实验十一 金属螯合亲和层析分离蛋白质
金属螯合亲和色谱中固定金属与蛋白质的作用
说明蛋白质和固定金属的结合主要是较强的配位键起作用 。用纯粹组氨酸 ( His) 和甘氨酸 ( Gly) 的缓冲 液蛋白质也不被洗脱 ,仅在其中加入一定量的 NaCl 后蛋白质才被洗脱 ( 表 2) 。这个事实表明蛋白质和
表2 在 IDA2Cu 柱上竞争洗脱剂对蛋白质保留的影响 Table 2 Influence of competitive eluent on protein retention on IDA 2Cu column
1 引 言
金属螯合亲和色谱是最近二十几年发展起来的一种新的分离技术 。此法是基于蛋白质与固定金 属的亲和作用进行分离 。因此 ,研究蛋白质和金属离子的作用 ,对于提高金属螯合色谱的选择性和实现 最佳分离十分重要 。关于蛋白质在金属螯合色谱中的保留机理迄今还没有一个完满的结论 ,多数学者 认为蛋白质在金属螯合柱上的保留是由于蛋白质和固定金属的配位作用 。但是 ,对于配位作用的大 小与哪些因素有关 ,静电作用对蛋白质保留产生什么影响以及不同色谱条件下各种力所起的作用研究 较少 。本工作通过考察不同 pH 下蛋白质在裸柱和金属螯合柱上的保留特征 , 探讨了固定金属与蛋白 质间的相互作用 。
不流出 no 不流出 no 不流出 no 不流出 no
流动相 (mobile phase) :A. 0. 02 molΠ L KH2 PO4 ,B. 0. 02 molΠ L KH2 PO4 + 0. 5 molΠ L NaCl ; 梯度洗脱 (gradient elution) :20 min B 从 (from) 0 到 (to) 100 % ; 流速 (flow rate) :1 mLΠ λ= 280 nm) ; 进样量 ( size of sample) :20 μ min ; 检测器 (detector) :UV( L ; 各蛋白浓度 (concentration of each protein) 3. 0 gΠ L ; IDA :iminodiacetic acid ; RNase :ribonucleas ; Cyt2C : cytochrome ; Lys :lysozyme
金属螯合亲和层析介质用于六聚组氨酸融合蛋白的纯化研究
李淑娟等：金属萱台亲和层析介质用于六聚组氨酸融台蛋白的纯化研究度测定结果可粗略计算：２００血裂解液纯化后所得ｃＤｌ５５Ｄ１融合蛋白量约为２００旭。
２．５ｃｏ．ｃＭ．Ａｓｐ－ｓｅｐｈａｒ∞ｅ用于六聚组氨酸融合蛋白大量纯化的初步研究根据小量纯化的优化条件，将介质体积放大２５倍纯化六聚组氨酸融合蛋白ｃＤｌ５５Ｄｌ，取５０％的ｃｏ－ｃＭ．Ａ叩一ｓｅｐｈａｒ姻ｅ悬浮液１．５ｍＬ与５ｍＬ含ｃＤｌ５５Ｄｌ的细胞裂解液孵育，ｃｏ．ｃＭ．Ａ８ｐ．ｓ８ｐＩｌ哪ｓｅ悬浮液装入层析柱中，洗柱后用５ｍＬ含２００ｍｍｌ，Ｌ咪唑的ｃ液洗脱蛋白，收集洗脱液５ｍＬ。
用Ｂｍｄ州法测定蛋白浓度并计算可知蛋白质总量为４．６ｎ蜗。
２．６Ｃｏ・ＣＭ－Ａｓｐ．ｓｅｐｈａｒｏ辨与Ｎｉ・ＮＴＡ・Ａ辨ｒｏ辨的比较将ｃｏ．ｃＭ．Ａｓｐ—ｓｅｐｈ删ｓｅ与商品化Ｎｉ—Ｎ１俳Ａｇａｒｏｓｅ进行蛋白纯化的比较，取５０％的ｃｏ－ｃＭ．Ａ８ｐ．ｓｅｐｈａｌｏｓｅ悬浮液和５０％的Ｎｉ．ＮＴＡ．Ａ静ｒｏ特悬浮液各６０皿分别与２００ｆｔＬ含六聚组氨酸融合蛋白ｇｐ４ｌ（分子量３６ｋＤ）的细胞裂解液孵育，并按各自清洗溶液对介质清洗后洗脱蛋白，对纯化后的剩余液和洗脱液进行ｓＤＳ．ＰＡＧＥ，结果如图６所示。
从图６中可看出经ｃ０．ＣＭ．Ａｓｐ．ｓｅｐｈａｒｏ∞与Ｑｉａｇｅｎ公司的Ｎｉ．Ｎ１ｒＡ．Ａ∞”介质纯化后剩余液中蛋白质的组成几乎一样，洗脱得到卵４１蛋白的量相当，说明两者蛋白结合容量差别不大。
但是，以Ｎｉ．ＮＴＡ．Ａ朗ｆ０８ｅ纯化后的洗脱液电泳结果中可见有少量杂蛋白的条带，而且与ｃｏ．ｃＭ．Ａｓｐ．ｓ印ｈａｒ∞ｅ相比，Ｎｉ，ＭｒＡ．Ａｇ啪眈介质纯化后剩余液泳道中杂蛋白减少较多，说明有较多的杂蛋白非特异性结合到Ｎｉ．ＮＴＡ．Ａｇｍ”介质上，便影响了纯化后所得蛋白的纯度。
这与文献中报道含镍螯台介质可与不含六个组氨酸残端的蛋白结合，因而会表现出一定非特异性吸附的结果一致““。
而以ｃｏ－ｃＭ．Ａｓｐ．ｓｅｐｈａｒｏｓｅ纯化的洗脱液电泳条带中不存在杂蛋白，可见ｃｏ—ｃＭ．Ａｓｐ．ｓｅｐｈａｍｓｅ对融合蛋白选择性高，非特异性吸附降低，因而表现出较好的纯化效果。
纯化可溶蛋白实验报告
一、实验目的1. 学习蛋白质纯化的基本原理和方法；2. 掌握利用金属螯合亲和层析（Metal Chelating Affinity Chromatography，MCAC）纯化可溶蛋白的操作步骤；3. 了解蛋白质纯化过程中的关键参数和注意事项。
二、实验原理金属螯合亲和层析是一种基于蛋白质与金属离子特异性结合的纯化方法。
在实验中，利用带有组氨酸尾的融合蛋白与镍离子特异性结合的特性，通过金属螯合亲和层析柱进行分离纯化。
三、实验材料1. 培养基：M9ZB/氨苄青霉素/氯霉素培养基、IPTG；2. 菌株：大肠杆菌BL21（DE3）pLyaS；3. 试剂：MCAC-EDTA、Triton X-100、蛋白酶抑制剂、NiSO4、去离子水、50mmol/L MCAC-0缓冲液；4. 仪器：摇床、离心机、层析柱、分光光度计。
四、实验步骤1. 接种：将含pET载体表达带组氨酸尾融合蛋白的大肠杆菌BL21（DE3）pLyaS菌株接种于10 ml M9ZB/氨苄青霉素/氯霉素培养基中，37℃摇荡培养过夜。
2. 转接：取1 ml过夜培养物转接至100 ml M9ZB/氨苄青霉素/氯霉素培养基中，37℃摇荡培养至OD600为0.7~1.0。
3. 诱导表达：加入1 ml 0.1 mol/L IPTG，37℃继续培养1~3 h。
4. 收集菌体：4℃、4000 g离心10 min，弃上清，收集菌体沉淀。
5. 重悬菌体：将菌体沉淀加入冰浴中冻融，加入5 ml MCAC-0缓冲液和33 μl 150蛋白酶抑制剂混合液，用吸管吹打重悬，超声破菌或匀浆。
6. 纯化：将重悬的菌体加入装有1 ml NTA介质的层析柱中，用去离子水、50 mmol/L NiSO4、MCAC-0缓冲液依次洗柱。
