食用菌的制种(母种的分离和培养)
食用菌实验
操作方法： ①将实验用的材料用品和仪器用具准备好、摆放整齐，并 按照超净工作台的使用方法使其处于工作状态。 ②在超净工作台的无菌区，按照无菌操作规程，进行常规 的手部消毒和器械的烧灼灭菌。随后用75%酒精棉球对 子实体进行表面消毒。 ③可以直接将子实体沿菌柄迅速纵向撕开，用灼烧灭菌后 的尖头镊子移取菌盖、菌柄交界处组织块（绿豆大小）。 移至试管斜面培养基的适当位置，迅速塞上棉塞。 ④将分离的试管放在25℃恒温箱培养，培养期间每天都要 检查菌种的萌发与生长情况，对污染的试管及时挑选、 处理。经过7～10 d培养，菌丝体长满试管，即为纯菌 种。
三、方法步骤 1．种菇选择 选择生长健壮、无病虫害、菇形正、大小适中、颜色 正常、尚未散发孢子、七八分成熟的子实体作为分离材料， 最好在第一潮菇中采摘，保持菇体洁净备用。 2．母种分离方法 （1）组织分离法。此法是生产中最常用的方法，它操 作简便，菌丝萌发快，分离所得的菌种遗传性较稳定，在 培养基条件适宜的情况下，能保持原有菇种的优良性状和 特性。
5．培养
接种后，在恒温培养箱中闭光培养，及时淘汰杂菌污 染的试管，一般10 d左右菌丝可长满管。
实验二
食用菌菌种的分离技术
一、目的要求 了解食用菌菌种分离基本原理，通过操作熟悉掌握子 实体组织分离、担孢子采集关键技术。 二、实验材料 1．材料用品 平菇、香菇等新鲜子实体、试管斜面培 养基、三角瓶培养基、95%酒精、75%酒精棉球、记号笔等。 2．仪器用具 超净工作台、酒精灯、尖头镊子、接种 针、接种铲、刀片、金属丝、培养皿、废物罐等。
3. 母种培养基的灭菌 按照手提式高压蒸汽灭菌锅的操作规程对培养基进行 灭菌。一般121℃灭菌30min。灭菌结束后待温度、压力降 到“0”，打开锅盖，让锅内多余蒸气逸出，利用锅体余 热烘干棉塞后取出已灭菌物品；趁热将试管摆成斜面，培 养基以试管长度的1/2到2/3为宜，斜面试管上应覆盖洁净 的厚毛巾或几层纱布，防止试管内产生过多的冷凝水。斜 面制成后，如不马上使用，可在5℃的冰箱中保存待用。
食用菌菌种分离的方法和操作步骤以及注意事项
食用菌菌种分离的方法和操作步骤以及注意事项食用菌菌种分离的方法和操作步骤菌种分离即是进行食用菌菌丝纯化的过程，它是制种工作的重要环节，通俗地讲就是把食用菌菌丝从自然中单独分离出来进行纯培养，从而获得纯食用菌菌丝的过程。
菌种分离是一项重要而又细致的工作，每个环节都必须严格按照无菌操作规程进行。
食用菌的分离方法很多，常用的有组织分离法、孢子分离法和基内菌丝分离法三种。
1.组织分离法组织分离法是将食用菌的部分组织移接到斜面培养基上获得纯培养的方法。
其特点：一是属于无性繁殖，能够保持原有菌种的优良特性，是生产中获得纯菌种的常用方法，且简单易行，取材广泛，菌丝萌发快。
二是组织分离操作简便，又不易带入杂菌，容易获得纯菌种。
但对银耳、黑木耳等胶质菌因其子实体种菌丝极少，如用组织分离培养，则往往不易成功。
1.1子实体分离种菇要选择朵大盖厚、柄短、八九分成熟的优良品种。
切去菇体基部，在超净工作台用75%的酒精棉球进行擦拭菌盖与菌柄两次，进行表面消毒。
接种时，只要将种菇撕开，用消毒后的小刀在菌柄与菌盖的交界处切取一小块组织，再用接种针将组织块放入PDA培养基的试管斜面中间。
置于24℃温度下培养3-5天就可以看到组织块上产生白色绒毛状菌丝，转管扩大即得到菌种。
如香菇、平菇等可以使用此方法。
1.2菌核组织分离茯苓、猪苓、雷丸等食用菌的子实体不易采集。
而常见的是它储藏营养的菌核。
用菌核分离，同样可以获得菌种。
方法是将菌核表面洗净，用酒精消毒，切开菌核，取中间组织一小块，约黄豆大小，接种在PDA培养基斜面上，在24℃下培养，产生菌丝后进行分离纯化。
应注意的是，菌核是储藏器官，大部分是多糖类杂质，只有少量的菌丝，因此挑选的组织块要大一些，如果组织块过小，则不易分离出菌种。
1.3菌索分离法菌索分离常用于蜜环菌分离。
方法是选新鲜的活菌索，用75%酒精棉球将菌索表面消毒后，去掉菌鞘，把白色菌髓部分用无菌剪刀切成小段，接入PDA斜面培养基上，在24℃下培养，有白色菌丝长出且无污染，即表明分离成功。
食用菌母种分离
一、实验目标：
1、掌握组织分离法制备母种的方法。 2、掌握组织分离接种技术。 3、会使用超净工作台和培养箱。
二、实验原理：
组织分离法是利用子实体组织来分离获得纯培 养菌丝的方法。
是一种无性繁殖，双亲的染色体没有经过重组， 因此组织分离基本上可保持亲本的生物学特 性。
三、仪器设备与材料
接种孢子
用接种环 蘸孢子液或孢子粉
涂布于平板上
七、菌种质量的鉴定
鉴定 项目
形态特征、生理特性、 栽培性状、经济效益等
一般从菌种的纯度、长势、颜色、菌龄、 、
均匀度和出菇快慢等6个方面进行鉴定。
好母种
退化母种
出菇试验
栽培
出菇快 产量高 品质好 抗逆性强
菌种种类 品种名称 菌种级别 代 时 生产厂家 接种日期
10、贴标签
写明菌种名称，接种日期，姓名，学号，专业， 随后放入培养箱中，置适宜温度下培养，待 组织块长出菌丝无污染即为纯种。
