μm尼龙过滤器中的酒精（通常浸泡在95%乙醇中）并去除过量的水，用W5溶液润洗过滤器后过滤原生质体。
9、将原生质体溶液转移到30 mL圆底离心管中，100×g离心5 min，尽可能的去除上清液。
10、用计数板进行细胞计数，每2×105个原生质体加入1 mL W5溶液，在冰，上静置30 min。
11、室温下沉降原生质体15 min，去除W5溶液，每2×105个原生质体加入1 mL MMG溶液重悬浮。
12、在2 mL离心管中分别加入10 mL DNA（5-10 kb的质粒DNA 10-20 mg）和100 mL原生质体（2×104个原生质体细胞），轻轻混匀。
13、加入110 mL PEG溶液，轻弹试管完全混匀。
14、室温下孵育转染混合物15 min（反应5 min足够）。
15、室温下，用400-440 mL W5溶液稀释转染混合物，轻轻摇动或倒置离心管混匀来停止转染过程。
植物原生质体的制备原理
植物原生质体的制备原理
植物原生质体的制备原理是利用生物学方法将植物细胞的质膜和细胞壁打破，使得细胞质与细胞器分离，获得纯净的细胞质。
具体制备原理如下：
1. 选择新鲜的植物组织，例如嫩叶片、根尖等，并将其切碎。
2. 将切碎的组织置于适当的缓冲液中，缓冲液中含有维持细胞渗透压的某些成分，如蔗糖。
3. 经过一定时间的培养，细胞内的质膜和细胞壁会被渗透液逐渐分解，从而使细胞质暴露在外。
4. 使用过滤纸或细孔滤网将悬浊液过滤，以去除细胞壁碎片和其他杂质。
5. 对滤液进行离心，以分离更纯净的细胞质。
6. 最后，将分离得到的细胞质保存在低温条件下，或进行后续的实验操作。
通过上述步骤，就可以制备得到植物原生质体，供后续的生物学研究和实验使用。
植物原生质体的制备
在分离原生质体的酶溶液内，需加入一定量的渗透稳定剂，其作用是保持原生质体膜的稳定，避免破裂。
常用的两种系统为：①糖溶液系统：包括甘露醇、山梨醇、蔗糖和葡萄糖等，浓度约在0．40～0．80mol／L。
本系统还可促进分离的原生质体再生细胞壁并继续分裂；②盐溶液系统：包括KCL、MgSO4和KH2PO4等。
其优点是获得的原生质体不受生理状态的影响，因而材料不必在严格的控制条件下栽培，不受植株年龄的影响，使某些酶有较大的活性使原生质体稳定。
另外，添加牛血清蛋白可减少或防止降解壁过程中对细胞器的破坏。
近年来多采用在盐溶液内进行原生质体分离，然后再用糖溶液作渗透稳定剂的培养基中培养。
通常在酶液中使用的等渗剂为0．55～0．6mol甘露醇。
原始pH值提高到7．0时生活的原生质体数量进一步增加，损伤的原生质体也少得多。
原生质体纯化常用过滤和离心相结合的方法，步骤大致如下：
1．将原生质体混合液经筛孔大小为40－100um的滤网过滤，以除去未消化的细胞团块和筛管、导管等杂质，收集滤液。
2．将收集到的滤液离心，转速以将原生质体沉淀而碎片等仍悬浮在上清液中为准，一般以500r／min离心15min。
用吸管谨慎地吸会上清液。
3．将离心下来的原生质体重新悬浮在洗液中（除不含酶外，其他成分和酶液相同），再次离心，去上清液，如此重复三次。
4．用培养基清洗一次，最后用培养基将原生质调到一定密度进行培养。
一般原生质体的培养密度为104～106／ml。
细菌原生质体的制备
细菌原生质体的制备要求：1、写出完整的原生质体的制备的实验操作步骤2、写出分离培养基及相关试剂所需的量、仪器和器皿所需的数量。
说明：通过实验一获得出发菌（细菌）之后，第二周再对该菌进行诱变，第三周再进行该菌的碳源谱、及抗药性测定（链霉素或青霉素），第四周再制备原生质体。
