rt-qPCR实验操作
rtqpcr计算方法
rtqpcr计算方法实时荧光定量PCR（Real-Time Quantitative PCR），也被称为rtqPCR，是一种在生物医学研究中广泛应用的分子生物学技术。
该技术利用荧光标记的探针或者特定的荧光染料，对PCR过程中的产物进行实时监测，通过荧光信号的强弱来实时反映DNA的扩增情况，从而实现对DNA的定量分析。
rtqPCR具有高灵敏度、高特异性和高精度的特点，因此在基因表达分析、突变检测、基因定位等领域有着广泛的应用。
一、实验步骤1. 样品处理：提取待测样品的DNA，进行PCR扩增。
2. 荧光标记：在PCR反应体系中加入荧光标记的探针或者荧光染料。
3. 实时监测：PCR反应过程中，荧光信号被实时监测，并记录荧光信号的变化情况。
4. 数据分析：通过对比标准品或者内参基因的荧光信号，计算待测样品的基因表达量或者DNA拷贝数。
二、荧光染料及探针荧光染料：荧光染料是一种能够吸收特定波长的光并发出另一波长的光的物质，常用于标记DNA或RNA。
在rtqPCR中，常用的荧光染料包括SYBR Green和TaqMan。
SYBR Green是一种通用的染料，可与所有dsDNA结合并产生荧光，因此其特异性较差。
而TaqMan探针是一种专一的荧光染料，其特异性好，因此在基因突变和单核苷酸多态性（SNP）检测中应用广泛。
探针：探针是一种标记有荧光的特异性寡核苷酸片段，可与靶基因结合。
在PCR过程中，随着DNA的扩增，探针与靶基因的结合量增加，从而产生更多的荧光信号。
常用的探针包括TaqMan探针和分子信标。
TaqMan探针是一种较长的寡核苷酸片段，能够与靶基因进行高特异性结合。
分子信标则是一种更短的寡核苷酸片段，与靶基因的结合区域较短，因此具有更高的特异性。
三、数据分析数据分析是rtqPCR实验中非常重要的环节，通过对荧光信号的变化情况进行分析，可以计算出待测样品的基因表达量或者DNA拷贝数。
常用的数据分析方法包括相对定量和绝对定量。
RT-qPCR操作说明书
注意事项1.以下的Protocol主要适用于（1）所使用的DNA1、反转录酶、RNA 酶抑制剂以及dNTPs均是Fermentas公司的；而在qPCR中，所使用的Supermix是Bio-RAD公司的。
2.RT-qPCR中的注意事项：（1）MgCl2的浓度2~4mM；（2）模板的浓度50ng~5pg之间；（3）引物的浓度，500nM比较合适，若反应效果不好可以在0.1~1uM之间选择；（4）退火温度的选择，首次设置比实际小5℃的，之后在1~2℃选择；（5）引物设计的时候Tm值最好在60℃附近，正反向引物的Tm的差值在1~2℃之间；（6）抽提得到的RNA，需要验证RNA的纯度，最好验证一下RNA的完整性；（7）在qPCR中，模板的体积要小于总反应体系的10%（主要是模板的加入量会影响反应体系中的MgCl2浓度）；（8）扩增曲线一定要做。
通常如果有条件也要做退火温度梯度，以获得最佳的退火温度。
另外就是，一块板子上，尽可能取尽量多的样本，而不是基因；（9）扩增效率在90~110%的范围内是可以接受的；（10）内参基因的选择，尽可能选择与靶基因处于同一信号通路中的内参基因。
3.有关引物设计（1）扩增子长度小于150bp；（2）引物Tm的理想值57~60℃；（3）3’端最后5个碱基里面G或C的含量少于三个；（4）GC含量介于20~80%，理想值40~60%；（5）避免引物二聚体及自身二级结构；（6）避免引物内的自身重复序列；4.在一个实验中不论是绝对定量还是相对定量都需要做标准曲线，做标准曲线的方法，以反转录得到的cDNA为模板，用qPCR的引物做PCR得到的产物为模板，产物先稀释10000倍，以稀释后为基底，以10为倍数，稀释7~8个梯度（稀释点越多，稀释倍数越大，数据越精确），做qPCR，然后得到标准曲线。
利用标准曲线可以验证下列因素：（1）扩增效率；扩增效率E=10-1/斜率-1（2）标准品的梯度范围；（3）PCR抑制剂的存在于影响；（4）PCR仪验证灵敏度。
QPCR详细实验过程和仪器操作说明
QPCR实验过程一、细胞培养1.1 不同配比的SA-GG/TMP复合水凝胶支架的制备四种水凝胶的配比按照之前的实验方案操作，将制备的复合墨水用0.5M的氯化钙交联24h，然后利用模具将其切成直径15mm*5mm的圆柱凝胶盘。
1.2 凝胶样品的灭菌处理将制备好的凝胶样品放到无菌的50m离心管中，然后加入无菌的生理盐水至盖过样品。
然后密封，放入80℃烘箱中加热30分钟，然后在冷却30分钟，如此往复3-5次即可。