7. 收集目的蛋白：收集结合在层析柱上的目的蛋白，用适当缓冲液洗脱。
8. 蛋白质浓度测定：利用分光光度计测定洗脱液中蛋白质浓度。
五、实验结果与分析1. 通过金属螯合亲和层析，成功纯化了带组氨酸尾的融合蛋白。
融合蛋白纯化实验报告
1. 学习并掌握融合蛋白的纯化方法；2. 掌握金属螯合亲和层析技术；3. 提高蛋白质分离纯化操作技能。
二、实验原理融合蛋白是指将目的蛋白与另一个蛋白（如载体蛋白、酶等）通过化学键连接在一起形成的蛋白质。
融合蛋白的纯化可以通过多种方法实现，其中金属螯合亲和层析是一种常用的纯化技术。
该方法利用目的蛋白与载体蛋白之间特定的相互作用，将目的蛋白从混合物中分离出来。
三、实验材料1. 融合蛋白样品；2. 金属螯合亲和层析柱；3. 亲和层析介质（如Ni-NTA）；4. 洗脱缓冲液；5. 蛋白质检测试剂；6. 离心机；7. 其他实验试剂。
四、实验步骤1. 准备亲和层析柱：将亲和层析介质加入层析柱中，用洗脱缓冲液平衡层析柱。
2. 样品上柱：将融合蛋白样品加至层析柱中，让其自然流出。
3. 洗脱：用洗脱缓冲液冲洗层析柱，收集洗脱液。
4. 收集目标蛋白：将收集到的洗脱液进行蛋白质检测，确定目标蛋白的存在。
5. 离心分离：将收集到的目标蛋白样品进行离心，分离出纯化的融合蛋白。
6. 蛋白质检测：对纯化的融合蛋白进行SDS-PAGE、Western blot等检测，验证纯化效果。
1. 亲和层析柱平衡后，样品顺利上柱，洗脱过程中目标蛋白得以分离。
2. 蛋白质检测结果显示，纯化的融合蛋白在预期位置出现条带，证明纯化效果良好。
3. SDS-PAGE结果显示，纯化的融合蛋白纯度较高，未发现其他杂蛋白。
4. Western blot结果显示，纯化的融合蛋白与特异性抗体结合良好，进一步证明纯化效果。
六、实验讨论1. 在实验过程中，应注意控制层析柱的流速，避免样品过快通过层析柱，导致目标蛋白丢失。
2. 亲和层析介质的装载量对纯化效果有较大影响，需根据实验需求调整。
3. 洗脱缓冲液的pH、离子强度等参数对目标蛋白的洗脱效果有较大影响，需根据实验需求优化。
4. 实验过程中，应注意蛋白质的稳定性，避免蛋白质降解。
七、实验结论本实验成功纯化了融合蛋白，验证了金属螯合亲和层析技术在融合蛋白纯化中的应用。
生化分析实验金属螯和层析MCAC_XP
• Column: Glutathione Sepharose 4B, pre-packed • Binding: PBS + 1% Triton X-100 • Elution: 5 mM Glutathione, 50 mM Tris.HCl,
金属螯合层析的介质通常是在惰性 支持物上接有固定化的金属离子， 组氨酸与金属离子具有螯合作用， 对于具有不同组氨酸含量的不同蛋 白质分子对于一定金属离子的亲和 力大小不同 ，因而可通过柱层析进 行分离。
二、金属螯合剂
在Sepharos上接有亚氨基二乙酸 Iminodiacetic acid , IDE 将氯化锌或硫酸铜等溶液通过该柱时即
Affinity tag
Ligand
Glutathione-S-Transferase (GST) Glutat
Nickel ions
E tag sequence
Anti-E antibody
ZZ (domain B of protein A) IgG
M GuHCl (depends on tag) • A protease cleavage site allows the tag to be
removed after purification • Purity typically >90% in one step
Elution with Competing free ligand
四、实验方法
20mM, pH8.0 PBS+0.5M NaCl + CuSO4 平衡Buffer平衡 上样 改变 pH 或 离子强度洗脱 50mM EDTA 再生除去金属离子
金属螯合亲和层析
金属螯合亲和层析金属螯合亲和层析是一种高效的分离纯化生物大分子的方法，广泛应用于蛋白质纯化，DNA/RNA纯化等领域。
下面将分步骤介绍金属螯合亲和层析的原理及操作流程。
第一步：构建亲和基质金属螯合亲和层析的分离原理是利用某些高亲和力的金属离子与其相应的配体与靶分子结合，从而使靶分子被捕获。
这种配体常常固定于亲和基质表面，构建亲和基质的关键是选择合适的金属离子和其配体。
常见的金属离子有Ni2+、Co2+和Cu2+等，这些离子可以与其持有的受体配体如亚胺啉、六联苯等形成螯合配合物，以 Ni-NTA、Ni-IDA、Co-IDA、Cu-IDA 等形式固定于亲和基质表面。
第二步：样品制备亲和层析在蛋白质纯化中的应用最为广泛，因此这里以蛋白质为例进行说明。
样品制备是成功的亲和层析关键之一，通常需要选择合适的缓冲液及添加剂，使得靶蛋白的活性、溶解度、稳定性得到最大保留，常用的缓冲液体系包括Hepes、Tris、phosphate等，而添加剂可以选择二甲基亚砜（DMSO）、尿素（Urea）、磷酸胆碱（chaps）等。
第三步：亲和层析操作样品处理之后，接下来就可以进入亲和层析的实验操作。
实际操作中主要分为以下几步：1. 平衡柱子：向亲和柱子填充亲和基质后，需要先平衡柱子，以充分溶解亲和基质表面的螯合金属离子，以避免在样品加入前柱子失去充分活性。
2. 样品加入：将样品注入柱子中，使其充分与亲和基质表面的螯合金属离子发生作用，然后充分洗涤以去除非特异性相关结合物。
3. 目标蛋白的洗脱：将目标蛋白从亲和基质柱中洗脱，这一步操作通常是使用间断性洗脱或温度递降洗脱方法，以脱离目标蛋白并消除杂质、副产物等。
4. 制备纯度较高的目标蛋白：获得目标蛋白后，还需要通过蛋白质纯化的其他方法如离子交换层析、凝胶过滤等的多次层析，才能最终得到纯度超过90%的目标蛋白。
综上所述，金属螯合亲和层析技术已经成为了分离纯化生物大分子的重要方法之一，从缓冲液的制备到柱子等操作都十分关键。
金属螯合亲和层析分离蛋白质的研究