培养3~5天，就可以看到组织上产生白色绒毛状 菌丝，转管扩大即得到菌种。
十、结果
1、记录你制作的母种的生长状态； 2、是否有杂菌污染，如有分析其原因。
械及种菇表面消毒；
（3）0.1%KMnO4：一般用于用具、器皿消毒；
4、菌种培养没备
（1）培养箱 培养少量菌种的恒温电器（20~40℃）
（2）培养室
六、菌种分离的方法
菌种分离：将有价值的子实体的局部组织、孢 子或基内菌丝移接到斜面试管培养基上，获得 纯培养菌丝的操作称为菌种分离。
必 备
1、组织分离：采用食用菌子实体或菌核、菌索 的任何一部分组织培养成纯菌丝体的方法。
无
0.25%新洁尔灭浸2~3min 无菌纱布吸干表面水分
食 用 菌 制 种 技 术 1
食用菌制种技术 1食用菌制种前言食用菌生产所用的菌种，是提供繁殖而分级制作的菌丝体培养物，相当于高等植物的种子。
在自然界中，食用菌繁衍后代依靠孢子，孢子在适宜的环境下，萌发成菌丝体。
菌丝体生长繁衍达到生理成熟后，在适宜的环境下，就可形成子实体。
在人工栽培食用菌时，孢子虽然是它的种子，但人们至今都不用孢子直接播种，而是用孢子或子实体组织萌发而成的纯菌丝体作为播种材料。
因此，通常所指的菌种，实际上是经过人工培养并进一步繁殖的食用菌的纯菌丝体。
制种是食用菌生产最重要的环节。
常言道：“有收无收在于种，收多收少在于管”，可见菌种在生产中的重要性。
在食用菌生产过程中，菌种好坏，直接影响食用菌的产量和质量。
因此，培育优良菌种，是提高食用菌生产水平的重要环节。
人工培养的菌种，根据菌种培养的不同阶段，可分为母种、原种和栽培种三类。
一般把从自然界中，首次通过孢子分离或组织分离而得到的纯菌丝体称为母种，或称一级种。
它是菌种类型的原始种。
原始母种通过移接(转管)成数支试管(斜面)种，这些移接的试管种，亦可称为母种。
把母种移接到木屑、谷粒、棉籽壳、粪草等瓶(袋)培养基上培养而成的菌种称为原种，或称二级种。
它是母种和栽培种之间的过渡种。
把原种扩接到相同或类似的材料上，进行培养直接用于生产的菌种称栽培种，或称三级种。
制作菌种的具体操作工艺流程见图4—1。
原种和栽培种，均能直接用于生产。
栽培种不能再扩大繁殖栽培种(银耳菌种例外)，否则会导致生活能力下降。
分离母种培养基制备→高压灭菌→接种→筛选提纯→原始种→中试后确定母种↓↓—————转管扩接←保贮↓原种培养基制备→高压或常压灭菌→接种→培养→原种∣↓栽培种培养基制备→常压或高压灭菌→接种→培养→栽培种图4-1 制种工艺流程图食用菌的菌种生产，基本上是按菌种分离→母种扩大培养→原种培养→栽培种培养的程序进行。
菌种通过三级扩大，菌种数量大为增加，同时菌丝也从初生菌丝发育到次生菌丝，使菌丝更加粗状，分解基质的能力也增强。
菌种分离与培养
菌种分离与培养（1）人们采取无菌操作的方法，把某种食用菌从混杂的微生物中，单独地分离开来，这个过程叫做菌种分离。
从分离过程中得到的菌丝体纯化后，就是纯菌种。
在实验室条件下，以人工使纯菌种大量生长和繁殖的方法，叫做培养。
一、母种培养(一)菌种分离菌种分离通常采用的方法有孢子分离法、组织分离法和寄主分离三种方法，三种方法各有特点，可根据不同的菌类和生产条件选择使用。
1.孢子分离法孢子分离法，是利用成熟子实体的有性孢子能自动从子实体层中弹射出来的特性，在无菌条件下和适宜的培养基上，使孢子萌发成菌丝，而获得纯种的一种方法。
(1)孢子的采集①种菇的选择用作分离菌种的种菇，应选择出菇早、朵型好、个体肥大、生长健壮、无病虫害、八成熟的菇体。
一进入出菇期，就要注意观察选择，并作好标记。
不同的食用菌选择的具体要求是：香菇菇型圆整，菇体肥大，柄细而短，菌盖呈深褐色，出菇早，无病虫害，一般为八成熟的子实体。
双孢蘑菇菇型圆整，光滑直立，颜色洁白，柄粗盖厚，无病虫害，生长快而健壮的单生菇。
草菇菇型端正，肥大健壮，包被未破，无病虫害的单生菇。
平菇出菇早，菌盖厚实，重叠丛生，菌柄粗短，色泽鲜亮，尚未散发孢子，八成熟而无病虫害的子实体。
木耳选朵大、耳片厚、色黑、生长健壮、褶皱多、无病虫害的春耳。
银耳朵大肉肥、色泽洁白、展片良好、朵型美观、八成熟、无病虫害的子实体。
猴头形状正常、颜色洁白、出菇早、生长健壮、菌刺丰满、无病虫害的子实体。
金针菇出菇早而均匀、生长健壮、朵型正常、菌柄长短适中、无病虫害的子实体。
②种菇的消毒子实体采回后要及时切除基部，并进行表面消毒。
对子实体层未外露的种菇(如蘑菇等)，可浸入0.1%升汞溶液中消毒约1分钟，用镊子捏出后经无菌水冲洗数次，再用无菌纱布将表面水吸干；对于子实层裸露的种菇(如香菇等)，只能用75%酒精揩擦菌盖及菌柄表面；而对于银耳、木耳类子实体，却千万不能接触消毒剂，只能置于烧杯中用无菌水洗涤，然后捏起再经无菌水冲洗数次，同样用无菌纱布吸干表面水。
食用菌母种怎么提取-
食用菌母种怎么提取?
食用菌母种：子实体中分得的菌种称为母种.
可以找专门做食用菌的实验室帮你做.一般用PDA培养基或者水琼脂培养基就可以.