1.2水凝胶样品的接板将灭菌的样品放入6孔板中，每个样品三个平行样，然后加入3-5ml培养基，培养基为DMEM高糖培养基，10%FBS，1%双抗，培养12h，去除水凝胶中的水分和多余的钙离子。
然后去除旧的培养基，用生理盐水清洗3次，按每个孔5*104/cell细胞密度接板，接板时间分别为1、3、5、7d进行培养，每两天进行换液。
二、PCR操作过程2.1 M-RNA的提取2.1细胞裂解将培养到时间的细胞去除材料，然后用PBS清洗3-5遍，加入Trizol 1ml（实际可以加入500微升即可），轻轻吹打1min左右，然后将孔板直接放到-80 ℃的冰箱中至少冷冻12小时。
2.2 M-RNA提取2.2.1将冷冻的细胞裂解液解冻并且移到1.5mL的离心管中，然后按照Trizol与氯仿（三氯甲烷）比例为5:1的比例,即取0.2ml的氯仿，上下颠倒剧烈震荡15s,再冰上室温放置3分钟。
然后2-8 ℃，12000*g离心15min。
离心后样品分为三层：底层为红色有机相，上层为无色水相和一个中间层。
RNA主要在水相中，水相体积约为所用TRizol试剂的60%。
2.2.2 把水相转移到1.5 mL的离心管中，如要分离DNA和蛋白质可保留有机相。
此处尽量洗干净水相，以1mlTRizol为例，约为500 µl的水相，如果吸到红色无机相，此样品重新进行上部离心。
然后向离心管中加入每1ml TRzol加入0.5 ml的异丙醇，在冰上放置10min。
rt-pcr的步骤和注意事项
RT-PCR的步骤和注意事项RT-PCR（逆转录聚合酶链反应）是一种常用的分子生物学技术，用于检测和分析RNA的数量和表达水平。
下面是RT-PCR的基本步骤和一些需要注意的事项。
步骤1.提取RNA：RT-PCR的第一步是从样品中提取RNA。
常见的方法包括酚/氯仿提取法和商用RNA提取试剂盒。
2.逆转录：逆转录是将RNA转录成cDNA的过程。
逆转录反应需要逆转录酶和引物。
在逆转录反应中，RNA被逆转录酶逆转录为单链cDNA。
3.退火：将逆转录产生的单链cDNA进行退火，以得到双链cDNA。
退火的温度和时间应根据引物的特异性进行优化。
4.PCR扩增：将退火得到的双链cDNA作为模板进行PCR扩增。
PCR扩增需要DNA聚合酶和引物。
PCR扩增的温度和时间也应根据引物的特异性进行优化。
5.分析产物：将PCR扩增产物进行凝胶电泳分析或者实时荧光定量PCR分析，以检测和定量RNA的表达水平。
注意事项在进行RT-PCR实验时，有几个注意事项需要遵守：1.RNase污染：RNase是一种可以降解RNA的酶，极易污染实验室环境。
为了避免RNase污染，所有操作前都应使用RNase去除液对实验表面进行彻底清洁，并在操作过程中使用RNase-free的试剂和器具。
2.质控：在RT-PCR实验中应常规进行阴性对照和阳性对照。
阴性对照是用纯水代替RNA模板，而阳性对照是使用已知含有目标RNA的样品。
质控实验的结果应该符合预期，以确保实验的准确性和可靠性。
3.引物设计：引物是RT-PCR实验中非常重要的因素，合适的引物设计可以提高实验的特异性和灵敏度。
引物的选择应避免自身互补性，长度一般为18-24个碱基，GC含量在40-60%之间。
此外，引物的Tm值应相近，以确保PCR扩增的效果。
4.反应体系：RT-PCR反应体系的准备需要精确的计量。
反应的组分通常包括模板RNA，引物，逆转录酶，逆转录缓冲液，核苷酸混合液，PCR缓冲液，DNA聚合酶，dNTPs和MgCl2等。
RT-PCR具体实验步骤
品逐个浸泡其中(注意：小枪头要充分浸泡，必要时需要针筒打入 DEPC 水)，过夜后取出(注意： DEPC 水很难自然晾干，所以建议先将刚取出的 DEPC 物品甩干，枪头装入枪头盒后甩干，EP 管和 匀浆管装入饭盒后甩干，然后在 37 度孵箱烘干)。高压后烤干备用。如果 DEPC 处理过的物品时 间已超过一个星期，再次使用前应再次高压。
组织 100mg/细胞 1×107 ↓
加 1mlTRIzol ↓
组织：匀浆(彻底，分几次打，是匀浆时产生的热量能散出，后转至 EP 管) 细胞：用 1ml 加样器吹至液体澄清且无细胞团块 ↓ 颠倒混匀 10 下，室温 5 分钟 ↓
加氯仿 1/5 体积(0.2ml)(必须按总体积的 1/5) ↓
颠倒混匀 10 下，室温 5 分钟 ↓
装 DEPC 水的瓶子在盖子和瓶之间要放上线头；2.高压时间在 40-45 分钟，所以水要适当多加一 点；3.高压结束后，不要强行放气，要让压力自然下降，不然水会喷出)。