!"卷#期$%%%年&月生物工程学报!"#$%&%’()*$+,(-.#(/%0"$(,(12’()*!"+(*#,-).!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!$%%%金属螯合亲和层析分离蛋白质的研究孙旭东李红旗隋洪艳沈忠耀（清华大学化工系北京!%%%1#）摘要金属螯合亲和层析是近$%年发展起来的一项新型分离技术。
它以配基简单、吸附量大、分离条件温和、通用性强等特点，逐渐成为分离纯化蛋白质等生物工程产品最有效的技术之一。
本文从单组分蛋白质入手，考查了23值、铵离子浓度、不同铵盐等对蛋白质洗脱的影响，并进行了分析。
还对不同的金属螯合柱和不同性质蛋白质的洗脱性能进行了研究，比较了不同金属离子与蛋白质亲和力的区别，为实际体系的分离研究打下了基础。
关键词金属螯合亲和层析，牛血清白蛋白，血红蛋白，分离中图分类号41!5文献标识码6文章编号!%%%07%"!（$%%%）%#0%#/50%5金属螯合亲和层析，又称固定化金属离子亲和层析（899(:;);<=>?=@A)8(B6C C;B;@.D E F(9A@(0 G F A2E.，简称8?6D），是近$%年发展起来的一项新型分离技术。
最早由H A F(@E等人［!，$］提出。
该方法利用蛋白质表面的一些氨基酸，例如组氨酸、色氨酸、赖氨酸等能和金属离子发生特殊的相互作用的原理，从而对蛋白质加以分离［7］。
由于它具有配基简单、吸附量大、分离条件温和、通用性强等特点，逐渐成为分离纯化蛋白质等生物工程产品最有效的技术之一［#］。
本文主要以单组分蛋白质牛血清白蛋白（I J6）和血红蛋白为研究对象，考查了23值、铵离子浓度及阴离子等不同洗脱条件对出峰时间的影响。
对不同的金属螯合柱的性能和不同单组分蛋白质的洗脱性能进行了研究，比较了不同金属离子与蛋白质亲和力的区别，为实际生物产品的分离奠定了基础。
亲和层析法离纯化蛋白质的方法
亲和层析法离纯化蛋白质的方法亲和层析法是一种利用特定配体与目标蛋白质间的亲和作用来分离和纯化目标蛋白质的方法。
该方法简单、高效、选择性强，并且适用于分离和纯化各种规模和属性的蛋白质，因此被广泛应用于生物化学、分子生物学等领域。
亲和层析法的实验步骤如下：1. 配制亲和柱：将特定的配体化合物固定到柱载体上，例如：Ni2+、Protein A/G、抗体等。
固定过程要注意化合物与柱载体的适应性、配位化合物的浓度和固定条件的优化。
2. 样品制备：将待纯化蛋白质与适当的缓冲液混合，如含有余量目标蛋白质竞争配位位点的化合物、pH、离子强度和结构安定剂等。
3. 样品加载：将样品加入亲和柱顶部，让其通过固定的配体和柱内质子、离子等的相互作用与目标蛋白质结合。
样品通过后，用缓冲液淋洗一段时间以去除无关的物质，并测定逐步洗出的蛋白质含量。
4. 洗脱蛋白质：通过改变洗脱缓冲液的pH值，鸟嘌呤核苷酸、纳米微粒、配体等离子强度和竞争配位位点的化合物，剥离蛋白质与配体的相互作用，释放出目标蛋白质。
蛋白质最终会在柱底部被洗出，收集洗脱后的纯化蛋白质即可。
亲和层析法具有一些优点：1. 选择性强，可用于纯化特定蛋白质。
2. 纯化步骤简单，样品不需预备过多。
3. 取得的蛋白质纯度高。
4. 在蛋白质分子中较不会引起构象或孔洞变化，使分离后蛋白质结构相对完整。
1. 需要合适的配体化合物，且有些化合物不易制备或使用方便性较差。
2. 某些特殊的蛋白质可能无相应亲和层析柱，或需要进行配体修饰。
3. 无法分离某些蛋白质互作产物，因为这些产物与配体的亲和性可能相同或更好。
亲和层析分离蛋白的原理
亲和层析分离蛋白的原理1. 亲和层析的概念在我们谈论亲和层析之前，得先知道这个名字是个什么玩意儿。
亲和层析，听起来有点高大上，但实际上就是一种把蛋白质分离开来的妙招。
简单说，就是利用蛋白质和特定配体之间的“有缘千里来相会”，通过这种“亲和力”把目标蛋白分离出来。
想象一下，你在一场派对上找朋友，结果发现你们两人之间有个共同的爱好——这就是亲和层析的精髓！1.1 亲和层析的基本原理这玩意儿主要靠两种东西，一个是“固定相”，另一个是“流动相”。
固定相就像是派对上的那个角落，只有你喜欢的朋友才能待在那儿。
而流动相则是所有的杂乱无章的人群。
通过流动相把混合物送到固定相上，只有跟固定相“有缘”的蛋白才能被留住，其余的就随风而去了。
想象一下，经过亲和层析的洗礼后，留下的都是你最喜欢的朋友，真是乐在其中！1.2 亲和层析的步骤让我们一步一步来，亲和层析的过程其实也没那么复杂。
第一步，你得准备好你的“聚会场地”，也就是固定相。
这个固定相上会有一些特定的配体，专门用来“勾搭”你想要的蛋白。
然后，把混合物通过流动相慢慢注入，哇哦，杂乱的蛋白质们开始游走。
接着，那些与你的配体有好感的蛋白就开始在固定相上“扎根”了，没错，就是这么简单！最后一步，利用一些洗脱液，把留在那儿的蛋白质洗出来，你就成功分离出目标蛋白啦，真是大功告成，热烈掌声！2. 亲和层析的优势说到亲和层析的优势，那可真是数不胜数。
首先，它的特异性极强，就好比一把钥匙只能开一把锁，能精准地找到目标蛋白，省时省力，简直是“事半功倍”。
其次，操作也非常简单，甚至让那些实验室的小白都能轻松上手。
对比其他复杂的分离技术，亲和层析简直就像在逛超市，轻松自在。
2.1 适用范围亲和层析的适用范围也非常广泛哦。
从生物制药到基础研究，各种蛋白质的分离都能派上用场。
比如，分离酶、抗体，甚至是一些特殊的转运蛋白，这一切都能轻松搞定。
就好像你去餐馆吃饭，点的菜式多得是，总有一款适合你！2.2 亲和层析的局限性不过呢，亲和层析也不是完美无瑕的，它也有一些局限性。
蛋白质在金属螯合亲和色谱中的竞争洗脱
图 2 蛋白质在 PBS-Gly 体系的色谱图 Fig. 2 Chromatogram of standard protein mixture in PBS-
Gly system
1. Cyt-C； 2. Cyt-C 杂蛋白 （ Proteins） 3. Lys。流动相 （ Mobile
O，1
Cyt-C Lys
His-PBS （ pH 6. 0）
洗脱强度高，Cu2 + 流失严重
Higher eluting strength Higher leakage of Cu2 +
Cyc-C： cytochrome C； Lys： lysozyme.
