第四章酶的生物有机化学

(2)共价修饰调控： 某些酶的激活作用是通过共价修饰而实现的。例如．肌肉中存在一种能催化糖原的合成
和分解的酶，即磷酸化酶 b。该酶本身的活性很低，当磷酸化酶b活性中心的丝氨酸残基 被磷酸化后，即形成高活性磷酸化酶。由磷酸化酶b转化为活化形式a的反应，被磷酸化酶 激酶 所催化，而磷酸化酶a去活化则由另一种磷酸水解酶所催化。
酶等。
酶的催化特性
❖ 高效率： 能催化自然条件下难以进行的反应 能使复杂的反应有序可控进行 能使生物有机化学反应在常温常压和水介
质中进行。 能使反应速率提高106~1012倍
高选择：
❖ 反应专一性：只催化一种或一类 化学反应。如蛋白水解酶
❖ 底物专一性：只作用于一种或一 类结构与性质相似的物质。 结构专一性： 绝对专一性：只作用于特定 的底物。如脲酶 相对专一性：作用于一类化 学键。如胰凝乳蛋白酶 立体专一性：专一性地与手性 底物结合并催化其反应。如胰蛋 白酶、淀粉酶等 几何专一性：只催化某种几何 异构体底物的反应。如延胡索水 解酶。
(6)胰凝乳蛋白酶、胰蛋白酶和弹性蛋白酶 的结构特点和它们的水解选择性
在肽键选择性上所表现出来的明显差异，是 由于它们活性中心结合部位结构有所不同。 胰凝乳蛋白酶的结合部位有一个Ser残基， 这个结合部位实际上是一个疏水性大口袋， 可以与侧链为芳香基团的氨基酸残甚结合；
胰蛋白酶的结合部位虽然与胰凝乳蛋白酶相 似，但由一 个带负电荷的Asp代替Ser，因 此与氨基酸残基结合性质发生了很大变化， 只能与带有正电荷的氨基酸残基如Lys、Arg 结合。
（3）酰基—酶中间物解离： 酰基—酶中间体解离过程中， His—57作为广义酸起催化作用。
(4)酶活性中心Asp—102，His—57和Ser—195的三元催化体系；
(5)酶的活性中心与底物过渡状态的最优化缔合方式： 全面研究和比较了几种丝氨酸蛋白水解酶的x衍射结构以
后，发现酶活性中心与底物过渡状态具有最优缔合方式，这 是酶催化活性的一个重要结构基础。
共价催化
❖ 催化剂与底物形成共价产物，降 低活化能，提高反应速度。
❖ 亲核共价催化： ❖ 催化剂的亲核基团对底物进行亲
核进攻形成活性中间体。 ❖ 亲电共价催化： ❖ 催化剂的亲电基团对底物进行亲
电进攻形成活性中间体。亲电基 团可为非蛋白如金属离子。 ❖ 形成活性中间体是共价催化剂的 关键。 ❖ Lys的-NH2可以起伯胺类似的反 应。
第一阶段酶和底物快速结合并作用，释放出对硝基苯 酚离子．同时形成共价结合的乙酰基—酶中间体。 第二阶段是乙酰基—酶慢速水解反应，释放出乙酰基。 出于这—步反应速率慢，使反应体系中酶有效浓度大 大下降，因而使整个酶促反应速率也显著下降。
决定肽键水解速度的步骤是第一步。
酶活性中心重要催化活性基团的测定
由于四面体中间物变形、移动，使得酶与肽键断裂部位 附近的其他基团也能形成氢键，所以酶既可以与Michaelis中 间物，也可以与酰基—酶中间物以最优方式缔合。酶的活性 中心对底物过渡状态的最优缔合方式，是酶具有高效催化活 性的主要因素之一。事实上，DIPF对于丝氨酸蛋白水解酶的 高度抑制性质，就是由于它的四面体磷酸酯基在结构上与底 物的过渡状态相似。
降低反应活化能。
酶催化反应机制类型
❖ 酸碱催化 ❖ 广义酸碱催化是通过
质子酸碱提供或接受 质子的作用来降低反 应活化能。
许多酶促反应同时包括了广义酸和广义 碱的催化过程
结构研究(包括应用x衍射技术等)证明， RNase A活性中心含有两个His残基(His— 12和His—l19)，这两个His的咪唑基作为 广义的酸和碱在催化过程中起着重要作用。