3．异丙醇：放入棕色瓶中。 4．氯仿：放入棕色瓶中。 5．琼脂糖
四．缓冲液配制 1．电泳缓冲液(5×TBE 贮存液)：Tris 54g、硼酸 27.5g、0.5M EDTA 20ml pH8.0、加
一．实验器具： 1.移液枪：1ml、200μl、20μl、10μl、2.5μl 2.吸头：1ml、200μl、20μl 3.匀浆管：5ml 4.EP 管：1.5ml、500μl、200μl 5.试剂瓶：棕色试剂瓶(广口，放 75%乙醇) 6.量筒：100ml 7.容量瓶：1000ml 8.试管架：5ml、1.5ml、20μl 9.铝制饭盒：1-2 个 10.大瓷缸：1 个 11.锡泊纸：一卷 12.卷纸：2 卷 13.三角烧瓶：带盖，稍大
实时荧光定量PCR具体实验步骤
实时荧光定量PCR具体实验步骤
实时荧光定量（Real Time quantitative PCR）是检测RNA或DNA的一种常用技术，通过检测特定目标的增加（或减少），可以用来测定RNA 或DNA的表达水平，或者基因等的转录水平。
下面我们就对实时荧光定量PCR(RT-qPCR)的实验步骤进行具体介绍。
1.搭建实验
第一步是搭建实验，即准备实验所需的干燥试剂，第二步是准备RNA 样本，第三步是准备标准曲线，最后是根据实验需要准备实验板和实验试管。
2、RNA样品提取
在实验中，会使用到多种RNAs，一般情况下使用TRIzol或Phenol 抽提方法进行RNA抽提，不同的细胞、组织中RNA的杂质含量不一样，因此需要根据实验需求进行适当调整抽提浓度。
3、RT-qPCR反转录
在RT-qPCR反转录之前，首先要准备反转录试剂，一般采用qPCR反转录试剂盒，这种试剂盒含有足够的反转录荧光探针以及反转录引物，它可以有效帮助反转录过程。
反转录过程通过复制DNA片段的过程完成，最终转录出的cDNA存在细胞核中。
4、qPCR扩增实验
qPCR扩增实验是在反转录完成后进行，一般来说，这个步骤可以采用qPCR扩增试剂盒，该试剂盒中包含所需的扩增物质如DNA聚合酶、前驱核苷酸、dNTPs，检测细胞核中的cDNA。
RT-qPCR实验技术方案 20230418
RT-qPCR实验技术方案基本概念荧光定量逆转录PCR (quantitative reverse transcription PCR, RT-qPCR)是在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号累积实现了实时监测整个PCR进程，并对起始模板进行定量分析的方法。
首先通过采集的样本来提取RNA，然后将提取的RNA通过逆转录酶合成互补DNA (cDNA)。
随后，以cDNA为模板进行qPCR反应，实时采集荧光信号来监控扩增反应过程。
目前RT-qPCR用于多种分子生物学领域，在科研端可用于基因表达量分析、病原体检测、RNA干扰验证，同时也是分子体外诊断的行业金标准，例如在临床疾病诊断、动物检验检疫、食品安全和科学研究等应用场景均有涉及，尤其在新型冠状病毒、肝炎、艾滋病、流感、登革热、感染性腹泻等的检测、诊断和治疗上发挥着重要作用。
RT-qPCR实验方案样本处理样本采集1.避免外源RNase影响外源无处不在RNase是导致RNA降解的主要因素。
采集和实验环境要尽可能整洁，使用的耗材需要用DEPC处理或购买无酶耗材；同时实验人员操作迅速熟练，缩短降解时间2.避免内源RNase影响某些富含RNA内源酶的部位(如脾脏、胸腺) 本身就容易降解，建议在液氮条件下将组织碾碎，且匀浆时使用更多裂解液。
3.根据提取量分装样本取样前先明确一次提取的组织量，取样后按照一次提取的量分管保存，避免二次分管和并管造成的污染和降解。
4.选择高丰度组织部位不同组织部位的RNA丰度不同，需尽量选用高丰度的组织部位，如动物样本的肝脏、脾脏、心脏的RNA丰度可达2-4 μg/mg，植物样本中的叶片、根茎为0.2-0.3 μg/mg。
样本保存保存方式对样本RNA质量有着极大影响，需要根据样本类型选择较为保存方式和操作方法。
一般保存方法都是用RNA组织细胞保存液(ATG #R202)或者Trizol (ATG #201) 低温保存组织细胞，若暂时不抽提RNA，可在低温下适当研磨匀浆后用液氮速冻，适当的匀浆有利于细胞分散充分接触保存液(浸透)，减少大块样本内部RNA降解；血液样本可以适当加入抗凝剂比如柠檬酸钠。
RT-qPCR操作说明书