仪器设备有：75%和95%的酒精,次氯酸钠,超净工作台,平皿,试管,滤纸,解剖刀,镊子,干热或湿热灭菌设备.
方法：
1制备培养基：称马铃薯200g,琼脂20g,蔗糖或葡萄糖20g,琼脂20g,取马铃薯削皮洗净,切成拇指大的小块,加入1000ml水煮至马铃薯块一触即烂,用四层纱布过滤,将滤液继续加热放入琼脂并搅拌直至琼脂完全溶解,加入蔗糖,装置容器内（一般为三角瓶,如是试管可直接分装）灭菌.
2灭菌后,如是试管直接摆斜面,如是平皿在超净工作台内分装,待培养基凝固即可用.
3开始分离母种：将采集到的野生菌,与要用的所有仪器试剂一起放入超净工作台内,紫外杀菌30mim,采用子实体分离方法,用酒精盯烧过的镊子和刀取菌种中未接触到空气的部分,黄豆粒大小,放入平皿培养基内,封号口放入26度的培养箱内3-5天,如未染菌,则在菌肉周围会有菌丝长出,此为母种.在超净工作台内,用接种针将菌丝挑出,放入试管中,继续纯化培养,放入，分离成功!
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食用菌栽培实验报告
食用菌栽培实验报告一、实验目的1.学习和掌握食用菌的组织分离法制作食用菌母种；2.掌握食用菌培养基的配置原理；3.通过平菇、秀珍菇、金针菇、鸡腿菇、香菇、榆黄菇的栽培实验，掌握食用菌代料栽培的一般方法和栽培管理技术。
二、实验原理（一）食用菌母种的制作食用菌的母种一般是采用孢子分离法或组织分离法得到的纯培养物。
利用食用菌子实体内部组织进行分离，是获得母种最简便的方法。
（二）平菇、秀珍菇、金针菇、鸡腿菇、香菇、榆黄菇的栽培实验1.食用菌的营养物质食用菌在生活时需要多种多样的营养物质，除水和氧气外，还要碳、氮、钾、磷、硫、镁、铁等大量元素和一些微量元素。
各种食用菌对营养物质的要求各不相同，有的要求不严格，有的要求严格。
[1]碳源：能利用自单糖到纤维素等各种复杂的碳水化合物，如：纤维素、葡萄糖、果糖、蔗糖、麦芽糖、半乳糖、糊精、淀粉、半纤维素、木质素、有机酸、某些醇类等。
[2]氮素：是食用菌合成蛋白质和核酸必不可少的主要原料。
主要有蛋白质、氨基酸、尿素、氨、铵盐和硝酸盐等。
蛋白质必须经蛋白酶分解成氨基酸后才能被吸收；其他小分子氮素化合物菌丝体可直接吸收。
[3]碳氮比:一般认为食用菌在营养生长阶段碳氮比（C/N）以20 : 1为好，而在生殖生长阶段碳氮比以30 : 1～40 : 1为好。
[4]无机盐类，如：磷酸二氢钾、硫酸钙、硫酸镁、氯化钠、硫酸锌、氯化锰等。
这些无机盐中的金属元素磷、钾、镁为最重要，适宜浓度是每升培养基加100—500毫克，而铁、钴、锰、锌、钼等微量元素，每升培养基只需1／4毫克。
这些金属元素在普通水（河水、自来水）中都有，一般培养料不再添加。
[5]各种维生素和生长素，量很微，但必不可少。
[6]栽培原料:广泛采用棉籽壳。
棉籽壳含粗蛋白73％，粗脂肪3.45％，粗纤维36.99％，无氮浸出物73.99%。
其物理性能良好，能使水分和空气的矛盾得到解决，以满足菌丝生长的要求，棉籽壳的表面密布的一层棉纤维，在合适的水分、空气和温度的条件下首先分解，加之壳内残存的棉籽碎屑，也易分解利用；经过试验，1斤干棉籽壳能产1斤左右的鲜平菇，最高达4斤左右。
食用菌母种生产技术
食用菌母种生产技术食用菌母种生产技术母种生产主要包括培养基制备、纯种分离或转管扩大、培养等环节。
一、母种培养基制备1.母种培养基常用配方（1）PDA培养基：马铃薯(去皮，下同)200克，葡萄糖20克，琼脂18-20克，水l000毫升。
（2）加富PDA培养基①综合PDA培养基：马铃薯200克，葡萄糖20克，磷酸二氢钾3克，硫酸镁1.5克，维生素B110毫克，琼脂18-20克，水1000毫升。
②蛋白胨－综合PDA培养基：在加富PDA培养基①中添加5克蛋白胨。
③麦麸－PDA培养基：在培养基（1）中添加100克麦麸。
④麦芽汁－PDA培养基：在培养基（1）中添加50克大麦芽。
（3）鲜蘑菇浸出液培养基：鲜蘑菇200-250克，葡萄糖20克，琼脂18-20克，水1000毫升。
将蘑菇切碎，煮30分钟，取其液汁。
（4）粪汁培养基：干马粪或牛粪150克，葡萄糖20克，琼脂20克，水1000毫升。
将马粪或牛粪打碎，煮沸30分钟，取其溶液。
（5）完全培养基（CM）培养基：蛋白胨2克，葡萄糖20克，磷酸二氢钾0.46克，硫酸镁0.5克，磷酸氢二钾1克，琼脂18-20克，水1000毫升。
2.母种培养基制作方法不同配方培养其制作方法基本相同，现以综合PDA培养基为例介绍其制作方法。
（1）培养基制作。
将土豆洗净、去皮、挖去芽眼及变青绿部分，称取200克，切成约长宽各2厘米厚3毫米左右的薄片，在1200毫升水煮沸10－15分钟，然后用4－6层纱布过滤，倒掉残渣并洗净铝锅。
将滤液倒入锅内，加清水补足 1000毫升，同时放入琼脂并重新开始加热，最好小火加热，不断搅拌至琼脂完全溶化，再用纱布过滤一次，补水至1000毫升。
最后依次将称好的葡萄糖、磷酸二氢钾、硫酸镁和维生素加入，继续加热并搅拌至全部溶化，停止加热。