虽高，但 Cu2 + 的流失异常严重，无法正常操作；Imid 和 Gly 与 Cu2 + 结合强度适中，既保证蛋白质可以被 充分洗脱，又使 Cu2 + 的流失量减到较小程度。因此 Imid 和 Gly 是 MCAC 中竞争剂的最佳选择。 3. 2 缓冲体系的选择
同一竞争剂在不同缓冲体系往往得到不同的分 离效果。MCAC 中的流动相通常由缓冲剂、盐和竞 争剂组成。缓冲剂主要用来控制溶液 pH 值；盐是 为了抑制蛋白质与固定相间的静电作用［8］；竞争剂 是通过与固定金属离子的竞争配位洗脱被吸附的蛋 白质。在色谱分析中常用的缓冲体系有 PBS，TrisHCl，NaAc-HAc 和 Na2 B4 O7 -HCl 等。本研究以 CytC 和 Lys 为分离对象，Imid 和 Gly 为竞争剂，对上述 4 种缓冲体系进行了考察，得到了图 1 和图 2 的结 果。由图 1a 可见，Cyt-C 和 Lys 在 PBS-Imid 体系中 得到了 较 好 的 分 离。若 用 100 mmol / L NaAc-HAc 替代流动相 B 中 20 mmol / L PBS 进行色谱分析，也 可得到与图 1a 类似的色谱图 1b。Cyt-C 和 Lys 的保 留时间分别为 10. 77 和 17. 95 min。
固定化金属亲和层析
固定化金属亲和层析
固定化金属亲和层析是一种分离和纯化目标蛋白质的方法。
它利用金属离子与蛋白质表面的亲和作用来实现分离。
常用的金属离子包括镍、铬、锌等。
在固定化金属亲和层析中，金属离子通常被固定在亲和树脂（如Ni-NTA树脂）上。
目标蛋白质中含有与金属离子结合的亲和标签（如His标签）时，可以通过与亲和树脂上的金属离子结合，使目标蛋白质与亲和树脂发生相互作用，从而实现分离。
固定化金属亲和层析的操作步骤通常包括：
1. 准备亲和树脂：将金属离子固定在亲和树脂上。
2. 样品加载：将含有目标蛋白质的样品加载到亲和树脂上，使目标蛋白质与金属离子结合。
3. 洗脱非特异结合物：通过洗涤步骤去除与亲和树脂非特异结合的蛋白质。
4. 洗脱目标蛋白质：通过改变条件（如pH、盐浓度等）来洗脱与亲和树脂特异结合的目标蛋白质。
5. 纯化目标蛋白质：通过再结晶、浓缩等步骤进一步纯化目标蛋白质。
固定化金属亲和层析具有操作简单、高效、选择性强等特点，被广泛应用于生物制药、生物化学研究等领域。
金属螯合亲和层析技术及其应用
金属螯合亲和层析技术及其应用摘要:固定化金属螯合亲和层析是一种有效的生物分子分离纯化技术,它具有配基简单、吸附量大、分离条件温和、通用强等特点。
因此,其在蛋白质纯化、复性和空间定位以及酶的固定化和金属离子清除等方面具有广泛的应用。
关键词:固定化金属螯合亲和层析;纯化;应用固定化金属螯合亲和层析(Immobilized Metal-Chelated Affinity Chromato-graphy,IMAC)是一种亲和纯化技术,它是由Porath于1975年首次提出并用于吸附牛血清蛋白[1],至今用IMAC已成功分离纯化出数百种生物大分子。
该法是基于蛋白质表面的一些氨基酸残基与固定化金属离子的亲和力不同而对蛋白质进行分离纯化。
它因配基简单、吸附量大、分离条件温和、通用强等特点而被广泛应用。
随着研究的进一步深入,IMAC的新应用也不断地被发现。
1金属螯合亲和层析作用原理固定化金属螯合亲和层析基于蛋白质表面氨基酸与固定化金属离子的亲和力不同对蛋白质进行分离。
过渡态金属离子能与电子供体氮、硫、氧等原子以配位键结合,金属离子上剩余的空轨道是电子供体的配位点,在溶液中被水分子或阴离子占据。
当蛋白质表面氨基酸残基与金属离子的结合力较强时,氨基酸残基的供电原子将取代与金属离子结合的水分子或阴离子,与金属离子形成复合物,从而使蛋白质分子结合在固相介质表面。
氨基酸中的α-氨基和α-羧基,以及某些氨基酸侧链基团含有孤对电子的活性原子都能参与螯合反应,由于蛋白质表面这些氨基酸的种类、数量、位置和空间构象不同,因而与金属配基的亲和力大小不同,从而可选择性地加以分离纯化[2]。
2金属螯合亲和层析技术的应用2.1金属螯合亲和层析用于生物分离纯化IMAC在生物分子纯化方面具有很多优点:(1)结合力强,蛋白结合容量大,可用于工业生产,如采用IMAC吸附介质的扩张床吸附(EBA)技术可从哺乳动物细胞培养粗提物中一步分离纯化溶解性目标蛋白;(2)洗脱条件温和,再生后配体恢复完全,一种IMAC树脂可再生几百次而不改变其层析特性;(3)价格便宜;(4)可通过改装各种金属离子,引入目标蛋白质最适宜的金属离子进行不同蛋白质的纯化。
利用金属离子亲和层析法制备高纯度His标记蛋白质
利用金属离子亲和层析法制备高纯度His标记蛋白质金属离子亲和层析法是一种常用的蛋白质纯化方法，其中最为广泛应用的是使用含有氨基膦酸（Imidazole）配体的镍柱。
该方法可以通过蛋白质与镍离子之间的亲和作用，实现对His标记蛋白质的选择性分离。
本文将介绍如何使用金属离子亲和层析法制备高纯度His标记蛋白质的步骤和操作要点。
1. 蛋白质表达与纯化前的准备工作在进行蛋白质表达前，需要将目标蛋白的编码序列克隆至适合的表达载体中，并转化至表达宿主菌。
通常选择大肠杆菌作为表达宿主，而His标记通常插入至目标蛋白的N末端或C末端。
表达宿主菌感染后，通过诱导表达基因，使目标蛋白在细胞内大量表达。
2. 细胞收获与细胞破碎待表达菌株达到适当的浓度后，进行细胞收获。
采用离心等方式将菌株分离并收集。
随后，通过细胞破碎等方式将汇集到的细胞进行裂解，使蛋白质释放至裂解液中。
3. 镍柱填充与样品加载将合适尺寸和柱床材料的镍柱进行填充，将其与柱盒连接。
连接后，用洗涤缓冲液平衡镍柱，去除杂质和剩余离子。
之后，将裂解液进行预处理，去除细胞碎片和不溶性物质，得到清晰的样品液。