注意事项1.以下的Protocol主要适用于（1）所使用的DNA1、反转录酶、RNA 酶抑制剂以及dNTPs均是Fermentas公司的；而在qPCR中，所使用的Supermix是Bio-RAD公司的。
2.RT-qPCR中的注意事项：（1）MgCl2的浓度2~4mM；（2）模板的浓度50ng~5pg之间；（3）引物的浓度，500nM比较合适，若反应效果不好可以在0.1~1uM之间选择；（4）退火温度的选择，首次设置比实际小5℃的，之后在1~2℃选择；（5）引物设计的时候Tm值最好在60℃附近，正反向引物的Tm的差值在1~2℃之间；（6）抽提得到的RNA，需要验证RNA的纯度，最好验证一下RNA的完整性；（7）在qPCR中，模板的体积要小于总反应体系的10%（主要是模板的加入量会影响反应体系中的MgCl2浓度）；（8）扩增曲线一定要做。
通常如果有条件也要做退火温度梯度，以获得最佳的退火温度。
另外就是，一块板子上，尽可能取尽量多的样本，而不是基因；（9）扩增效率在90~110%的范围内是可以接受的；（10）内参基因的选择，尽可能选择与靶基因处于同一信号通路中的内参基因。
3.有关引物设计（1）扩增子长度小于150bp；（2）引物Tm的理想值57~60℃；（3）3’端最后5个碱基里面G或C的含量少于三个；（4）GC含量介于20~80%，理想值40~60%；（5）避免引物二聚体及自身二级结构；（6）避免引物内的自身重复序列；4.在一个实验中不论是绝对定量还是相对定量都需要做标准曲线，做标准曲线的方法，以反转录得到的cDNA为模板，用qPCR的引物做PCR得到的产物为模板，产物先稀释10000倍，以稀释后为基底，以10为倍数，稀释7~8个梯度（稀释点越多，稀释倍数越大，数据越精确），做qPCR，然后得到标准曲线。
利用标准曲线可以验证下列因素：（1）扩增效率；扩增效率E=10-1/斜率-1（2）标准品的梯度范围；（3）PCR抑制剂的存在于影响；（4）PCR仪验证灵敏度。
RT-PCR全过程步骤
RT—PCR全过程步骤一．试剂材料准备1、塑料制品：(包括枪头、EP管、匀浆管等）先将DEPC水从容量瓶中倒入瓷缸中，将塑料制品逐个浸泡其中，其中小枪头需要吸管打入DEPC水，过夜，然后高压，再烤干备用，实验前将枪头等放入吸头台，再高压一次（EP管)2、玻璃制品:泡酸过夜，冲洗干净，蒙锡纸烤干备用（DEPC水泡）(洗净后先泡1‰DEPC过夜，再烤干）3、匀浆器：（包括剪刀、镊子）先洗净后，再高压（不需要泡DEPC)三、试剂配制：1、DEPC水：吸出1ml放在1000ml双蒸水中配成1‰DEPC水,放在1000ml容量瓶中静置4小时备用。
2、75%乙醇：用无水乙醇DEPC水配，然后放-20℃保存(其中DEPC水需先高压）3、异丙醇：放入棕色瓶中4、氯仿：放入棕色瓶中5、琼脂糖二．总RNA提取1. 取100mg组织，放到1。
5mlEP管中，加入1mlTrizol剪碎。
（1)液氮研磨，组织块直接放入研钵中，加入少量液氮，迅速研磨，待组织变软，再加少量液氮，再研磨，如此三次，按50—100mg 组织/ml Trizol 加入Trizo l，转入离心管进行第2 步操作。
(2）匀浆：组织样品按50—100mg/mlTrizol 加入Trizol。
另外,组织体积不能超过Trizol 体积的10％，否则匀浆效果会不好，用电动匀浆器充分匀浆约需1—2 分钟.2. 震荡30s，室温放置5min，使其充分裂解。
12，000rpm 离心5min，弃沉淀。
3. 加0.2ml氯仿，摇动30s,室温5-10min。
注：禁用漩涡振荡器,以免基因组D NA 断裂。
4。
12000×g，4℃离心,15min。
5. 吸上层无色水相,移入另一EP管中（约0.5ml）。
6. 加等体积异丙醇，室温放置5—10min。
7。
12000×g,4℃离心,10min。
在管底部可见微量RNA沉淀8. 弃上清，加冰预冷75%乙醇1ml，温和振荡，悬浮沉淀。
rt-qpcr的操作流程