如果要加入蛋白胨需将蛋白胨用冷水溶化后加入，可以避免蛋白胨因结块而分散不均。
图3－11 试管分装（2）分装试管。
左手持3-4支试管，管口朝上，令下端整齐，上移试管至漏斗软管，插入试管内约3厘米。
食用菌母种的分离
孢子收集器示意图
3、母种转管接种与培养。
母种的接种必须在严格的无菌条件下进行。 否则将会造成严重污染，给生产造成造成巨大损失。 然后将所有试管及接种器具放入接种箱里进行消毒 灭菌，力求灭菌彻底。在点燃酒精灯火焰上进行操 作，将菌种试管和接种用斜面培养基放在火焰旁。 拨去棉塞，把消毒灭菌的接种针伸入菌种试管内， 挑小块菌种放入斜面培养基中（见下图）
3.工艺流程：
称量→煮制→分装→灭菌 → 排斜面→无菌检验
培养基的分装及排斜面示意图
（二）、母种的接种与培养
1．组织分离法制母种（无性繁殖） 将子实体、菌核、菌索等一小块组织放
于斜面培养基上，使其萌发为纯菌丝的方法， 称为组织分离。该法具有简便、易成功、能 保持原菌种性状等优点，但重复多，易退化， 应与孢子分离交替进行。组织分离法适用于 绝大多数食用菌
② 棉子壳培养基：棉子壳99.5%，石膏 0.3%，水适量。适用于培养平菇、猴头、金 针菇、鸡腿菇。
3.培养料的配制 ⑴ 木屑、棉籽壳培养料的拌料配制
木屑、棉籽壳培养料按配方称量后，堆制 混和，加水拌料，配方中的糖也可先溶于水 中再拌入。拌料时要控制料的含水量在60﹪ 左右 。
⑵ 谷粒培养料的配制
菌柄与菌盖交界处取组织块
用解剖刀或鲜剖剪蘸酒精进行火焰消毒，冷却后把自己消毒 的种菇纵切开，然后用菌盖笔菌柄交界处，切取长宽的 0.3~0.5厘米的菌肉组织块，用接种针移到斜面培养基上，置 24℃恒温箱中培养。
检查选
每天检查试管斜面菌落生长情况，如从分离的菌肉组织块上 长出正常的白色菌丝，即分离成功，及时将生长出来的菌丝 转移新的试管斜面。若在组织块附近或其他地方出现其他颜 色杂菌生长应予以淘汰。
谷粒因其营养较丰富，制作的菌种具有菌 丝萌发早、吃料快、抗衰老能力强、产量高 等优点，在生产中应用较多。一般是采用浸 泡法或煮熟法，也可用石灰水浸泡。
食用菌母种制作技术
食用菌母种制作技术母种是从子实体中提纯，复壮获得母种，人工栽培蘑菇成功的关键是菌种，只有优良的菌种才能达到优质高产，这是种植蘑菇高产的第一个要素。
母种制作：母种培养基配制：母种培养基的原料是马铃薯，葡萄糖，蛋白胨，水，琼脂粉，以配制一千毫升的母种培养基为例，将马铃薯去皮后称重200克，葡萄糖20克，琼脂粉20克，蛋白胨10克，用量杯量取1000毫升的水倒入锅中，用刀将马铃薯切成片加入锅中，用文火煮沸，煮至用筷子轻轻一插既可插入，这时可以用四层的纱布过滤煮好的马铃薯汁，然后倒在量桶里，看一下，如果不足一千毫升可加水补足一千毫升，在倒入锅中煮，最后加入称好的葡萄糖、琼脂粉、蛋白胨，为了防止锅底烧焦要边加热边搅拌，煮至完全溶化，母种培养基就配制好了。
母种培养基的分装：母种培养基配制好后要分装以试管中，这里用到的试管规格为18毫米X200毫米，每7根试管扎成一捆，分装培养基时用漏斗下面接一根塑料管，在通塑料管接装到试管内，分装量为试管高度的五分之一左右，分装完后及时用棉塞装试管口塞住，防止其它杂菌侵蚀。
要注意，母种培养基的温度降到45度以下时凝固，所以分装过程要在母种培养基凝固之前完成。
母种培养基的灭菌：用白纸包裹试管口，在用绳子将白纸扎紧，将试管放入高压来菌锅中高压来菌，盖上锅盖，压紧螺帽，在压力为0.5MPa条件下持续来菌30分钟，来菌完后在让其在锅内自然冷却一小时，待压力为零时就可以打开锅将试管取出来，这样母种的培养基就制作好了。
制作母种：母种接种：母种的接种也是在无菌工作室的无菌箱中进行的，另外要选取品质优，长势好的蘑菇来提取菌丝，分别用酒精棉球擦拭双手和蘑菇表面进行消毒，点燃酒精灯然后把长柄小刀放在酒精灯火焰上消毒2至3秒钟，用消毒后的小刀割开新鲜蘑菇的菌柄，在菌柄与菌盖连接处用小刀切割一小块蘑菇组织，打开母种培养基试管瓶塞，为了避免杂菌感染，要将试管口靠近酒精灯火焰，用长柄钩针钩取切割好的蘑菇组织带到试管中，放在试管培养基斜面的中部，退出长柄钩针，将棉塞在火焰上消毒，塞住试管口，母种的接种工作就完成了。
食用菌制种技术
食用菌制种技术菌种生产程序，通常分为母种、原种和栽培种3个层次，也就是通常所说的一级、二级、三级菌种。
其中母种的分离选育技术性强，要求精化；而原种和栽培种的制作则相对比较简单。
下面介绍各级菌种的制作技术。
一、母种的分离选育母种主要采用人工选择、诱变育种、杂交育种和原生质融合等手段获得。
作为一般制种专业户，可以采用人工选择方式分离培育母种，具体步骤与操作方法如下。
1.采集种源从野生或人工栽培群体中，选择有代表性的优良菇体作为种源。
①种菇选择时间。
一般在11月上中旬，在第1批和第2批菇中挑选。
因为这段时间蘑菇生长正是旺盛时期，菌丝生活力强，子实体健壮，质量好，加之气温适宜，蘑菇能正常成熟。
②种菇的标准是：八成熟，朵形圆正，肉质肥厚，颜色洁白，无病虫害。
