rt-qPCR实验操作
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1、把要测的RNA逆转录为cDNA，决定要跑的基因和 使用的内参序列，排好板的顺序。 2、准备好DNA样本，水，sybr，前后引物，融化，离 心。 3、计算样本混合物（每个孔加sybr10ul、cDNA30ug、 水8.4ul-cDNA），前后引物的量（每个孔加前后引物 各0.8ul），多算1到2孔。按比例混合样本，sybr，水。 按比例混合前后引物。 4、按照排板的顺序往板内加样本混合物，每孔18.4微 升，加完后按排板顺序加相应的前后引物混合物，每 孔1.6微升。 5、贴膜，离心，上机，Real Time PCR扩增结束后输出 对照组和待测组的目的基因及内参基因的CT值。
• 理论上来说，PCR反应过程中生成的DNA产物是呈指 数方式增加的，即每增加一个循环，PCR产物加倍。 但随着反应循环数的增加，产物积累、原料消耗， 最终PCR反应无法继续维持指数方式的扩增，而进 入线性期和平台期。整个PCR反应过程中，只有在 指数期，PCR产物的量与加入的初始模板量存在明 确的数学关系（PCR产物量=初始模板量×2^N，N= 循环数），因此，利用公式，可以由产物的量精确 推算出初始模板量的多少。而在线性期和平台期， PCR产物量和初始模板量之间不存在准确的数学关 系，由这两个时期的产物量来推算初始模板量的多 少是不准确的。
荧光实时定量PCR rt-qPCR
定义 实时荧光定量PCR(rt-qPCR)：
•源自文库
在PCR反应体系中加入荧光基团，利用 荧光信号的变化对PCR过程进行 实时监控， 以此实现对初始模板的定量分析。
Rt-qPCR的应用
• mRNA表达的研究 • 微小残留病变的检测 • 肿瘤耐药基因表达的研究 • 病毒感染的定量监测
2、降低随机误差: 重复实验
• 生物学重复：样品三次重复 • 技术重复：每个样品做3-4个复孔
• 在相同的条件下，进行复制扩增，每扩增 一个循环，通过检验荧光来检测每个孔里 目标基因片段的含量，记录每个反应管内 的荧光信号达到设定的域值时所经历的循 环数（样本的域值循环数Ct），次数越多就 说明目标基因在原本的样品里越少，即初 始模板的量越少。
logX= n (1+E)+logX0
实验步骤
示意图
• Real-time定量PCR仪是在PCR反应体系中加 入荧光基团，利用荧光信号累积实时监测 和连续地分析整个PCR进程，随着反应时间 的进行，监测到的荧光信号的变化可以绘 制成一条曲线，最后通过标准曲线对未知 模板进行定量的分析。
SYBR Green
SYBR Green 能结合到双链DNA的小沟部位，只有和 双链DNA结合后才发出荧光，DNA双链分开就不发出 荧光，随PCR循环数的增加，产物量的增多，产生的 荧光信号逐渐增强，实现了荧光信号与产物量的关 联。
即实验组基因表达相较于对 照组上调或下调的倍数。
荧光定量PCR如何减小误差 1、校准生物学误差：内参(管家基因) 2、降低随机误差
1、校准生物学误差内参(管家基因)
内参基因(Endogenous Control) 用于校准实验过程中样品本身对定量结果的影响 原因：核酸提取时通常以重量，体积或细胞数为单位取 样，提取过程中存在得率差异和操作误差，造成 等量样品不一定获得等量提取物 目的：将定量结果校准为以基因组（或单个细胞）为 单位，不同样品之间才具有可比性 校准方法：[目的基因]-[内参]=均一化的目的基因表达量
PCR基本原理
• 试管中进行的DNA复制反应，依据 1.DNA半保留复制的机理 2.体外DNA分子于不同温度下可变性和复性的性 质 • 通过人为控制体外合成系统的温度，使 1.双链DNA变成单链 2.单链DNA与人工合成的引物退火 3.DNA聚合酶使引物沿着单链模板延伸为双链 DNA。