rt-qpcr的操作流程英文回答：RT-qPCR Workflow.1. RNA Extraction: RNA is extracted from the sample using a commercial RNA extraction kit.2. cDNA Synthesis: The extracted RNA is reverse transcribed into complementary DNA (cDNA) using a reverse transcriptase enzyme and specific primers.3. qPCR Setup: The cDNA is mixed with specific primers, fluorescent probes, and a qPCR master mix.4. qPCR Amplification: The qPCR reaction is carried out in a thermal cycler, which involves cycles of denaturation, annealing, and extension.5. Data Acquisition and Analysis: Fluorescence data iscollected during the qPCR amplification and analyzed to determine the relative expression levels of the target genes.中文回答：RT-qPCR 操作流程。
1. RNA 提取，使用市售的 RNA 提取试剂盒从样品中提取 RNA。
2. cDNA 合成，使用逆转录酶和特异性引物将提取的 RNA 逆转录成互补 DNA (cDNA)。
3. qPCR 反应体系建立，将 cDNA 与特异性引物、荧光探针和qPCR 反应液混合。
real time quantative PCR(RT-PCR,qPCR)实时定量PCR详细操作流程
1.SYBR Green使用浓度：太高抑制Taq酶活性，太低，荧光信号太弱。
2.引物特异性高，否则扩增有杂带。
3.反应温度和时间，根据酶和引物决定。
4.其他与常规PCR相同。
noise band建议刚好越过实验中设置的阴性孔。
不同的基因不需要相同的阈值，但是每块板上同一对引物扩增的基因使用相同的阈值。
横坐标：扩增循环数纵坐标：荧光强度每个循环进行一次荧光信号收集荧光信号阈值：前15个循环信号作为荧光本地信号baseline，即样本的荧光背景值和阴性对照的荧光值。
荧光阈值的缺省设置是3-15个循环的荧光信号的标准偏差的10倍。
Ct:PCR扩增过程中，扩增产物的荧光值达到设定的阈值时所经过的扩增循环次数。
Ct值极具重现性。
定量时多取15-35较好。
1.dye kit：roche lightcycle 480 sybr green 1 masterKit中小瓶：Master 2x, 储存于-20℃，避光，避免反复冻融，使用前上下颠倒混匀，避免气泡，不能震荡Water，PCR grade储存于-20℃配制好的PCR反应液，可于室温稳定保持24h，需避光。
2.template：在20μl体系中，说明书中推荐20ng纯化的cDNA，50-100ng genomic DNA，108拷贝plasmid DNA。
根据以往经验，150-200ng cDNA（也许未纯化）为佳。
模板太多，会影响荧光发光。
如果模板不纯，则模板量不能超过2μl，预变性时间改为10min，可降低模板中杂质的影响。
3.primer：最终工作浓度为0.2-1μM, 推荐0.5μM。
引物浓度的原则是，达到目标荧光浓度时，最低引物浓度，导致最低crossing points，Cp值。
4.products: 产物长度最好不超过500bp5. system✧配制体系时，不能触摸PCR板的上表面以及封口膜，戴手套✧Master mix避光✧冰上加样✧准备好混合样品后，吹打混匀，不能震荡20μlMaster mix 10F（10μM）1（0.5μM）R（10μM）1（0.5μM）Template 1（150ng）DDW PCR grade 76.program：Incubation 95℃ 5min or 10min Amplification 95℃ 10s55-60℃（选58℃），5-20s（选20s）72℃5-30s（选30s）40 or 45 cyclesMelting Curve 95℃ 5s，65℃1min，97℃Cooling 40℃ 10s。
rt-pcr的原理实验步骤及应用
RT-PCR的原理、实验步骤及应用1. 原理RT-PCR（逆转录聚合酶链式反应）是一种常用的分子生物学技术，它结合了逆转录和聚合酶链式反应的原理，用于检测和定量RNA的表达水平。
下面是RT-PCR的基本原理：•首先，通过逆转录作用，将RNA转录成相应的cDNA（互补DNA）。
逆转录酶会在反应中合成cDNA互补链，其中DNA聚合酶将dNTPs部分替换为对应的ddNTPs（荧光标记的核苷酸）用于标记合成的cDNA。
•然后，在PCR反应中使用特定的引物（primers）来扩增目标cDNA。