采集一二朵符合上述标准的种菇编上号码，作为分离母种的材料。
从栽培室采集的应标有原菌株代号。
2.培养基配制琼脂培养基又叫PDA培养基，常用配方为：马铃薯200克、琼脂16克～18克、葡萄糖20克、水1000毫升。
先将马铃薯洗净去皮，切成薄片，置于铝锅内加水煮沸15分钟～30分钟至薯块酥而不烂为止。
煮后用6层～8层事先浸湿拧干的纱布过滤，过滤后加入琼脂16克～18克（气温低时加16克，气温高时加18克）再煮，并不断搅拌，使固体琼脂完全溶化，再用4层～6层纱布过滤。
将滤液加水至1000毫升加入20克葡萄糖，搅拌溶化趁热分装试管。
装入量为试管高度的1/4～1/5，注意培养基不要粘着试管口，管口用棉塞塞紧，或将汁液装入玻璃三角瓶内，每瓶装量为20毫升。
然后置于高压锅内，在压力达108千帕，锅内温度为121℃灭菌30分钟左右。
灭菌后及时取出，趁热将试管斜排于桌上，冷却后即成为固体斜面培养基。
食用菌组织分离法实验报告
食用菌组织分离法实验报告食用菌母种的制作——组织分离法实验报告实验目的：学习和掌握食用菌的组织分离法；一、实验原理：食用菌的母种一般是采用孢子分离法或组织分离法得到的纯培养物。
利用食用菌子实体内部组织进行分离，是获得母种最简便的方法。
二、实验器材：1. 食用菌：香菇、平菇。
2. 培养基：PDA培养基斜面。
3. 仪器或其他用具：75%酒精棉球、接种针记号笔等。
三、实验方法：1. 选择种菇：选择肥壮菇体作种菇；2. 种菇消毒：取1张菇片，用 70%的酒精轻擦表面进行消毒；3. 菇肉接种：将菇片纵向撕开，在每个裂面靠近菇柄与菌盖的交界处取一米粒大小的菇肉组织接于PDA试管斜面上；4. 培养：将试管斜面置于15～30℃下培养；五、注意事项1. 在整个操作过程中都要注意无菌操作，一切用具都要消毒。
2. 要等刀片冷却后再切取组织块。
六、实验结果与记录第一次实验：10月16日上午进行接种，两试管都以肥壮的双孢菇为种菇，10月13日观察培养基结果分析：本次实验全班只有一人成功，大部分都被杂菌污染，最有可能的原因就是制作的PDA培养杂菌没有菌落产生基本身受到污染，但是又有培养基根本没有菌落产生，那么一方面可以看做是空白对照，得到培养基本身没有问题而是我们操作都有问题，没有做到避免污染，规范的无菌操作，另一方面也有可能是在接种过程，接种针，试验刀酒精灯上灼烧后未冷却直接接触种菇，使待接种的菌块高温致死。
第二次实验：10月30日上午进行接种，记号笔标记的两支试管为双孢菇，标签纸标记的两只试管为香菇进行实验，10月9日观察实验基本成功，试管下端有少部分红棕色杂菌无杂菌，也无目的菌落实验成功，无杂菌，斜面上均为雪白的菌丝结果分析：培养基本身无污染，接种香菇菌块的过程中可能由于接种针和实验刀未完全冷却导致目的菌块高温致死，培养基上无菌落产生。
接种双孢菇菌块过程中基本做到了无菌操作，实验较为成功。
实验感想：本实验原理目的简单，操作过程方法在微生物学中也有接触，但是容易杂菌污染，第一次实验结果几乎全军覆没，几乎所有培养基都受到了污染，第二次实验在总结前一次的基础上，大部分做到了无菌操作，看到了培养基中雪白的菌落。
食用菌母种、原种、栽培种制作步骤
食用菌母种、原种、栽培种制作步骤食用菌菌种的质量对食用菌生产至关重要。
菌种的好坏，菌种的保存直接影响到食用菌的产品质量和产量、效益和成败，所以我们要制作优良的食用菌菌种，更要有优良的菌种保存方法，以保存菌种的生活力和优良性状，确保菌种纯种、无污染。
一、菌种制作食用菌菌种分三种即母种（一级种）、原种（二级种）、栽培种（三级种）1.制作母种（一级种）1.1菌种采集选择健壮无病虫害的食用菌子实体。
经表面消毒后，放在无菌的厚纸上，使子实体菌褶向下，在通风条件下经过12--24h，等子实体放出孢子后，将纸折叠起来风干，放入塑料袋中，里面放几粒干硅胶，封好口，放入2--4℃冰箱中，可保存起来长期备用。
1.2母种培养基制作配方：马铃薯200g、琼脂20g、葡萄糖20g、纯净水1000ml。
先把马铃薯切成大约1cm大的小方块，放入1000ml 纯净水中煮30min，过滤后加入琼脂、0.2-0.3%的磷酸二氢钾、再加入20g葡萄糖，溶解后分别装入试管，每个试管装量1/5-1/4，用棉塞封好试管口，外加塑料膜扎紧，放入压力灭菌锅1.3㎏/cm灭菌30min，待温度降至60℃将试管摆成30-35度倾斜面，冷却后观察几天，无受到杂菌污染即可接种，孢子液用灭菌的自来水将孢子稀释，在无菌操作环境下将孢子悬浮液移到试管琼脂斜面上，在25℃下培养，很容易萌发生长成菌丝，然后用石蜡封口置于4-5℃恒温箱中可保存6个月。
2.制作原种（二级种）将木屑78%、麦麸20%、糖1%、石膏1%加入水拌匀（100kg料加125kg水），培养基原料拌匀后拿试纸测ph 值，ph值在6-7为宜，然后装入大口的罐头瓶至瓶肩部，将培养料压平压紧，抹干净瓶的培养料，拿完好无破损的塑料薄膜扎紧瓶口，放入压力灭菌锅1.4-1.5㎏/cm灭菌1.5-2h，冷却至25℃即可进行无菌接种，用接种针从母种试管斜面上挑取少量菌丝体接入瓶中，接种后在25℃恒温箱中培养30d菌丝可长满，即可作为原种（二级种）。
