结冷胶生物合成机理研究进展_百替生物

结冷胶生物合成机理研究进展

中国生物工程杂志China Biotechnology,2005,25(11):62～65

王霞袁永黎盛基许平*

(山东大学微生物技术国家重点实验室济南250100)

摘要结冷胶是少动鞘氨醇单胞菌（Sphingomonas paucimobilis）产生的一种新型微生物多糖，其独特的流变特性使结冷胶具有广泛的工业用途。虽然在结冷胶的理化特性方面的研究比较详尽，但是对结冷胶的发酵生产及其生物合成机制还缺乏深入了解。主要关注最近在结冷胶生物合成途径分子生物学方面的研究，用于编码结冷胶生物合成所需蛋白质的基因主要有三类：与糖核苷酸合成有关的基因、与四碳重复单元合成有关的基因及与长链聚合和多糖分泌有关的基因。基因工程是结冷胶分子改造和产量增加最具前景的方法。

关键词少动鞘氨醇单胞菌结冷胶合成途径基因工程

收稿日期：2005 04 21修回日期：2005 06 20

*通讯作者，电子信箱：pingxu@结冷胶是由好氧的革兰氏阴性杆菌——少动鞘氨醇单胞菌Sphingomonas paucimobilis ATCC31461发酵产生的，葡萄糖转化率为50%［1］。这与黄原胶相比，结冷胶低产率、低转化率是限制其大规模产业化的主要障碍。低产率、低转化率的影响因素除了环境因素（如营养物、温度、溶氧及反应器等）外，更重要的是对结冷胶的合成途径缺乏深入了解。因此，对结冷胶生物合成机理进行分子水平上的研究对提高结冷胶产量和转化率及拓宽结冷胶应用具有重要意义。

1结冷胶的组成和结构特征结冷胶是相对分子量高达100万的阴离子型线性多糖，具有平行的双螺旋结构，其结构如图1所示［2］。

图1天然结冷胶的化学结构重复单元

Fig.1Repeating unit of proposed chemical structure of crude gellan

结冷胶主链结构是葡萄糖、葡萄糖醛酸、鼠李糖以2∶1∶1摩尔比聚合而成的四碳重复单元的长链分子，主链上重复的四碳糖单元均为： 3) β D Glc (1 4) β D GlcA (1 4) β D Glc (1 4) α L Rha(1 。天然结冷胶与低乙酰基结冷胶在结构上的不同点在于：前者在每个以β 1,3键连接的葡萄糖分子C2处被L 甘油酸酯化，C6处被乙酸酯化，据Videira等［3］研究，ces10基因编码的蛋白质负责乙酸和甘油酸的连接。

结冷胶的功能特性是由它非常微妙的结构特征决定的，与流变学研究相联系的结构分析表明，结构不同的结冷胶流变学性质变化很大［4］。显微镜观察结冷胶，发现它是由多股链形成的小圈状结构［5］。这种结构（在其它微生物胞外多糖，如黄原胶、硬葡聚糖，普遍存在）导致形成一张大的分子网截留水分子而产生凝胶现象。此外，在一价或二价阳离子存在的情况下，该区域明显增多，并使它们更具耐热性，从而提高结冷胶潜在的胶化能力及结冷胶溶液的粘度［6］。

2结冷胶生物合成中有关的酶和基因少动鞘氨醇单胞菌S.paucimobilis ATCC31461胞外多糖的生物合成涉及大量基因产物的一致作用，因此十分复杂。构建结冷胶主要结构的糖核苷酸有UDP 葡萄糖、UDP 葡萄糖酸和dTDP 鼠李糖。用于编码结冷胶生物合成所需蛋白质基因包括3类：与糖核苷酸合成有关的基因、与四碳重复单元合成有关的基因及与长链聚合和多糖分泌有关的基因［7,8］。多糖sphingan S-88与结冷胶有相同的主链结构，其合成基因簇（sps基因簇）已经被完全测序［9］。最近，Videira等［10］对结冷胶合成基因簇（gel基因簇）进行了研究，结冷胶基因簇中已经被识别的结构和序列与已经测序的多糖sphingan S 88合成基因簇（sps基因簇）十分相似，且相对应的基因也有很高的同源性（图2），这为gel基因簇的研究提供了方便。