引物是两个短的DNA序列，它们能够与cDNA互补的序列部分结合，从而指导DNA聚合酶合成新的DNA链。
•最后，通过荧光检测仪读取PCR反应体系中的信号，从而定量检测目标RNA的表达水平。
2. 实验步骤RT-PCR实验通常包括以下步骤：2.1 样品准备•收集所需的细胞或组织样品，并保存在RNA保护液中以保护RNA的完整性。
•如果需要，使用RNA提取试剂盒从细胞或组织中提取RNA。
2.2 逆转录反应•准备RT-PCR反应体系，包括逆转录酶、随机引物、RNA样品和其他反应组分。
•混合反应液，然后进行逆转录反应。
此步骤通常在反应器中以特定温度下进行。
2.3 PCR反应•将逆转录反应产生的cDNA用作PCR反应的模板。
•准备PCR反应体系，包括DNA聚合酶、引物和其他反应组分。
•将PCR反应液混合均匀，然后进行PCR反应。
PCR反应通常包括一系列的循环，在每个循环中，温度会发生变化以使DNA链合成和扩增。
2.4 结果分析•将PCR反应体系中的产物用琼脂糖凝胶电泳进行分离。
•根据PCR反应产物大小，使用合适的染料将琼脂糖凝胶染色。
•使用紫外线透射仪观察琼脂糖凝胶中的DNA带，以便分析目标基因的扩增效果。
3. 应用RT-PCR广泛应用于分子生物学和医学领域，具有以下应用方面：•基因表达分析：通过测量RNA的表达水平，可以了解目标基因在不同样品中的表达情况，从而研究基因调控、识别潜在的生物标记物等。
rt—qpcr实验原理及步骤
rt-qpcr是一种结合了逆转录和实时荧光定量PCR技术的方法，用于对RNA分子进行定量检测。
其原理主要包括三个方面：逆转录、PCR 扩增和实时荧光定量检测。
1. 逆转录rt-qpcr实验首先需要将RNA转录为cDNA，这是通过逆转录酶（Reverse Transcriptase）催化的反应来实现的。
逆转录酶可以将RNA模板转录成相应的cDNA，为后续的PCR扩增提供模板。
2. PCR扩增在cDNA合成完成后，接下来是PCR扩增反应。
PCR扩增需要引物（primers）来选择性地扩增目标基因的片段。
在PCR过程中，引物与模板结合，逐渐扩增出大量目标片段，这些片段即为实验所关注的RNA分子的转录产物。
3. 实时荧光定量检测在PCR扩增过程中，可以加入SYBR Green等实时荧光染料，以实现实时监测PCR反应过程中产生的DNA片段数量。
这种实时荧光检测技术可以实现对PCR反应的动态观察，并能够定量分析反应体系中的DNA含量。
rt-qpcr实验步骤主要包括样品准备、逆转录、PCR扩增和荧光定量检测，以下为详细步骤：1. 样品准备首先需要准备待检测的RNA样品，其中包括目标RNA分子的提取、纯化和定量等工作。
样品的处理质量将直接影响后续实验结果的准确性和可靠性。
2. 逆转录将RNA样品与逆转录酶、随机引物和dNTPs等混合物一起进行逆转录反应。
逆转录过程一般包括以下步骤：首先将RNA与随机引物混合，然后加入dNTPs和逆转录酶，进行逆转录反应。
3. PCR扩增在逆转录完成后，将逆转录得到的cDNA作为模板，与特定引物和PCR Master Mix（包括酶、缓冲液和dNTPs等）进行PCR扩增反应。
PCR扩增条件需要根据引物的特性和目标片段的长度进行优化，以保证扩增反应的特异性和准确性。
4. 荧光定量检测在PCR扩增过程中，引入实时荧光染料（如SYBR Green）或探针（如TaqMan探针）来进行荧光定量检测。
定量逆转录-聚合酶链反应(RT-qPCR)
定量逆转录-聚合酶链反应（RT-qPCR）一、实验原理逆转录-聚合酶链反应(Quantitative Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction，RT-qPCR)的原理是：提取组织或细胞中的总RNA，以其中的mRNA作为模板，采用Oligo （dT）或随机引物利用逆转录酶反转录成cDNA，再以cDNA为模板进行PCR扩增，而获得目的基因或检测基因表达。
二、实验步骤（一）总RNA提取1.Trizol裂解收集各处理组细胞于1.5ml离心管，用PBS缓冲液洗涤1次，每5～10×106个细胞加入1ml Trizol，吹打数次，使细胞充分裂解，室温静置5min。
（裂解后若不能及提取RNA，可在加入Trizol后，将其保存于-80℃）2.氯仿（三氯甲烷）萃取（1）每管加入200ul氯仿（Trizol :氯仿= 5 : 1），盖好离心管后，涡旋震荡15s后，放置室温静置2min。