4. His标记蛋白质的特异性结合与洗脱将样品液缓慢地加载至预处理后的镍柱上，使蛋白质与镍离子发生特异性结合。
待样品通过后，用足够的洗脱缓冲液进行洗脱。
洗脱过程中，可逐渐增加洗脱缓冲液中的Imidazole浓度，以促进His标记蛋白质的洗脱。
5. 蛋白质纯化与储存经过上述步骤，可得到高纯度的His标记蛋白质。
使用蛋白质分析方法，如SDS-PAGE和Western blot等，对纯化后的样品进行验证。
验证合格后，可将蛋白质进行长期储存，或进一步进行后续的实验和研究。
通过金属离子亲和层析法制备高纯度His标记蛋白质的过程相对简单，但操作要点仍需注意。
在实验中，需注意离心、洗涤和洗脱步骤的温度、时间和缓冲液浓度等参数的控制。
此外，为提高纯化效果，可通过调整裂解液pH值、添加适量的盐类以及优化洗脱条件等方法进行优化。
mbp洗脱的原理
MBP洗脱的原理MBP洗脱是一种常用的蛋白质纯化方法，它基于蛋白质与金属离子的亲合性，通过金属离子与蛋白质特定位点的结合来实现蛋白质的选择性纯化。
本文将详细解释MBP洗脱的原理，包括金属亲和层析、蛋白质与金属离子的结合机制、洗脱条件的选择等内容。
1. 金属亲和层析金属亲和层析是利用金属离子与蛋白质之间的特异性结合来实现蛋白质的纯化。
常用的金属离子包括镍（Ni2+）、铜（Cu2+）、锌（Zn2+）等。
在金属亲和层析中，通常将金属离子固定在亲和基质上，形成金属螯合层析树脂。
2. 蛋白质与金属离子的结合机制蛋白质与金属离子的结合是通过蛋白质的亲和位点与金属离子之间的配位作用实现的。
蛋白质通常具有亲和位点，如组氨酸、半胱氨酸、组氨酸和半胱氨酸等。
金属离子与亲和位点之间的结合是可逆的，可以通过改变洗脱条件来实现蛋白质的洗脱。
金属离子与蛋白质的结合通常是通过配体交换或配体结合来实现的。
在配体交换中，金属离子与蛋白质结合的配体被洗脱缓冲液中的其他配体所取代。
在配体结合中，金属离子与蛋白质结合的配体被洗脱缓冲液中的其他化合物所取代。
3. MBP洗脱的步骤MBP洗脱通常包括以下几个步骤：细胞破碎、裂解液制备、亲和层析、洗脱和纯化。
3.1 细胞破碎首先需要将目标蛋白质表达的细胞进行破碎，以释放细胞内的蛋白质。
细胞破碎的方法可以选择化学方法（如溶菌酶处理）、物理方法（如超声波处理）或机械方法（如高压破碎）等。
3.2 裂解液制备细胞破碎后，需要制备裂解液，以使目标蛋白质在裂解液中保持稳定。
裂解液通常包含缓冲剂、蛋白质稳定剂和金属络合剂等。
缓冲剂用于维持溶液的pH值，蛋白质稳定剂用于保护蛋白质的结构，金属络合剂用于与金属离子形成络合物，以增强蛋白质与金属离子的结合。
3.3 亲和层析制备好裂解液后，将裂解液与金属螯合层析树脂进行接触，使蛋白质与金属离子结合。
金属螯合层析树脂可以通过柱层析或批量层析的方式进行操作。
在柱层析中，将裂解液加入层析柱，使蛋白质与金属离子结合，非目标蛋白质被洗脱。
蛋白质纯化柱-ni
网址：
合蛋白； 4) 用缓冲液B和缓冲液C配制的不同浓度缓冲液D
洗脱； 9 最高纯度洗脱方案：用含0、60、100、150、
200、250mM 咪唑的缓冲液D分步洗脱，每 个梯度2~3倍介质体积洗脱； 9 最高收率洗脱方案：先用5~10倍介质体积 含20mM咪唑的缓冲液D洗脱，再用5~10倍 介质体积含250mM咪唑的缓冲液D洗脱。 注：纯化过程流速不宜过快，对于1ml介质，流速 保持在0.5ml/min为宜。 5. 介质清洗与再生： 如果使用一段时间以后，介质上有杂质沉积导 致介质颜色改变和蛋白结合能力下降，需对介质进 行清洗或再生。 z 介质清洗： 1) 用10倍介质体积0.5M NaOH过柱，适当调整流 速，或洗脱至10倍介质体积时停30min后继续洗 脱，保证介质与NaOH溶液接触时间达到30min 以上。 2) 用10倍介质体积去离子水洗去层析柱中的碱 液。 3) 用10倍介质体积缓冲液A平衡层析柱。 z 介质再生： 1) 用2~5倍介质体积脱镍缓冲液（50mM Na3PO4， 300mM NaCl，100mM EDTA，pH 8.0）过柱； 2) 用5-10倍介质体积0.5M NaOH过柱，适当调整 流速，如流速较快，则洗脱至10倍介质体积时 停30min后继续洗脱，保证介质与NaOH溶液接 触时间达到30min以上； 3) 用10倍介质体积去离子水洗柱； 4) 用3倍介质体积10mM Na3PO4，1M NaCl，pH 7.4 缓冲液平衡层析柱； 5) 用3倍介质体积20mM NiCl2或NiSO4 (溶于去离 子水)过柱； 6) 用3倍介质体积10mM Na3PO4，1M NaCl，pH 7.4 缓冲液洗柱； 7) 用5倍介质体积缓冲液A平衡层析柱。
网址：
分离His融合蛋白及能被金属离子吸附的多肽、 蛋白、核苷酸、磷酸化蛋白。
蛋白纯化亲和层析法
蛋白质纯化亲和层析法若表达蛋白质上含有一段六个His 的片段，而亲和吸附胶上接有镍离子，此蛋白质会特异性地结合到吸着胶体；洗去杂质后可imidazole洗脱目标蛋白质。
下面以Abbkine的Resin（树脂填料）,Packed Column（预装纯化柱）,Kit（试剂盒）产品仪器设备：亲和层析管柱（PurKine™ His-Tag Ni-NTA Packed Column, 1ml*5/3ml*5）部分收集器（另需准备干净试管约25 支）药品试剂：金属螯合亲和层析胶体（PurKine™ His-Tag Ni-NTA Resin） 1 mL◆在交联琼脂糖凝胶上接有nitrilotriacetic acid(NTA)官能基，可以螯合镍离子；使用前先以镍离子饱和的。