食用菌母种的制作培养
食用菌母种的制作培养用试管制成斜面培养基，并接种原始试管种(保留种，并用于生产的母种即为生产母种，可用于扩接原种。
1．培养基配方配方一综合马铃薯培养基马铃薯 200克葡萄糖20克磷酸氢二钾2克硫酸镁0.5克维生素B110毫克琼脂20克水1000毫升 PH值自然配方二合成培养基马铃薯 200克葡萄糖20克磷酸二氢钾2克蛋白胨10克牛肉膏5克酵母膏5克硫酸镁0.8克水1000毫升 PH值自然2．培养基制作方法先将马铃薯洗净去皮切成簿片，称取200克，加水1000毫升，煮沸15—20分钟，用4层纱布过滤，取其滤液并补足水至1000毫升，加入琼脂20克，再加热，琼脂溶化后，再加入其它配方中的药品。
培养基的分装，应在培养凝固前进行（琼脂培养基40℃凝固）一般用漏斗，或分装瓶，下端连接一段软橡皮管，橡皮管下面再连接一水段玻璃管，在橡皮管上安装一个止水弹簧夹，分装时将玻璃管细口插入试管内，但不要碰到管壁，每支试管装入量为度管长度1/4。
装好后塞上棉塞，每10支试管扎一捆，棉塞上用塑料纸封扎好，用线绳捆扎起来。
3．灭菌将分装后的试管扎捆好，放入高压蒸气灭菌锅，在1公斤/厘米压力下(锅入温度达121℃)灭菌20分钟,使微生物包括芽子色全部杀死。
待压力降到0度时，慢慢放出锅内气体，趁培养基没有凝固时，将试管摆成斜面。
4．接种与培养通过无菌操作方法将菌种接入试管斜面上，置28℃、3天后将温度降至24℃继续培养，12—15天左右，菌丝长满整个试管斜面，即成(生产)母种。
原种的制作母种接种到原种培养基上，进行扩大繁殖育种即为原种，原种一般采用广口瓶或袋装。
1．培养基配方配方一木屑麸皮培养基阔树木 78% 麸皮 20% 糖 1% 石膏粉 1% 水 65% PH值自然配方二棉籽壳木屑混合培养基棉籽壳 90% 糖 1% 麸皮 5% 过磷酸钙 3% 石膏粉 1% PH值自然2．拌料与装袋选用新鲜无霉变原料，根据生产所需的数量，计算配料总量，将麸皮、石膏粉均匀的混合在培养料里，糖和过磷酸钙溶于水解后，按上述干料量加入水，比例为1：1、3拌匀，培养料含水量60%为宜，含水量以手紧握培养料指缝间有水欲滴为宜。
菌种的分离与培养
在自然界里，食用菌都不是单独存在的，而是和许多细菌、放射菌、霉菌等生活在一起的。
所谓菌种分离，就是把这些和食用菌一起生活的杂菌分离出来，通过培养，获得纯的优良菌种。
菌种分母种、原种、栽培种。
(一）母种的分离培养食用菌母种的分离，可分为孢子分离法、组织分离法以及基内菌丝分离等。
1.孢子分离法孢子分离法，是用食用菌的有性孢子或无性孢子萌发成菌丝，培养成菌种的方法。
这种菌种生活力较强，但孢子个体之间有差异，且自然分化现象较严重，变异大，需经出菇试验才能在生产上应用。
（l）单孢分离法：是每次或每支试管只取一个担孢子，让它萌发成菌丝体来获得纯菌种的方法。
蘑菇和草菇用单孢分离得到的菌丝，有结实能力，可采用此法分离生产纯菌种。
单孢分离生产上较少采用，而且技术复杂，一般采用多孢分离法。
（2）多孢分离法：就是把许多孢子接种在同一培养基上，让它们萌发、自由交配来获得食用菌纯菌种的一种方法。
具体操作方法，有以下几种：①种菇孢子弹射法：选择个体健壮、朵形圆正，无病虫害、出菇均匀、高产稳产，适应性强的八九分成熟的种菇，切去大部分，菌柄用无菌水冲洗数遍后再用已灭菌的纱布或脱脂棉、滤纸吸干表面水分。
在接种箱或无菌室内，把种菇的菌褶朝下用铁丝倒挂在玻璃漏斗下面，漏斗倒盖在培养皿上面；上端小孔用棉花塞住。
培养皿放在一个铺有纱布的搪瓷盘上，静置12～20小时，菌褶上的孢子就会散落在培养皿内。
形成一层粉末状孢子印（平菇极淡紫色，蘑菇、草菇为褐色，香菇、金针菇孢子印白色）。
用接种针沾取少量孢子在试管中的琼脂外面或培养皿上划线接种。
待孢子萌发，生成菌落时，选孢子萌发早、长势好的菌落进行试管培养。
还可用孢子采集器收集孢子。
方法是选好种菇后，按上述程序，轻轻掀开玻璃钟罩，将种菇柄朝下插在孢子采收器的钢丝架上，放在培养皿正中央。
随即盖好玻璃罩，用纱布将钟掌周围塞好。
并在纱布上倒少许升汞或无菌水。
移入20℃左右恒温箱培养。
②褶上涂抹法：按无菌操作分离时；应选择成熟的种菇，用接种针直接插入褶片之间，轻轻抹取褶片表面子实体尚未弹射的孢子，再在培养基上划线接种。
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食用菌的制种（母种的分离和培养）()---食用菌菌种质量的优劣，直接影响到栽培的成败和产量的高低，只有优良的菌种，才能获得优质高产的食用菌。
因此食用菌的制种，是生产中一项极其重要的工艺。
食用菌的菌种按培养阶段和来源的不同，可分母种、原种和栽培种三种。
从食用菌的孢子分离培养或从组织分离培养、基内菌丝分离培养所得到的第一代菌丝体，称为母种。
从母种扩大培养的菌丝体，称为原种。
从原种扩大培养直接用于生产上播种的菌丝体；称为栽培种。