（2）4℃、12000rpm条件下离心15min后，溶液分为上、中、下3层，上层为水相（无色透明，含RNA），下层为有机层（粉红色，含DNA和蛋白质等）。
3.异丙醇沉淀（1）吸取上层水相（约500μL）至RNase-free离心管中。
（不要吸到中间层）（2）加入500μL异丙醇（与上层水相等量），颠倒混匀数次。
（不要剧烈摇晃）（3）4℃、12000rpm条件下离心15min后，吸弃上清液，保留底部白色沉淀。
4.75%乙醇洗涤沉淀（1）加入1mL 75%乙醇（现配现用，DEPC水:无水乙醇= 1:3，配制后上下颠倒混匀）洗涤沉淀，涡旋震荡。
（2）4℃、12000rpm条件下离心5min后，吸弃上清液，将离心管开盖干燥10min。
5. RNA干燥溶解每管加入50μL DEPC水，盖好离心管后，敲打溶解。
（二）RNA浓度和纯度检测1.提前10min对酶联免疫分析仪进行预热。
2.用DEPC水洗涤微量比色皿。
RTPCR具体步骤
RTPCR具体步骤RT-PCR（逆转录聚合酶链反应）是一种用于检测和测量特定RNA分子在样本或样本中的表达水平的实验技术。
下面是RT-PCR的具体步骤：1.提取RNA：首先从样本（可以是细胞或组织）中提取RNA。
这可以通过商业RNA提取试剂盒或经典的酚-氯仿提取法来完成。
提取的RNA可能含有DNA杂质，因此可以使用DNA酶I来去除DNA。
2.逆转录反应：将提取的RNA转录成互补的DNA（cDNA）的过程称为逆转录。
逆转录反应的目的是将RNA转录成cDNA，并将其中的信息保存下来，以便后续PCR反应中进行扩增。
逆转录反应通常在逆转录酶（例如M-MLV反转录酶）和随后使用的引物的存在下进行。
需要引物来诱导逆转录酶在RNA模板上合成第一链cDNA。
3.PCR反应：PCR是一种将特定DNA片段扩增到大量可检测水平的技术。
在RT-PCR中，PCR反应用于扩增从RNA转录的cDNA片段。
PCR反应需要一对引物，这对引物应是特异性的，可以选择性地放大感兴趣的RNA分子。
PCR反应通常包含DNA模板，引物，dNTPs（脱氧核苷酸三磷酸盐）和DNA聚合酶。
PCR反应包括一系列循环，每个循环都包括一定的时间和温度在一定的时间内。
4.聚合酶链反应：在PCR反应中，DNA聚合酶在每一个循环中以DNA末端为模板合成互补的DNA链。
每个循环包括退火，延伸和变性步骤。
在退火步骤中，引物结合到DNA模板上。
在延伸步骤中，DNA聚合酶合成新的DNA链，并以它们作为模板进一步合成更多的DNA链。
在变性步骤中，PCR反应的温度被升高以分离DNA链。
5.检测与分析：PCR反应产生的扩增产物可以通过凝胶电泳或其他检测方法进行分析。
凝胶电泳可以分离不同大小的DNA片段，并且扩增产物的相对量可以通过定量PCR（qPCR）进行测量。
qPCR使用荧光信号来检测PCR产物的积累，并通过与标准曲线相比较来确定特定的RNA分子在样本中的表达水平。
6.数据分析：通过分析PCR产物的相对量，可以根据比较样品之间的扩增产物浓度来确定特定RNA分子在样本中的表达水平。
rt-qpcr的操作流程
rt-qpcr的操作流程下载温馨提示:该文档是我店铺精心编制而成，希望大家下载以后，能够帮助大家解决实际的问题。
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rtqPCR实验操作 ppt课件
荧光实时定量PCR rt-qPCR
定义
实时荧光定量PCR(rt-qPCR)： • 在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧 光信号的变化对PCR过程进行 实时监控，以 此实现对初始模板的定量分析。
Rt-qPCR的应用
• mRNA表达的研究 • 微小残留病变的检测 • 肿瘤耐药基因表达的研究 • 病毒感染的定量监测
4、按照排板的顺序往板内加样本混合物，每 孔18.4微升，加完后rt按qPCR实排验操作板顺序加相应的前
即实验组基因表达相较于对 照组上调或下调的倍数。
rtqPCR实验操作
荧光定量PCR如何减小误差 1、校准生物学误差：内参(管家基因) 2、降低随机误差
rtqPCR实验操作
1、校准生物学误差内参(管家基因)
rtqPCR实验操作
• 在相同的条件下，进行复制扩增，每扩增 一个循环，通过检验荧光来检测每个孔里 目标基因片段的含量，记录每个反应管内 的荧光信号达到设定的域值时所经历的循 环数（样本的域值循环数Ct），次数越多就 说明目标基因在原本的样品里越少，即初 始模板的量越少。