培养基与试剂 (1) 分离培养基采用牛肉膏蛋白胨固体培养基加0.2%可溶性淀粉 即牛肉膏3g、蛋白胨10g、NaCl 5g、可溶性淀粉2g溶于1000mL蒸馏水中 再加入15g琼脂粉 pH调至7.2 121℃灭菌15min 待冷却至50℃左右时 于超净工作台倒平板。
注: 先将可溶性淀粉加少量蒸馏水调成糊状 再加到溶化好的培养基中 调匀; (2) 分离培养基液体培养基采用牛肉膏蛋白胨固体培养基加0.2%可溶性淀粉,即牛肉膏3g、蛋白胨10g、NaCl 5g、可溶性淀粉2g溶于1000mL蒸馏水中 pH调至7.2,121℃灭菌15min。
(3) 检测试剂, 路戈氏碘液, 碘片1g ,碘化钾2g, 蒸馏水300mL。
配制方法: 先用少量35mL蒸馏水溶解碘化钾 ,再加入碘片 ,待碘片完全溶解后 ,加水稀释至300mL于棕色瓶内备用.实验方法: 1. 微生物的分离; 用梯度稀释法来分离淀粉酶产生菌。
取所采的土样5g加入到三角瓶中,加入无菌水45mL,30℃摇床振荡30min制成土壤悬液 ,此时的稀释度为10-1。
另取7支试管 分别记作10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7、10-8共8个梯度 每支试管内加入9mL无菌水。
用无菌移液管从三角瓶中吸取1mL土壤悬液加入到10-2试管中混匀, 再从此试管中吸取1mL加入到10-2试管中, 依此类推直至10-7试管。
分别从10-6、10-7、10-8三个稀释度的试管中吸取100uL悬液, 均匀涂布于分离培养基平板上, 于30℃培养36h 等长出菌落后, 将检测试剂卢戈氏碘液加入到平板中, 菌落周围形成水解圈的菌株即是产淀粉酶的菌株, 因淀粉遇碘变蓝色 ,如菌落周围有无色圈说明该菌能分解淀粉。
植物细胞原生质体的制备与融合
植物细胞原生质体的制备与融合。
1、相关概念：（1）原生质体：是指那些已去除全部细胞壁的细胞。
细胞外仅由细胞膜包裹，呈圆形，要在高渗液中才能维持细胞的相对稳定。
此外，在酶解过程中残存少量细胞壁的原生质体称为原生质球或球状体。
（2）原生质体融合：即体细胞杂交。
用人工的方法，把分离的不同品种或不同种的原生质体诱导成融合细胞，再经离体培养诱导分化和再生完整植株的整个过程。
若取材为体细胞，则成为体细胞杂交。
2、原生质体的制备：在植物组织里，原生质体被坚硬的细胞壁包裹着，而且由于果胶质等使细胞相互紧紧粘连在一起。
在愈伤组织中，这种粘连相对松些；在细胞悬浮培养物中，只有存在细胞团的情况下，有轻度的粘连。
如果破除这种粘连作用，即可使细胞分离开来，进一步去除细胞壁，就能使裸露的原生质体游离出来。
游离效率的高低主要与植物材料和酶混合浓的组成有关。
基本程序如下：取材→除菌→酶解（加酶、渗透压稳定剂）→原生质体的收集与纯化→洗涤→原生质体活力的测定。
（1）取材与除菌：原则上植物任何部位的外植体都可成为制备原生质体的材料。
但人们往往对活跃生长的器官和组织更感兴趣。
因为，由此制得的原生质体一般都生活力较强，再生与分生比例较高。
常用的外植体包括：种子根、子叶、下胚轴、胚细胞、花粉母细胞、悬浮培养细胞和嫩叶。
对外植体的除菌要因材而异，悬浮培养细胞一般无需除菌。
对较脏的外植体往往要先用肥皂水清洗再以清水洗2-3次，然后浸入70%酒精消毒后，再放进3%次氯酸钠处理。
最后用无菌水漂洗数次，并用无菌滤纸吸干。
（2）酶解：现以叶片为例说明如何制备植物原生质体。