Buffer B-300/0（50 mM Na3PO4, pH 8.0; 0.3 M NaCl）◆使用前才添加成10 mM β-mercaptoethanol.Buffer B-300/20: Buffer B-300/0 加有20 mM imidazoleBuffer B-300/250: Buffer B-300/0 加有250 mM imidazole方法步骤：1）亲和层析胶体1 mL 已经装填在管柱内，成为一淡蓝色胶柱。
请把管柱架直在铁架上，去除下方的填塞物，用buffer B-300/0 流洗20 mL 后塞住出口，准备注入样本。
2）除去胶面上方的缓冲液，并取出样本（IEX）使其回到室温，慢慢用滴管加到亲和胶体上，小心勿弄乱胶体表面；让样本没入胶体中，同时收集流出液每管2.5 mL.3）待样本全部进入胶体后，关闭出口，再慢慢加入buffer B-300/20,打开出口收集流出液；buffer B-300/20 共流洗30 mL.4）接着以buffer B-300/250 流洗30 mL,方法同上，收集。
5）所有收集均定量蛋白质并测定酶活性，取收集酶活性最高的数个，保留100 μL 以供分析。
基因工程的下游技术重组蛋白的表达、纯化和分析
2. 亲和层析柱的安装 把层析柱固定在铁支架上，柱下端出 口封闭。加入少量的无离子水，排去下端 的空气泡。取出20%乙醇浸泡的螯合凝胶 4mL到烧杯中，加入少量的无离子水制成 糊状，沿着贴紧柱内壁的玻璃棒把糊状凝 胶倒进柱内，打开下端的排水口，让亲和 凝胶剂随水流自然沉下。亲和层析剂为 45mL。
3. 1#：接50μL空载工程菌（含pUC18）过夜培 养物，25-28℃培养10 h-12h； 2# ：接 50μL 重组菌（含 pGFPuv ）过夜培养 物，25-28℃培养10 h-12h； 3#：接50μL重组菌（含pGFPuv ）过夜培养 物， 37℃培养至 O.D600 约为 0.5 （约 3h-4h) ， 然后加入20%葡萄糖50μL至终浓度为0.2%， 及100mM IPTG 5μL至终浓度为0.1mM，2528℃培养8h-10h或过夜； 6#：接500μL重组菌（含pGFPuv）过夜培养 物， 37℃培养至 O.D600 约为 0.5 （约 3h-4h) ， 然后只加入 100mM IPTG 50μL 至终浓度为 0.1 mM，25-28℃培养8h-10h或过夜。
一．实验目的 了解和掌握IPTG诱导表达的原理。 了解降解物阻遏的现象及其机理。
二．实验原理
操纵子是基因表达的协调单位。通常由2 个以上功能相关的结构基因以及一些调节 序列（如启动子序列、操纵序列等）组成。
乳糖操纵子由三个结构基因 Z 、 Y 、 A 和 操纵序列、启动子、 CAP 结合位点等调 节序列组成。
四．实验仪器
超净工作台、 恒温摇床、离心机等。
五．操作步骤 1. 挑取含pUC18质粒工程菌及含pGFPuv质 粒工程菌单菌落，分别接种于含氨苄青霉 （终浓度为100μg/mL，以下同)的5mL的 LB培养基中，于37℃、250rpm过夜培养 12h-14h至对数生长期。 2. 取 3 支已灭菌的大试管，分别加入 5mL 含 有氨苄青霉素的 LB 培养液，编号为 1# ， 2#，3#，另取一个250mL的灭菌三角瓶， 编号为6#，加入50mL含氨苄青霉素的 LB 培养液。
金属螯合层析
亲和层析中文名称：亲和层析英文名称：affinity chromatography定义1：利用分子与其配体间特殊的、可逆性的亲和结合作用而进行分离的一种层析技术。
可以选用生物化学、免疫化学或其他结构上吻合等亲和作用而设计的各种层析分离方法。
如用寡脱氧胸苷酸-纤维素分离纯化信使核糖核酸；用DNA-纤维素分离依赖DNA的DNA聚合酶；用琼脂糖-抗体制剂分离抗原；用金属螯合柱分离带有成串组氨酸标签的重组蛋白质等。
应用学科：生物化学与分子生物学（一级学科）；方法与技术（二级学科）定义2：利用共价连接有特异配体的层析介质分离蛋白质混合物中能特异结合配体的目的蛋白或其他分子的一种层析法。
应用学科：细胞生物学（一级学科）；细胞生物学技术（二级学科）本内容由全国科学技术名词审定委员会审定公布百科名片亲和层析将具有特殊结构的亲和分子制成固相吸附剂放置在层析柱中，当要被分离的蛋白混合液通过层析柱时，与吸附剂具有亲和能力的蛋白质就会被吸附而滞留在层析柱中。
那些没有亲和力的蛋白质由于不被吸附，直接流出，从而与被分离的蛋白质分开，然后选用适当的洗脱液，改变结合条件将被结合的蛋白质洗脱下来，这种分离纯化蛋白质的方法称为亲和层析。
利用共价连接有特异配体的层析介质分离蛋白质混合物中能特异结合配体的目的蛋白或其它分子的层析技术。
目录亲和层析(affinity chromatography)原理载体的基本要求和选择名词解释亲和层析(affinity chromatography)在生物分子中有些分子的特定结构部位能够同其他分子相互识别并结合，如酶与底物的识别结合、受体与配体的识别结合、抗体与抗原的识别结合，这种结合既是特异的，又是可逆的，改变条件可以使这种结合解除。
生物分子间的这种结合能力称为亲和力。
亲和层析就是根据这样的原理设计的蛋白质分离纯化方法。
原理亲和层析是一种吸附层析，抗原（或抗体）和相应的抗体（或抗原）发生特异性结合，而这种结合在一定的条件下又是可逆的。
实验十一 金属螯合亲和层析分离蛋白质
实验十一金属螯合亲和层析分离蛋白质【实验目的】1．学习亲和层析的原理。
2．掌握亲和层析法分离蛋白质的技术与操作。
【实验原理】亲和层析是以普通凝胶作载体，连接上金属离子制成螯合吸附剂，用于分离纯化蛋白质，这样的方法称为金属螯合亲和层析。
蛋白质对金属离子具有亲和力是这种方法的理论依据。
已知蛋白质中的组氨酸和半胱氨酸残基在接近中性的水溶液中能与镍或铜离子形成比较稳定的络合物，因此，连接上镍或铜离子的载体凝胶可以选择性地吸附含咪唑基和巯基的肽和蛋白质。