• 基本步骤 • 变性：加热使双链DNA变为单链（94℃， 30s） • 退火：降温使引物和互补模板在局部形成 杂交链 （55℃，30s） • 延伸：耐热DNA聚合酶按5′→3′方向催化以 引物为起始点的延伸反应（70~72℃， 30~60s）
• 理论上来说，PCR反应过程中生成的DNA产物是呈指 数方式增加的，即每增加一个循环，PCR产物加倍。 但随着反应循环数的增加，产物积累、原料消耗， 最终PCR反应无法继续维持指数方式的扩增，而进 入线性期和平台期。整个PCR反应过程中，只有在 指数期，PCR产物的量与加入的初始模板量存在明 确的数学关系（PCR产物量=初始模板量×2^N，N= 循环数），因此，利用公式，可以由产物的量精确 推算出初始模板量的多少。而在线性期和平台期， PCR产物量和初始模板量之间不存在准确的数学关 系，由这两个时期的产物量来推算初始模板量的多 少是不准确的。
荧光实时定量PCR rt-qPCR
定义 实时荧光定量PCR(rt-qPCR)：
•源自文库
在PCR反应体系中加入荧光基团，利用 荧光信号的变化对PCR过程进行 实时监控， 以此实现对初始模板的定量分析。
Rt-qPCR的应用
• mRNA表达的研究 • 微小残留病变的检测 • 肿瘤耐药基因表达的研究 • 病毒感染的定量监测
2、降低随机误差: 重复实验
• 生物学重复：样品三次重复 • 技术重复：每个样品做3-4个复孔
• 在相同的条件下，进行复制扩增，每扩增 一个循环，通过检验荧光来检测每个孔里 目标基因片段的含量，记录每个反应管内 的荧光信号达到设定的域值时所经历的循 环数（样本的域值循环数Ct），次数越多就 说明目标基因在原本的样品里越少，即初 始模板的量越少。
logX= n (1+E)+logX0
实验步骤
示意图
• Real-time定量PCR仪是在PCR反应体系中加 入荧光基团，利用荧光信号累积实时监测 和连续地分析整个PCR进程，随着反应时间 的进行，监测到的荧光信号的变化可以绘 制成一条曲线，最后通过标准曲线对未知 模板进行定量的分析。
SYBR Green
SYBR Green 能结合到双链DNA的小沟部位，只有和 双链DNA结合后才发出荧光，DNA双链分开就不发出 荧光，随PCR循环数的增加，产物量的增多，产生的 荧光信号逐渐增强，实现了荧光信号与产物量的关 联。
即实验组基因表达相较于对 照组上调或下调的倍数。
荧光定量PCR如何减小误差 1、校准生物学误差：内参(管家基因) 2、降低随机误差
1、校准生物学误差内参(管家基因)
内参基因(Endogenous Control) 用于校准实验过程中样品本身对定量结果的影响 原因：核酸提取时通常以重量，体积或细胞数为单位取 样，提取过程中存在得率差异和操作误差，造成 等量样品不一定获得等量提取物 目的：将定量结果校准为以基因组（或单个细胞）为 单位，不同样品之间才具有可比性 校准方法：[目的基因]-[内参]=均一化的目的基因表达量
PCR基本原理
• 试管中进行的DNA复制反应，依据 1.DNA半保留复制的机理 2.体外DNA分子于不同温度下可变性和复性的性 质 • 通过人为控制体外合成系统的温度，使 1.双链DNA变成单链 2.单链DNA与人工合成的引物退火 3.DNA聚合酶使引物沿着单链模板延伸为双链 DNA。
• 基本步骤 • 变性：加热使双链DNA变为单链（94℃， 30s） • 退火：降温使引物和互补模板在局部形成 杂交链 （55℃，30s） • 延伸：耐热DNA聚合酶按5′→3′方向催化以 引物为起始点的延伸反应（70~72℃， 30~60s）