①配制酶解反应液:反应液应是一种pH值在5.5-5.8的缓冲液，内含纤维素酶0.3%-3.0%以及渗透压稳定剂，细胞膜保护剂和表面活性剂等。
③酶解：除菌绿。
反应液转绿是酶解成功的一项重要指标，说明已有不少原生质体游离在反应液中。
经镜检确认后应及时终止反应，避免脆弱的原生质体受到更多的损害。
链霉菌原生质体的制备
链霉菌原生质体的制备透压极为敏感的球质体, 最外层是裸露的细胞物及细胞器缺损少, 修复能力高, 再生效果好。
质膜, 失去了细胞壁的原生质体, 染色体但由于菌种不同仍然存在差异。
如吸水链霉菌DN A在诱变剂作用下, 更易引起死亡突变, 敏感性提菌株及庆丰链霉菌的菌井冈变种的4 201 V A S高。
菌种的敏感性越高, 诱发突变的机会越大。
株, 以对数中期为好, 再生率为静止期的 40, 因此, 用原生质体代替孢子、菌丝细胞作为诱变 50 倍。
而菌株则以对数后期为好, 再生率 2 V A育种的材料, 能显著提高诱发突变的频率, 由于是静止期的 24 倍。
( ) 2菌丝的预处理链霉菌的破壁一般都去除了细胞壁, 原生质体膜易于融合, 即使没有接合、转化和转导等遗传系统也能发生基因组采用溶菌酶。
有些链霉菌种对溶菌酶敏感 , 如的融合重组。
庆丰链霉菌, 菌丝培养时不需经过预处理, 即可直接制备出原生质体。
但很多菌种对溶菌酶不用原生质体融合及诱变进行育种, 具有用孢子、菌丝的细胞融合、诱变育种不可替代的优敏感, 菌丝必须经过预处理。
方法有:越性。
? 在培养基中加入 0. 5%, 4% 的甘氨酸。
原生质体制备和再生的一般程序: 菌丝培具体浓度随菌种而异。
甘氨酸可以代替2丙氨 D养?菌丝悬液?离心得到菌丝沉淀?用蔗糖液酸掺入细胞壁, 破坏细胞壁肽聚糖短肽间的交洗涤两次?加酶液酶解一定时间得到原生质体联, 引起细胞壁结构的不完整以便于酶解脱壁。
悬液?原生质体的分离和离心收集?用高 ? 甘氨酸在增加菌丝对酶的敏感性的同时, 也P渗液重新悬浮原生质体?原生质体再生抑制菌丝的生长, 使菌丝量锐减。
因此为了减少1 原生质体的制备甘氨酸对菌丝生长的抑制作用, 培养基内加甘(1. 1 菌丝氨酸的量可酌情减少, 并同时增加过量蔗糖可( ) ) 能干扰细胞的正常代谢, 也得到相同效果。
? 1菌丝的培养时间处于不同生长时期分两次培养菌丝, 使得菌丝在新鲜培养基中能的菌体, 经过处理后都可以形成原生质体, 但其活性差异很大。
真菌原生质体制备技术
真菌原生质体制备技术
1．灭菌物品：
（1）大滤纸:
（2）灭菌针筒（含脱脂棉和玻璃钎维）
（3）脱脂棉
（4）离心管
（5）无菌ddH2O
（6） 0.6M MgSO4
（7）培养基：
A. 等渗培养基（RCM）：麦芽汁1%，酵母膏1%，蛋白胨0.4%，葡萄糖0.4%，pH自然，用0.6M蔗糖配制。
B. 破膜培养基：麦芽汁1%，酵母膏1%，蛋白胨0.4%，葡萄糖0.4%，pH自然，用水配制。
也可以采用含有0.6M蔗糖的PDA作为等渗培养基，破膜培养基不加0.6M蔗糖即可。
（8）溶壁酶酶液：1.5%，用0.6MMgSO4配制，过滤除菌；
（9）培养皿：根据样品个数
2．制备方法：
（1）称取离心管重量并记录；
（2）用接种针挑出菌丝，并用灭菌双蒸水冲洗一次，然后用无菌的0.6M MgSO4冲洗两次，用灭菌的滤纸吸干，放入已知重量的离心管，称重并记录；
（3）计算得到菌丝重量，按0.2（g）：1(mL)加入灭菌酶液，震荡均匀；
（4） 28℃，3~4小时，摇床震荡（轻微），酶解，同时每30min镜检观察原生质体数量；