过渡金属元素镍在较低pH范围时（pH 6-8），有利于选择性地吸附带咪唑基和巯基的肽和蛋白质，在碱性pH时，使吸附更有效，但选择性降低。
金属螯合亲和层析行为在很大程度上，由被吸附的肽和蛋白质分子表面咪唑基和巯基的稠密程度所支配，吲哚基可能也很重要。
本实验室纯化的目的蛋白是用IPTG诱导表达的pGFPuv,该蛋白是和6His融和表达的，含有特定的组氨酸标记物，这种可溶性蛋白质能用金属亲和层析法进行分离，且操作简单，快速，纯化效率高。
【试剂与器材】〈一〉试剂1. 0.05mol/L EDTA—0.5mol/L ，NaCL溶液100mL2. 2mol/L NaCL 溶液50mL3. 1mol/L NaOH溶液50mL4. 0.2mol/L NiSO4溶液50mL5. 平衡缓冲液：50mmol/L Tris-HCL，500mmol/L NaCL，pH7.0 500mL6. Ni2＋Chelating Sepharose Fast Flow 5－10 mL7. 重组pGFPuv质粒大肠杆菌工程菌经诱导表达的细胞裂解蛋白样品20—50ml8. 洗涤液：50mmol/L咪唑，50mmol/L Tris-HCL，500mmol/L NaC,pH 7.09. 洗脱液：300mmol/L咪唑，50mmol/L Tris-HCL，500mmol/L NaCL.pH7.010 20%乙醇溶液50ml〈二〉器材1. 1.5cm X 50cm层析柱2. 蠕动泵3. 紫外检测仪4. 自动收集器5. 伍豪色谱工作站【操作方法】1. 样品的制备细胞的培养及荧光蛋白表达看实验十，细胞的破碎及蛋白的收集如下：收集在25 ℃用细胞培养液，8000r/min，离心5min，去上清液，菌体用平衡缓冲液洗涤一次，离心收集菌体，用三分之一（细胞培养液）体积的平衡缓冲液充分悬浮，冰浴下进行高压破菌处理。
化学亲和力层析技术在蛋白质分离中的应用
化学亲和力层析技术在蛋白质分离中的应用蛋白质是生命活动的基本构成部分之一，不仅在细胞内发挥重要的功能，在制药、生物工程等领域也具有重要的应用价值。
但是，要想对蛋白质进行研究和利用，首先需要分离纯化它们。
化学亲和力层析技术是一种常用的蛋白质分离方法，它基于靶分子和适配分子之间的专一化学亲和力，通过固定适配分子在分离柱上，将含有靶分子的混合物与适配分子固定相互作用，使靶分子经过柱子时与分离柱上的适配分子特异地结合，达到分离的目的。
常见的化学亲和力层析技术分为以下几种。
1. 金属离子亲和层析法该方法利用金属离子与蛋白质中存在的亲和基团（如组氨酸、赖氨酸等）之间的络合、配位作用，选择合适的金属离子与某些特定蛋白质在pH、离子强度等条件下形成配合物，进而将蛋白质分离。
例如，氯化镍(Ni2+)与组氨酸在酸性环境中形成络合物，可以将含有组氨酸残基的蛋白质成功地分离出来。
2. 验证亲和层析法该方法利用特定抗体与蛋白质之间的高度特异性结合，将含有某种特定蛋白质的混合物与该特异性抗体预先固定在柱上的树脂中特异性结合，从而达到纯化该蛋白质的目的。
例如，地高辛的细胞半胱氨酸蛋白酰解酶在560 nm左右会发光，利用这一特性可以将含有地高辛的混合物通过抗体亲和层析柱进行纯化。
3. 亲和衬底层析法该方法利用亲和性对和衬底之间的相互作用，进行蛋白质分离纯化。
通常把蛋白质的一部分作为亲和性对放在层析柱中，使之与分离混合物中其他成分进行特异性结合，来实现蛋白质的分离和纯化。
例如，利用凝集素与含有糖团的蛋白质分离时，将凝集素放在层析柱中，利用凝集素与糖团的亲和力，特异性地结合含有糖团的蛋白质，从而实现分离和纯化的目的。
化学亲和力层析技术具有选择性好、易于定量控制、不污染被分离物等优势，因此在分离纯化蛋白质中应用广泛。
在蛋白质工程及生物药物开发中，充分利用该技术可以大大提高产品的质量和效益。
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实验十一金属螯合亲和层析分离蛋白质
【实验目的】
1．学习亲和层析的原理。
2．掌握亲和层析法分离蛋白质的技术与操作。
【实验原理】
亲和层析是以普通凝胶作载体，连接上金属离子制成螯合吸附剂，用于分离纯化蛋白质，这样的方法称为金属螯合亲和层析。
蛋白质对金属离子具有亲和力是这种方法的理论依据。
已知蛋白质中的组氨酸和半胱氨酸残基在接近中性的水溶液中能与镍或铜离子形成比较稳定的络合物，因此，连接上镍或铜离子的载体凝胶可以选择性地吸附含咪唑基和巯基的肽和蛋白质。
过渡金属元素镍在较低pH范围时（pH 6-8），有利于选择性地吸附带咪唑基和巯基的肽和蛋白质，在碱性pH时，使吸附更有效，但选择性降低。
金属螯合亲和层析行为在很大程度上，由被吸附的肽和蛋白质分子表面咪唑基和巯基的稠密程度所支配，吲哚基可能也很重要。
本实验室纯化的目的蛋白是用IPTG诱导表达的pGFPuv,该蛋白是和6His融和表达的，含有特定的组氨酸标记物，这种可溶性蛋白质能用金属亲和层析法进行分离，且操作简单，快速，纯化效率高。
【试剂与器材】
〈一〉试剂
1. 0.05mol/L EDTA—0.5mol/L ，NaCL溶液100mL
2. 2mol/L NaCL 溶液50mL
3. 1mol/L NaOH溶液50mL
4. 0.2mol/L NiSO4溶液50mL
5. 平衡缓冲液：50mmol/L Tris-HCL，500mmol/L NaCL，pH7.0 500mL
6. Ni2＋Chelating Sepharose Fast Flow 5－10 mL
7. 重组pGFPuv质粒大肠杆菌工程菌经诱导表达的细胞裂解蛋白样品20—50ml
8. 洗涤液：50mmol/L咪唑，50mmol/L Tris-HCL，500mmol/L NaC,pH 7.0