一、母种的分离和培养（一）母种培养基的配制1.母种培养基的种类母种是菌种生产的关键，要求纯度高，不能混生杂菌，同时母种的菌丝体较为纤细，分解培养料的能力较弱。
因此，母种菌丝体需要培养在营养丰富，易被吸收，表面光滑易于鉴别有无杂菌感染的琼脂培养基上。
适合母种菌丝生长的琼脂培养基种类很多，常用的有下列几种：（1）马铃薯——葡萄糖——琼脂培养基马铃薯（去皮） 200克琼脂 20克葡萄糖（或蔗糖） 20克水 1000毫升（2）麦芽汁——葡萄糖——琼脂培养基干麦芽 250克琼脂 15～20克葡萄糖（或蔗糖） 10克水 1000毫升（3）胡萝卜——葡萄糖——琼脂培养基胡萝卜 100克琼脂 20克葡萄糖（或蔗糖） 20克水 1000毫升（4）蘑菇汁——葡萄糖一一琼脂培养基（适用于蘑菇）鲜蘑菇 250克琼脂20克葡萄糖（或蔗糖） 20克水 1000毫升（5）蛋白胨——葡萄糖——琼脂培养基蛋白胨 2克葡萄糖 20克磷酸氢二钾 2克维生素B1（硫胺素） 0.5毫克磷酸二氢钾 0.5克琼脂 18克硫酸镁 0.5克水l000毫升2.母种培养基的制法兹以最常用的马铃薯——葡萄糖——琼脂培养基的制法为例介绍如下：先将马铃薯去皮，洗涤，切成小块，加水1000毫升，煮沸15～20 分钟，取双层纱布过滤，取其滤液，加入琼脂和葡萄糖（或蔗糖），用文火加热使其溶化，最后补足水分，使其容量仍为1000毫升。
趁热分装于试管中，装量约为试管长度的1/5左右，装管时要注意不使培养基沾污试管壁和试管口。
试管口塞上大小合适的棉花塞，塞入试管口内的长度为棉塞总长的3/5。
塞好棉塞后，每10支作一捆，用牛皮纸包扎好后，置铁丝网笼中，然后进行高压灭菌。
如作为孢子分离用，则将培养基分装于三角瓶或培养皿中，然后高压灭菌。
3.母种培养基的消毒灭菌母种培养基通常用高压蒸汽灭菌锅来消毒灭菌，常用的高压蒸汽灭菌锅有直式、卧式和手提式三种。
将配制好后的母种培养基移入上述任何一种高压蒸汽灭菌锅中，在15公斤/平方厘米压力下，消毒灭菌30分钟。
高压蒸汽灭菌主要是依靠提高蒸汽的温度来灭菌的，因此灭菌时，应将锅内的冷空气全部排除。
否则，尽管压力表上的压力已达到要求，然而，灭菌锅内的温度却未达到所需的温度（表11）。
排除冷空气的方法是加热后当压力表上指针上升到0.5公斤/平方厘米时，打开排气阀，放气至指针仍回到“零”的位置。
灭菌的时间是以排除冷空气后，压力回升到1.5公斤/平方厘米时才开始计算。
每次灭菌之后，要等压力降到“零”时，才打开锅盖，否则，灭菌的液体会因突然减压而外溢，玻璃器皿也会因突然降温而破裂。
表11高压灭菌时压力的换算及其与温度的关系磅/平方英寸公斤/平方厘米灭菌器中的温度（?）排除空气未排除空气5 0.352 108.4 7210 0.703 115.2 9015 1.055 121.0 10020 1.406 126.0 10925 1.758 130.4 11530 2.109 134.5 121在没有高压蒸汽灭菌锅设备的情况下，可用蒸锅、蒸笼等进行常压灭菌。
由于密封性差，压力升不高，温度只能升至102?左右，因此要连续蒸4～6小时才能达到灭菌的目的。
高压严菌后将试管取出排成斜面备用。
（二）母种分离材料的选择1.子实体的选择无论是用作孢子分离或组织分离的子实体，都要从产量高，长势好，适应性强，无杂菌虫害的群体中，选择朵大，生长健壮的单生子实体作为分离的材料。
选作分离的子实体，成熟度要适当，如蘑菇、草菇具有菌膜，最好选菌膜将破而未破的成熟度，这种子实体发育已成熟，子实层又未受污染，因此能很快散出大量的无菌孢子。
对没有菌膜或菌膜自幼已破的食用菌，如香菇、平菇等，则以选取八分熟，正在释放孢子的个体为最好；因为刚从担子弹射出来的孢子基本上也是无菌的。
2.菇木和耳本的选择木生食用菌如香菇、银耳、黑木耳等，可以从它们生长的基质，即菇木和耳木作为分离的材料。
选择时，应从野生或人工栽培场所挑选子实体生长健壮，朵大，长势好，菌丝在段木中发育旺盛，材质较为结实，尚未腐烂，一般是接种后一年内已出菇、出耳而无杂菌害虫感染的幼龄菇木或耳木为最好。
采去子实体后，截取适当部位，挂于通风处风干后，供分离时用。
（三）母种的分离方法1.孢子分离法是利用食用菌的有性孢子或无性孢子，萌发成菌丝，获得细菌种的一种方法。
按分离时挑取孢子的数目不同，又分为单孢子分离法和多孢子分离法两种。
蘑菇、草菇等由于孢子没有性的区别，采用单孢子分离获得纯菌种，有结实能力，而其它食用菌如香菇、银耳、黑木耳等由于孢子有性别之分，单孢子分离得到的菌丝不能结实，所以，只在育种上采用，生产上很少采用。
多孢子分离法，是把许多孢子接种于同一培养基上，让它们萌发，自然交配而获得纯种，操作简单易学，生产上经常采用。
由于采集孢子的方法不同又分为如下几种：（1）采集器孢子弹射法采集孢子的装置可用玻璃钟罩或玻璃漏斗做成。
蘑菇和香菇常用这种方法采集孢子。
具体做法是：把玻璃钟罩或玻璃漏斗，放在一个垫有几层纱布的瓷盘上，内放培养皿和不锈钢支架（漏斗内也可倒挂铁丝代支架），上端通气孔用棉花塞住，然后用二层大纱布将整个装置包起来，高压灭菌后；移入无菌室备用。