（5）灭菌注射器（含脱脂棉和玻璃钎维）过滤；
（6）离心：2500rpm,2min
（7）用0.6M MgSO4洗涤沉淀3次；
（8）用用0.6M MgSO4定容至最初的加酶量；
（9）镜检计数；记录；
（10）涂板后再生培养，第7天后每隔1天计数一次。
细胞原生质体的制备(仅供参照)
细胞原生质体的制备—植物原生质体分离和活性鉴定一、实验目的1.学习植物细胞原生质体分离纯化的方法。
2.了解原生质体活性鉴定的原理。
3.了解植物原生质体分离、融合和培养的基本原理及其过程二、实验原理去掉植物细胞壁的方法可以是机械的人工操作，也可以利用酶解法。
较早利用机械法制备原生质体的酶解法分离原生质体是一个常用的技术，其原理是植物细胞壁主要由纤维素、半纤维素和果胶质组成，因而使用纤维素酶、半纤维素酶和果胶酶能降解细胞壁成分，除去细胞壁，即可得到原生质体。
由于原生质体内部与外界环境之间仅隔一层薄薄的细胞膜，必须保持在渗透压平衡的溶液中才能保持其完整性。
其次，还应当考虑取材、酶的种类和纯度、酶液的渗透压、酶解时间及温度等因素对分离原生质体的影响。
测定原生质体的活性有多种方法。
荧光素双醋酸酯(FDA)染色是常用的一种方法，FAD 本身无荧光，无极性，可透过完整的原生质膜。
一旦进入原生质体后，由于受到酯酶分解而产生具有荧光的极性物质荧光素。
它不能自由出入原生质膜，因此有活力的细胞能产生荧光，无活力的原生质体不能分解FAD无荧光产生。
PEG作为一种高分子化合物，20～50％的浓度能对原生质体产生瞬间冲击效应，原生质体很快发生收缩与粘连，随后用高Ca高pH法进行清洗．使原生质体融合得以完成。
PEG诱导融合的机理：PEG由于含有醚键而具负极性，与水、蛋白质和碳水化合物等一些正极化基团能形成氢键，当PEG分子足够长时，可阼为邻近原生质表面之间的分子桥而使之粘连。
PEG也能连接Ca2+等阳离子，Ca2+可在一些负极化基团和PEG之间形成桥，因而促进粘连。
在洗涤过程中，连接在原生质体膜上的PEG分子可被洗脱．这样将引起电荷的紊乱和再分布．从而引起原生质体融合：高Ca高pH由于增加了质膜的流动性，因而也大大提高了融合频率，洗涤时的渗透压冲击对融合也可能起作用。
原生质体分离纯化或融合后，在适当的培养基上应用合适的培养方法，能够再生细胞壁，并启动细胞持续分裂，直至形成细胞团，长成愈伤组织或胚状体，再分化发育成苗。
2 植物原生质体制备
实验二、植物原生质体制备
实验二、植物原生质体制备
1 材料与方法
1.1 材料
前一周培养的海藻籽发芽嫩叶及实验室准备的百合或者大花萱草花瓣。
实验在北京市北京科技大学理化楼120进行。
1.2 方法
1.2.1 试剂配制
将0.6mM 甘露醇、8m MCaCl2、7mM NaH2PO4•H2O、3mM MES加于干净的锥形瓶中，调节pH至5.6，配制成原生质体分离的母液。
在对实验材料进行酶解前，加入1.0%纤维素酶及0.6%离析酶。
去离子水处理材料作为对照。
1.2.2 材料酶解及观察
先将幼嫩的海藻叶片取下至小培养皿中，并尽量剪碎；用镊子尖头撕去花瓣表皮，另一小培养皿中尽量剪碎花肉。
取1ml加入酶的母液于离心管中，取少许剪碎的实验材料在室温下摇床振荡（40rpm）酶解2小时，每隔30min取少许溶液制片，显微镜观察原生质体的细胞形态并拍照（要注明放大倍数，以目镜×物镜倍数表示，如10×40）。
同时进行对照的观察，注意与对照进行比较。
2 结果与讨论
1。
原生质体制备试剂