水解作用的动力学模型
以乙酸对硝基苯酚酯酶促水解为模型 动力学研究表明，本反应过程具有两相特征 (1)快速反应相：水解产物对硝基苯酚离子 快速形成，并与活性酶的量成正比。 (2)‘恒态反应相：水解产物对硝基苯酚离子 以一种比较慢的，但是恒定的速率形成。反 应速率大小与底物浓度无关。这是决定反应 速率的步骤。
遵守米氏 (Michaelis-Menten)方程
❖ ：在底物低浓度时，反应速 率与底物浓度成正比．表现 为一级反应特征：
❖ 当底物浓度达到一定值，几 乎所有的酶都与底物结合后， 反应速率达到最大值．此时 再增加底物浓度，反应速率 不再增加，表现为零级反应。
❖ Km为米氏常数
影响酶催化特性的因素
第一步：His—12作为一个广义碱，从 RNA核苷酸残基的2’—oH中接受一个质子， 从而促使2’—oH基上的氧原子亲核进攻相 邻的磷原子。而His—l19则作为一个广义的 酸促进了3’—5’磷酸酯键的断裂．并形成 2’—3’环磷酸酯中间产物。
第二步：2’—3’环磷酸酯中间产物，可以 通过与第—步反应相反的过程，水解生成 3‘—磷酸酯产物， 而在这一步中，His— 12起广义酸作用，His—119起广义碱作 用．而酶本身则恢复到原来的状态。
❖ (1)活性Ser的测定： ❖ 二异丙基磷酸氟（DIPF)
能特异性地与活性中心 Ser的一OH基反应： ❖ 反应结果导致酶的不可 逆失活。而其他非活性 中心的Ser残基则不发生 上述反应。应用这一方 法已经确定胰凝乳蛋白 酶中的ser—195是酶活 性中心的活性氨基酸残 基。
DIPF
(2)活性His的测定： 胰凝乳蛋白酶活性中心的His—57 是另一个重要的催化活性基团。 TPCK能够特异性地与胰凝乳蛋白 酶中的His残基结合。 本反应可以被β-苯基丙酸抑制。 因为TPCK具有类似结构。
❖ 电子传递中间体：
❖ 氧化还原酶中的铁、铜 离子可传递电子。
丝氨酸蛋白酶水解机制
Fra Baidu bibliotek❖ 丝氨酸蛋白水解酶是一大类蛋白水解酶的总 称。这类酶的特征是酶的活性中心都含有ser 残基，并具有相似的催化作用机制。
❖ 胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶和弹性蛋白酶都属 于消化酶系。它们在胰腺胞内合成，并分泌 到十二指肠中。这几种酶都能催化肽链的水 解反应，仅对肽键的选择性有所不同。
催化作用机制
❖ (1)形成一个四面体结构的中间物： ❖ 胰凝乳蛋白酶催化肽键水解的反应基本上是按共价催化机制
进行的。反应的第一步是酶中Ser—195的羟基与His—57咪唑 基的亲核N原子形成氢键，增强了羟基的亲核性能。ser—195 的羟基对底物肽键的酰基做亲核进攻．然后形成一个Michaelis 复合物——包括Ser—195羟基、底物酰基、氨基在内的一个共 价四面体中间物。
手性选择结合
酶的非蛋白成分
❖ 辅酶 ❖ 与酶蛋白结合在一起
协同实施催化作用的 有机小分子称辅酶。 ❖ 结构与功能的关系： 氧化还原、转移 ❖ 作用特点：直接参与 反应，种类少，各具 特殊功能，可与不同 的蛋白结合形成不同 的全酶。 ❖ 与维生素的关系：大 部分辅酶的前体是维 生素，主要是水溶性 的B族维生素。
Asp—102的作用是不容忽 视的，当用Asn取代Asp— 102时(用定点基因突变技 术)发现，虽然酶与底物结 合情况变化不大(Km值在 中性条件下几乎不变)，但 催化活性只及原酶的005%.