分离时把选好的种菇（八、九分成熟），切去菌柄基部送入无菌室，用0.1％～0.2％的升汞溶液或75％的酒精表面消毒1～2分钟后，放在无菌水中漂洗，除去表面药液，再用灭菌纱布揩手，插到不锈钢支架上或铁丝构上，静置1～2天，菌褶上的孢子大量散落到培养皿内，形成一层粉末状孢子印时，取下种菇，用灭菌的注射器，吸取3～5毫升无菌水，注入盛有孢子的培养皿中，轻轻搅动，便孢子均匀地悬浮于水上，再将注射器插上针头，吸取沉于底部的饱满孢子，注l～2滴悬液于试管斜面培养基，并使其均匀分布于培养基表面。
或用接种针挑取少量的孢子直接在斜面培养基上划线。
待孢子萌发，生成菌落时，选孢子萌发快，生长良好的菌落，移接到新的斜面培养基上培养。
（2）三角瓶约悬法银耳、黑木耳常用此法采集孢子。
兹以银耳为例，介绍其具体做法如下：选朵大、雪白、无病虫害的新鲜银耳，作为种耳，经无菌水漂洗种耳数次后，用无菌吸水纸把种耳表面的水分吸干。
再把种耳切成一小块，以入瓶后不会碰到瓶壁为度，挂在用火焰灭菌过的小金属丝钩（或不锈钢钩）上，迅速悬挂在三角瓶内，注意勿使种耳磁到培养基，以防杂菌污染。
塞上棉塞，放在20～25?条件下，经l～2天，就可看到培养基上形成一个雾状孢子印。
此时，以无菌操作把悬挂瓶内的耳片取出，再塞上棉塞，移到20～25?的室中培养，经2～3天，培养基表面就会出现许多乳白色糊状的白落，就是银耳的分生孢子。
采用孢子分离，要注意控制培养的温度。
因为食用菌孢子的弹射与培养的温度有密切关系，如双孢蘑菇孢子弹射最适温度是14～18?，如培养在25?条件下，孢子就很难弹出。
一般食用菌孢子弹射的最适温度比菌丝体生长的最适温度为低，而与子实体发育的最适温度大致相同。
如香菇孢子弹射的最适温度为12～18?，银耳为20～24?，黑木耳为20～26?，平菇为13～20?。
此外，孢子采集还可采用菌褶涂抹法，适用于野外采种，方法简便，效果也好，即选成熟的种菇，用接种针直接插入褶片间，轻轻涂抹褶片表面尚未弹射的孢子，然后在试管培养基上接种。
2.组织分离法是用食用菌幼嫩的组织块直接分离培养成纯菌种的方法。
选用的子实体先经0.1％开汞水或70％酒精表面消毒后。
用无菌水冲洗并用无菌纱布擦去表面水分。
分离香菇时用无菌解剖刀自菌柄处切开少许，再用手将子实体掰开为二，在菌盖与菌褶交界处，切取0.3～0.4立方厘米的一小块菌肉，移放在斜面培养基中央。
如已开伞的种菇、则选菌盖与菌柄交界处的菌肉。
分离草菇时，用无菌解剖刀把菌蕾纵切少许；再用手把菌盖轻轻剥开，在菌柄上方和菌盖交界处，切取1～5毫米的细块，接在斜面培养基中。
如种菇已受雨淋，吸水较多，应取菌褶作为接种材料。
组织分离后将试管外面放在恒温箱中培养。
待组织块周围萌发出菌丝，并向培养基蔓延生长后，再挑取生长健壮的菌丝进行转管培养。
组织分离法操作简便，又不易带入杂菌，容易获得纯菌种。
但对银耳、黑木耳等胶质菌；因其子实体中菌丝的含量极少，如用组织分离培养，则往往不易成功。
3.基内菌丝分离法是利用食用菌生长的基质一菇木和耳木作为分离材料，而培养成纯菌种的方法。
特别是银耳、黑木耳采用这种方法，成功率高，性状也较稳定，为生产上经常采用的方法。
具体做法是从野生或人工栽培的场所，选择子实体发生早，生长旺盛，朵大，无病虫害的菇木或耳木，锯取一小段，让其充分风干后备用。
分离时如为香菇的菇木，先锯取1厘米的薄片，切去四周，用0.1％升汞水表面消毒1～2分钟，用无菌刀将其劈成小木片，再切成0.5平方厘米的小木条，移入试管斜面培养基上，经25～27?培养，菌丝生长后，再行转管培养。
分离时如为银耳的耳木，先从长有子实体部位，锯取1～2厘米厚的木片，剔除树皮及耳基，再用0.1％升汞水或70％酒精涂擦表面消毒，通过耳基着生处，把耳木纵切为二，用无菌刀在耳基着生处，削取极小的木屑，移入试管斜面培养基上。
接种后放在20～28?的温度下培养，数天后接种块的周围开始长出纤细的白色菌丝，延伸到培养基后，培养基的颜色逐渐变黄转黑，表面出现浅灰色斑纹，这就是羽毛状菌丝。
一星期后，小木屑上出现白色短绒毛状菌丝，同时分泌白色或淡黄色水珠，这就是银耳的发育菌丝。
挑取银耳发育菌丝和少许羽毛状菌丝转接于新的斜面培养基上进行扩接，一星期后，菌丝长满试管，即成为母种。
在实际分离中往往不可能得到银耳菌丝与羽毛状菌丝两者兼有的母种。
或纯为银耳菌丝；或纯为羽毛状菌丝；或酵母状分生孢子，还有相当数量是感染杂菌或不长任何菌丝的。
纯银耳菌丝和纯羽毛状菌丝，经适当配合后，就可应用于生产。
黑木耳的耳木分离，其操作方法与银耳大致相同，但不象银耳有多种类型的菌丝。
耳木接入试管后，一般放在22～28?培养2～3天，可见菌丝长出。
选生长健壮、清楚、两端展整齐的，进行转管纯化2～3次培育成母种。
在培养过程中，有时培养基背面会出现乳白色或淡褐色，这是正常现象。
（四）母种的扩大培养从分离获得或外地引入的优良母种，由于数量有限不能满足生产上的需要，应进行扩大繁殖培养。