原生质体制备试剂原生质体是一种无细胞壁的细胞结构，广泛存在于植物和动物细胞中。
由于其具有高度可溶性和膜通透性的特性，原生质体常被用于制备各种试剂。
本文将介绍原生质体制备试剂的方法和应用。
一、原生质体制备方法1. 细胞裂解法：将植物或动物组织加入裂解缓冲液中，通过机械方法（如超声波破碎、搅拌等）或化学方法（如酶解、酸碱处理等）使细胞壁破裂，释放出原生质体。
2. 离心法：将植物或动物组织进行离心分离，分离出含有原生质体的上清液。
3. 渗透法：通过调节渗透压使细胞膜溶胀，从而释放出原生质体。
4. 超滤法：利用超滤膜对细胞组织进行过滤，将原生质体截留在滤液中。
5. 分离培养法：通过细胞培养技术，将细胞分离培养，使原生质体在培养基中自由生长。
1. 酶活性测定：原生质体中含有多种酶，可以用于测定酶的活性。
例如，通过测定原生质体中过氧化物酶的活性，可以评估细胞氧化应激水平。
2. 蛋白质分析：原生质体中富含蛋白质，可以用于蛋白质的纯化和分析。
例如，可以通过原生质体制备试剂提取植物叶片中的叶绿素结合蛋白。
3. 药物筛选：原生质体可以用于药物的筛选和评估。
例如，通过测定原生质体对某种药物的敏感性，可以评估药物的毒性和疗效。
4. 细胞生物学研究：原生质体可以用于细胞生物学研究中的多个方面，如细胞分裂、细胞运动等。
例如，通过观察原生质体在不同条件下的形态变化，可以研究细胞的运动机制。
5. 基因工程：原生质体可以用于基因工程中的多个方面，如基因转染、基因表达等。
例如，可以利用原生质体制备试剂将外源基因导入植物细胞，实现基因的转染。
三、原生质体制备试剂的优势1. 高度可溶性：原生质体中的物质具有高度可溶性，便于提取和分析。
2. 膜通透性：原生质体的细胞膜具有较好的通透性，便于物质的进出。
3. 多功能性：原生质体中含有多种生物大分子，如蛋白质、核酸等，适用于多个领域的研究。
4. 细胞完整性：原生质体制备试剂可以保持细胞的完整性，不会破坏细胞内部结构。
《原生质体的制备》课件
选取动物组织
选择健康的动物组织作为制备 原生质体的材料。
酶解消化
将动物组织放入酶液中，在适 宜的温度和pH条件下进行酶 解消化。
洗涤和保存
清洗原生质体去除残留的酶液 和其他杂质，然后进行保存备 用。
微生物原生质体制备的步骤
选取微生物菌株
选择生长旺盛、无污 染的微生物菌株作为 制备原生质体的材料 。
成功案例2
在蓝细菌原生质体制备实验中，通过选择合适的酶种类和浓度，以及优化酶解和再生过程，成功制备 出可用于遗传转化实验的原生质体。
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实验过程中的注意事项
1 操作规范
在操作过程中，要严格遵守无菌操作规程，避免交叉污 染。
2 酶液处理
在操作过程中，要严格遵守无菌操作规程，避免交叉污 染。
3 离心条件
在操作过程中，要严格遵守无菌操作规程，避免交叉污 染。
4 温度控制
在操作过程中，要严格遵守无菌操作规程，避免交叉污 染。
实验后的处理事项
02
原生质体制备的实验材料
植物细胞原生质体制备所需的材料
酶
用于分解细胞壁，常用的酶包括 纤维素酶、果胶酶和离析酶等。
渗透压稳定剂
用于保持原生质体的稳定形态， 常用的渗透压稳定剂包括甘露醇 、山梨醇等。
01
植物组织
用于制备原生质体的材料，通常 选用幼嫩的叶片、茎段或根尖等 部位。
02
03
缓冲液
用于维持细胞内的酸碱平衡，常 用的缓冲液包括Tris-HCl和MES 等。
微生物原生质体制备所需的材料
微生物菌落