2005,25(11)王霞等：结冷胶生物合成机理研究进展

中国生物工程杂志China Biotechnology Vol.25No.112005

2.1核苷酸糖的前体合成

据报道，S.paucimobilis ATCC31461菌株中编码从葡萄糖 1 磷酸合成糖核苷酸所需要的酶的基因为pgmG、ugpG、rhsA、rhsB、rhsC、rhsD［11］。其中pgmG编码的50kDa的蛋白质PgmG是双功能蛋白，具有葡糖磷酸变位酶活性和磷酸甘露糖变位酶活性，它对葡萄糖 6 磷酸的催化活性比对6 磷酸甘露糖的催化活性高约50倍，其酶反应的Km分别为0.33mmol/L和1.27mmol/L。这个双功能蛋白质PgmG与Sphingomonas S7产生的PgmG蛋白质有83%的同源性，与其他革兰氏阴性菌产生的PGM/PMM 蛋白质有53%~37%的同源性［12］。ugpG基因是一段长1500bp的核苷酸序列，编码31.2kDa的蛋白质——尿苷二磷酸-葡萄糖苷转移酶，蛋白质UgpG催化葡萄糖 1磷酸和UTP生成前体物UDP 葡萄糖，UDP 葡萄糖在尿苷二磷酸脱氢酶的催化下生成UDP 葡萄糖酸。ugpG基因及其编码蛋白质与其他微生物的ugpG基因和编码蛋白具有较高的同源性（如，同Zymomonas mobilis的基因和蛋白的同源性分别为66%和82%）［13］。RhsA、RhsB、RhsC和RhsD4种酶将葡萄糖 1磷酸转变成dTDP 葡萄糖，然后转变成4 酮基 6 脱氧甘露糖，最后变成dTDP 鼠李糖，其中对RhsA和RhsD进行了酶活测定和生化性质研究，而对RhsB和RhsC，目前还没有具体的实验数据［14,15］。图2结冷胶基因簇（gel cluster）和多糖S 88基因簇（sps cluster）

Fig.2The clusters involved in the biosynthesis of gellan and S 88respectively

2.2结冷胶的四糖单元合成

Vincent等对菌株ATCC31461的gel基因簇序列进行了研究，推测gelB、gelK、gelL、gelQ基因与四碳重复单元的组装有关［16］。其中gelK编码的蛋白质具有糖基转移酶活性已经得到证实［10］，该基因产物催化葡萄糖酸连接到第一个脂相连的葡萄糖上。但是UDP 葡萄糖和dTDP 鼠李糖是如何连接的以及gelL、gelQ基因在连接中的作用机制目前没有得到具体的实验证明。据推测，EPS生物合成中的聚合和分泌过程涉及到的基因编码产物有催化脂质连接物质从膜的细胞质表面向周质表面运动的折叠酶或转位酶、催化基本单元聚合的多聚酶和负责控制聚合链长短的酶，然而基本单元在EPS生物合成中聚合和分泌的机制尚不清楚。

2.3结冷胶的聚合和外运

对结冷胶的聚合机制、链长的决定及多糖如何通过细胞表面外运出去，都缺乏了解。实验结果表明，sps基因簇中的spsS和spsG基因编码多糖聚合和分泌有关的一类蛋白质。在多糖sphingan S 88的合成中，基因spsS和spsG的产物分别与Wzx和Wzy相似，因此两组蛋白质，尽管序列的相似性和组合的大小与PCP2a蛋白相关，但是它们分为2个开放阅读框架（ORFs），这是PCP2b家族的革兰氏阴性菌的特征［17］。根据预测，gel基因簇中的gelC、gelE、gelF基因与结冷胶的聚合和释放有关，这些基因的突变，会引起结冷胶产量大幅下降，实验证明，GelE蛋白质结合着ATP，但是没有得到关于GelE蛋白有酪氨酸激酶自动磷酸化活性的实验数据［18］。

通过类比可以得到一个简单的多糖聚合和释放模型，即折叠酶催化与脂质体相连接的重复单元发生变位，聚合酶催化重复单元耦合及催化与脂质体相连的聚合物的解离从而控制链的长度。尽管蛋白质转运出质膜的机制已经清楚，但是革兰氏阴性菌聚合多糖转运出膜的机制还未研究清楚。

3结冷胶的生产工艺和基因工程结冷胶生产的环境条件，如温度、通氧量、培养基组成（特别是碳源和氮源）对结冷胶的产量、组成、结构和特征都会产生一定的影响，但从分子生物学方面来研究结冷胶生物合成机理会给结冷胶分子改造和产量增加提供一些新的启示和思路，值得我们探讨和借鉴。如前所述，结冷胶生物合成在三个水平上存在着调控——糖激活前体的合成、重复单位的组装和结冷胶的聚合与分泌。在这个途径中PgmG是结冷胶合成的关键酶，因为它出现在糖代谢的分支点上，是代谢工程的理想靶位点，G6P进入异化过程产生能量和消耗能量，而G1P是结冷胶和其他细胞聚合多糖合成所需糖核苷酸的前体。因此，利用基因手段对糖代谢的分支点进行改造，使糖代谢流向G6P合成方向转移将有利于结冷胶的合成。Vartak等［19］通过定点突变，使zwf基因编码的6 磷酸葡萄糖