9. 洗脱液：300mmol/L咪唑，50mmol/L Tris-HCL，500mmol/L NaCL.pH7.0
10 20%乙醇溶液50ml
〈二〉器材
1. 1.5cm X 50cm层析柱
2. 蠕动泵
3. 紫外检测仪
4. 自动收集器
5. 伍豪色谱工作站
【操作方法】
1. 样品的制备
细胞的培养及荧光蛋白表达看实验十，细胞的破碎及蛋白的收集如下：收集在25 ℃用细胞培养液，8000r/min，离心5min，去上清液，菌体用平衡缓冲液洗涤一次，离心收集菌体，用三分之一（细胞培养液）体积的平衡缓冲液充分悬浮，冰浴下进行高压破菌处理。
然后8000r/min。
离心30min，取上清液。
放冰箱备用。
2. 亲和层析柱的安装
把层析柱固定在铁支架上，上端的柱头拧下，柱下端出口用夹子封闭。
加入少量的无离子水，排去下端的空气泡。
取出20%乙醇浸泡的螯合凝胶5－10mL到烧杯中，加入少量的无离子水制成糊状，沿着贴紧柱内壁的玻璃棒把糊状凝胶倒进柱内，打开下端的排水口，让亲和凝胶剂随水流自然沉下。
亲和层析剂为5—10mL。
然后，将上端的柱头拧紧，并将顶端和下端用软管连接封闭备用。
3. 层析系统的安装、调试
（1）蠕动泵的调试：打开背后电源开关，按下start按钮，上下箭头调节流速为15rpm（约2ml/min），将软管充满去离子水。
（2）系统的连接：将蠕动泵的出水管与层析柱上端管相连，层析柱的下端管与紫外检测仪的进样端连接，将紫外检测仪的out端与自动收集器相连。
（3）紫外收集器的调试：打开紫外背后开关，调节灵敏度旋钮（ABS－Range），调节调零旋钮。
（4）自动收集器的设置：打开电源开关，按“复位”键，确定出液管的位置，按“手动”按钮，进行设置，如选择120seconds一管进行收集，按“自动”即开始计时收集。
（5）伍豪色谱工作站的使用方法：点击桌面的“伍豪色谱工作站“图标打开程序，点击左上角的图标，选择A或B通道，点击“▲”即开始采样，采样结束后点击“■”即结束采样，然后载入A 或B通道谱图，保存结果，并打印结果。
4. 层析柱的使用前处理：
（1）用5X柱床体积去离子水清洗乙醇封存的Ni 2＋-Chelating Sepharose Fast Flow亲和层析柱，去除乙醇
（2）用2X柱床体积的0.2M NiSO4过柱，注意观察现象
（3）用10X柱床体积的去离子水清洗，用5X柱床体积平衡缓冲液平衡柱子
5. 上样：
先从20 mL裂解上清液中取出50 µL用于电泳，作为亲和层析分离前上清液中的总蛋白区带对照图谱。
然后以每分钟2 mL的流速上层析柱，分部收集流出液，每管3 mL（记录的紫外吸收峰为穿流峰，取最高的一管样品液用作电泳）。
平衡缓冲液过层析柱，直到紫外吸收峰不再下降（达到平台期为止）。
6. 洗涤：
用含50 mmol/L咪唑的洗涤缓冲液25 mL冼脱，分部收集洗脱液，每管5 mL，取紫外吸收最高的一管用于电泳。
7. 洗脱：
用含300mmol/L咪唑的洗脱缓冲液10 mL洗脱，自动收集洗脱液。
每管收5 mL，当紫外吸收达最高峰时取样用于电泳及Western blotting实验。
8. 层析柱的后处理及封存：
（1）用2X去离子水清洗柱子
（2）用10X0.5M NaCl，50mM EDTA (pH 8.0) 洗去结合的镍离子
（3）用10X去离子水清洗柱子
（4）用10X1M NaOH洗柱，去残留蛋白
（5）用大约10X去离子水清洗柱，去除NaOH，直到pH值低于9
（6）用大约2X柱床体积乙醇过柱，拆除柱子，保存柱料于20％乙醇中
9. 12% SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳检测：
分别取50μL穿流峰流出液、50mmol/L咪唑缓冲液洗涤的流出液和300mmol/L咪唑缓冲液洗脱的流出液。
外加一个上柱前的样品液和蛋白Marker作比较。
进行12% SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳检测亲和层析分离纯化的结果。
【注意事项与提示】
1. 不管是装柱还是上样、洗脱，在整个操作过程中，水或溶液面都不能低于凝胶柱平面。
否则，凝胶柱会产生气泡，就会影响层析效果。
2. 样品上柱和洗脱过程，其流速都要慢，分离效果才好。
3. 亲和层析剂可回收，经再生可循环使用。
该亲和层析剂用20%乙醇浸泡于冰箱保存。
4. 亲和层析柱在再生处理、上样、洗脱过程中其颜色都有明显变化（白、蓝、绿），只要细心操作，样品是否被吸附上去或被洗脱下来？都能观察到从而作出判断。
5. IPTG诱导表达的荧光蛋白经12% SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳结果如下：
1为蛋白分子量标准Marker
2为没有表达产物荧光蛋白的细菌总蛋白区带。
3为诱导表达产物的细菌总蛋区带。
明显多出一条区带。
4为样品上层析柱时的流出液（穿流峰）蛋白区带。
5、6、7为含300mmol/L咪唑的洗脱缓冲液洗脱出来的荧光蛋白带。
【实验安排】
1）细胞的破碎及总蛋白质的收集需半天。
2）金属螯合亲和层析柱的处理及分离荧光蛋白需半天。
3）12% SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳检测需一天，但可在样品上柱层析分离时制备好凝胶，层析分离完成后即可进行凝胶电泳。
【实验报告要求与思考题】
1. 要求提交IPTG诱导表达的荧光蛋白经12% SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳结果图；
2. 亲和层析柱在再生处理、上样、洗脱过程中其颜色有何变化？为什么？
3. 要达到好的分离效果要注意哪些问题？。