用于制备原生质体的材料，可以根据 实验需求选择不同的微生物菌落。
酶
用于分解细胞壁，常用的酶包括溶菌 酶、蜗牛酶等。
大蒜原生质体的制备实验
大蒜原生质体的制备实验一实验目的掌握大蒜植物原生质体分离过程二实验原理植物原生质体是除去细胞壁后为原生质所包围的“裸露细胞”，是开展基础研究的理想材料。
其中酶解法分离原生质体是一个常用的技术，植物细胞壁主要由纤维素、半纤维素和果胶质组成，因而使用纤维素酶、半纤维素酶和果胶酶能降解细胞壁成分，除去细胞壁。
三实验用品三角瓶、离心管、烧杯、200目滤网、解剖刀、长、短镊子、培养皿、滤纸、0.2μm滤膜、滤器、培养瓶（注：以上用品要进行高压灭菌）、台式离心机、高压灭菌锅、倒置显微镜、超静工作台，大蒜（取鳞茎生长点部分1-2 mm为宜）。
四实验步骤1.前期准备：大蒜取用材料的准备2．溶液及培养基的配制(3)20％蔗糖溶液(4) 无菌蒸馏水(5) 0.1% HgCl2注：以上（1）-（2）溶液均要用孔径0.2μm滤膜过滤以除去细菌。
（3）-（4）培养基等要进行高压灭菌3．原生质体的分离◆取大蒜无菌叶，切成薄片后，置于酶液中和摇床上（60～70rpm），在25～28℃黑暗条件下，酶解5～7h。
◆用200目网过滤除去未完全消化的残渣。
在1000rpm条件下离心5分钟，弃上清。
◆加入3～4ml l3％CPW洗液，相同条件下离心2-5分钟，弃上清，留1ml洗液。
◆用滴管将混有原生质体的1ml洗液吸也，轻轻铺于20％蔗糖溶液上(5ml离心管装3m120％蔗糖溶液)，在1000rpm条件下离心5—10分钟，由于密度梯度离心的作用，生活力强状态好的原生质体漂浮在20％的蔗糖与13％CPW之间，破碎的细胞残渣沉入管底。
◆用200μl移液器轻轻将状态好的原生质体吸出(注意尽可能不要吸入下层的蔗糖溶液)，放入另一干净的离心管中．加4ml l3％CPW洗液，1000rpm离心2-5分钟，弃上清．◆用血球计数板调整原生质体密度为105一106/ml之间。
观察。
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原生质体的制备
稳渗剂：0.6 mol/L甘露醇，121 ℃高温高压灭菌20 min后备用。
2%溶壁酶：在无菌操作台中称取溶壁酶（广东省微生物研究所生产），加入灭菌过的稳渗剂（甘露醇0.6 mol/L），最终使酶液浓度达到2%，再用0.22 µm 滤膜过滤除菌待用。
（观察锁状联合）乳酸石炭酸棉蓝染色液：石炭酸10 g，棉蓝0.02 g，甘油20 mL，乳酸10 mL，蒸馏水10 mL，将石炭酸加入蒸馏水中加热融化，之后加入乳酸和甘油，最后加入棉蓝，溶解备用。
原生质体制备
(1)将杏鲍菇菌丝接种于固体PDA培养基中，25℃培养5-7 d。
(2)活化后的菌丝接入液体PDA培养基中，25℃，120 rmp摇床培养5-6 d。
(3)将菌丝球倒入50 mL离心管中，10000 rpm 离心10 min，倒去上清液，再用无菌水、甘露醇各离心清洗一次。
(4)用灭菌滤纸吸干菌丝水分，称取0.2 g 菌丝放入10 ml 离心管中，再加入2 mL 2％浓度的溶壁酶，30℃水浴2-2.5 h，每隔1 h镜检破壁情况。
(5) 加入6mL甘露醇混匀，终止酶解。
800 rpm离心5 min，用移液枪小心转移上清酶液至新的10毫升离心管，再用0.6 mol/L甘露醇离心离心清洗一次（4000 rpm，15 min），液体再生培养基离心清洗一次（4000 rpm，15 min）。