(2)形成酰基—酶中间物： 反应的第二步是四面体中 间物分解形成另一个中间 物——酰基—酶中间物， 并伴随着c—N键断裂的过 程：推动这 步反应的作用 力主要来自His—57中N3 给出质子的能力。
酶与底物的相互作用
❖ 静电引力：正负带电基团的相互作用。 ❖ 氢键：酶与底物含有大量能形成氢键的基团。 ❖ 疏水键：按相似相溶原则，蛋白质分子中含有大量
的亲水性和疏水性基团。疏水性基因常常趋向于形 成疏水核心。酶分子的活性中心部位，相对处于一 定程度的疏水环境。活性中心的疏水键不仅具有维 持活性中心空间结构稳定性的重要作用，而且也是 和底物分子中疏水部分结合的重要作用力之一。
第四章 酶的生物有机化学
酶是生物催化剂 酶的非蛋白成分 酶的催化作用机制 丝氨酸蛋白酶的水解机制 酶催化活性调控和酶的抑制作用 酶的作用机制与生物活性分子的设计
核酸酶 抗体酶与杂化酶
酶模型
酶是生物催化剂
❖ 酶是生物活细胞产生的一类具有催化功能的 生物分子
❖ 酶的分类： ❖ 按结构：蛋白酶、核酸酶。 ❖ 按来源：天然酶、人工模拟酶、杂化酶。 ❖ 按功能：氧化酶、水解酶、还原酶、甲基化
底物的过渡状态相似； ❖ b．能够与酶的活性中心以非共价或共价的方式形成比较稳定的复合体或结合
TPCK也不能与DIP胰凝乳蛋白酶 中心的His—57作用。表明胰凝 乳蛋白酶的活性中心已被DIP基 团占据。
x衍射方法测定酶的空间结构
❖ 用x衍射方法已经分别测定 了胰凝乳蛋白酶、胰蛋白酶 和弹性蛋白酶的结构。它们 的空间结构有许多相似之处。 基本催化活件基团ser— 159和His—57都位于底物 结合部位，并且都与另外一 个活性基因Asp—302相接 近。这二个氨基酸残基通过 氢键形成了一个“催化三元 区”
酶中金属离子
❖ 金属酶： ❖ 酶蛋白与金属离子
以配位键形式紧密 结合 。金属离子 作为金属酶中的辅 助因子，起传递电 子、原子和官能团 作用。 ❖ 金属激活酶： ❖ 酶从溶液中结合某 些金属离子而激活。 常为碱金属和碱土 金属，结合较松散， 对酶有一定选择性。
酶的催化作用机制
❖ 催化机理： ❖ 通过形成新的反应途径
邻基参与和定向效应
❖ 分子内反应与分子间反 应具有很大的速度差异。
K1=0.0018s-1
与过渡状态的结合作用
❖ 酶与反应过渡状态的亲和能力远大于酶与底物或产 物的亲和能力
❖ 这种亲和力使过渡态能量降低，反应速度加快。
多功能催化作用
❖ 酶的活性中心部位，一般都含有多个起催化作用的 基团，这些基团在空间有特殊的排列和取向，可以 对底物价键的形变和极化及调整底物基团的位置等 起到协同作用，从而使底物达到最佳反应状态。
弹性蛋白酶的结合部位入口处有两个较大的 val和Thr存在，只能让侧链体积小的氨基酸 残基如Glg和Ala等进人。
4.5 酶催化活性的调控和酶的抑制作用
❖ 1．酶催化活性的生物学调控 ❖ (1)动力学调控：酶的催化反应速率与酶的浓度、底物的浓度、酶与底
物的结合状态、酶与产物的结合状态以及产物的浓度等动力学因素有关。 ❖ ①酶的浓度调控： ❖ 酶在细胞内的含量取决于酶的合成速率和分解速率。细胞根据白身运
动需要．严格控制细胞内某种酶的合理含量。例如，大肠杆菌培养过程 中如果缺少乳糖，那么细胞中就不含任何可以代谢乳糖的酶。但是在培 养基中加人乳糖后，只要过几分钟，细胞就能合成出乳糖水解酶，以便 能利用这种营养物质。这种调控能力对于生物体适应不同的环境具有重 要意义。 ❖ ②产物浓度水平调控和变构调控： ❖ 在某些生物合成反应中，最终产物往往会对合成反应起抑制作用。当 产物浓度达到一定程度时，可自动抑制反应进行。而反应产物浓度下降 到一定水平后，又可恢复合成反应。这种调控作用又称为“反馈抑制调 控”。
金属离子的催化作用
❖ 电荷稳定作用：作为 Lewis酸，具有高于1 价的正电荷，在中性 pH下高浓度存在，金 属往往比质子酸更强 的酸催化作用。
❖ 提高水的亲核共价催 化作用：金属离子与 水中的OH共价结合， 提高了水的亲核催化 性能。
❖ 电荷屏蔽作用：
❖ 多种激酶的底物是 Mg2+-ATP复合物，金 属离子屏蔽磷酸基的负 离子。
❖ 酶分子的结构 活性部位：包括结合部位 与催化部位。 结合部位：决定酶的专一性。在空间形状和氨基酸残基组 成上．有利于与底物形成复合物，起到固定底物，使底物中 参加化学变化的反应基团相互接近并定向，从而使反应具有 分子内反应特点。 催化部位：决定酶的高效性。其作用是使底物的价键发生 形变或极化，起到将底物激活和降低过渡态活化能作用。 调控部位：可以与底物以外的其他分子发生某种程度的结合， 从而引起酶分子空间构型的变化，对酶起到激活或抑制作用。
(3)水解活化： 有些酶在通常情况下是以非活化形式存在的。某些消
化酶，如胰蛋白酶原即属这类酶。当胰蛋白面原分子中 某一个肽键被水解后，即转变成活性的胰蛋白酶。
2．酶活性的化学调控和抑制剂
❖ (1)抑制剂的结构和性质特点： ❖ a．在化学结构上(包括分子大小、形状、官能团等)．与被抑制的底物分子或