rtqPCR实验操作
logX= n (1+E)+logX0
rtqPCR实验操作
PCR基本原理
•试管中进行的DNA复制反应，依据
1.DNA半保留复制的机理
2.体外DNA分子于不同温度下可变性和复性的性 质
•通过人为控制体外合成系统的温度，使
1.双链DNA变成单链
2.单链DNA与人工合成的引物退火
3.DNA聚合酶使引物沿着单链模板延伸为双链
DNA。
rtqPCR实验操作
• 生物学重复：样品三次重复 • 技术重复：每个样品做3-4个复
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即实验组基因表达相较于对 照组上调或下调的倍数。
荧光定量PCR如何减小误差 1、校准生物学误差：内参(管家基因) 2、降低随机误差
1、校准生物学误差内参(管家基因)
内参基因(Endogenous Control) 用于校准实验过程中样品本身对定量结果的影响 原因：核酸提取时通常以重量，体积或细胞数为单位取 样，提取过程中存在得率差异和操作误差，造成 等量样品不一定获得等量提取物 目的：将定量结果校准为以基因组（或单个细胞）为 单位，不同样品之间才具有可比性 校准方法：[目的基因]-[内参]=均一化的目的基因表达量
• 理论上来说，PCR反应过程中生成的DNA产物是呈指 数方式增加的，即每增加一个循环，PCR产物加倍。 但随着反应循环数的增加，产物积累、原料消耗， 最终PCR反应无法继续维持指数方式的扩增，而进 入线性期和平台期。整个PCR反应过程中，只有在 指数期，PCR产物的量与加入的初始模板量存在明 确的数学关系（PCR产物量=初始模板量×2^N，N= 循环数），因此，利用公式，可以由产物的量精确 推算出初始模板量的多少。而在线性期和平台期， PCR产物量和初始模板量之间不存在准确的数学关 系，由这两个时期的产物量来推算初始模板量的多 少是不准确的。
1、把要测的RNA逆转录为cDNA，决定要跑的基因和 使用的内参序列，排好板的顺序。 2、准备好DNA样本，水，sybr，前后引物，融化，离 心。 3、计算样本混合物（每个孔加sybr10ul、cDNA30ug、 水8.4ul-cDNA），前后引物的量（每个孔加前后引物 各0.8ul），多算1到2孔。按比例混合样本，sybr，水。 按比例混合前后引物。 4、按照排板的顺序往板内加样本混合物，每孔18.4微 升，加完后按排板顺序加相应的前后引物混合物，每 孔1.6微升。 5、贴膜，离心，上机，Real Time PCR扩增结束后输出 对照组和待测组的目的基因及内参基因的CT值。
荧光实时定量PCR rt-qPCR
定义 实时荧光定量PCR(rt-qPCR)：
•
在PCR反应体系中加入荧光基团，利用 荧光信号的变化对PCR过程进行 实时监控， 以此实现对初始模板的定量分析。
Rt-qPCR的应用
• mRNA表达的研究 • 微小残留病变的检测 • 肿瘤耐药基因表达的研究 • 病毒感染的定量监测
示意图
• Real-time定量PCR仪是在PCR反应体系中加 入荧光基团，利用荧光信号累积实时监测 和连续地分析整个PCR进程，随着反应时间 的进行，监测到的荧光信号的变化可以绘 制成一条曲线，最后通过标准曲线对未知 模板进行定量的分析。
SYBR Green
SYBR Green 能结合到双链DNA的小沟部位，只有和 双链DNA结合后才发出荧光，DNA双链分开就不发出 荧光，随PCR循环数的增加，产物量的增多，产生的 荧光信号逐渐增强，实现了荧光信号与产物量的关 联。
• 在相同的条件下，进行复制扩增，每扩增 一个循环，通过检验荧光来检测每个孔里 目标基因片段的含量，记录每个反应管内 的荧光信号达到设定的域值时所经历的循 环数（样本的域值循环数Ct），次数越多就 说明目标基因在原本的样品里越少，即初 始模板的量越少。
logX= n (1+E)+logX0
实验步骤
PCR基本原理
• 试管中进行的DNA复制反应，依据 1.DNA半保留复制的机理 2.体外DNA分子于不同温度下可变性和复性的性 质 • 通过人为控制体外合成系统的温度，使 1.双链DNA变成单链 2.单链DNA与人工合成的引物退火 3.DNA聚合酶使引物沿着单链模板延伸为双链 DNA。
• 基本步骤 • 变性：加热使双链DNA变为单链（94℃， 30s） • 退火：降温使引物和互补模板在局部形成 杂交链 （55℃，30s） • 延伸：耐热DNA聚合酶按5′→3′方向催化以 引物为起始点的延伸反应（70~72℃， 30~60s）