脯氨酸蛋白酶测定方法

脯氨酸内切蛋白酶的测定方法

1定义：pH5.0 37℃条件下每分钟从Z-Gly-Pro-pNA释放1μM pNA所用的酶量为一个酶活力单位，以U表示。

2原理：脯氨酰内肽酶(prolyl endopeptidase，PEP)能特异性水解多肽链中脯氨酸残基羧基端肽键的丝氨酸蛋白酶。以Z-Gly-Pro-pNA (N-卞氧羰基-甘氨酸-

脯氨酸-硝基苯胺)为底物时，它水解脯氨酸羧基端肽键，生成Z-Gly-Pro

和硝基苯胺，而硝基苯胺在410nm下的吸光值与其浓度在一定成范围内成

正比，通过测定硝基苯胺的生成量来检测脯氨酸内肽酶的酶活力。

3试剂和溶液

本标准中所用的试剂，在没有注明其他要求时，均指分析纯试剂和符合GB/T 6682中规定的三级水。

3.1 0.1M柠檬酸溶液：C4H2O7·H2O分子量为 210.14，0.1 mol/L溶液为21.01

克/升。秤取21.01克柠檬酸溶解在去离子水中并定容至1000ml；

3.20.2M磷酸氢二钠：Na2HPO4·2H2O分子量为 178.05，0.2 mol/L溶液为35.01

克/升。秤取35.01克磷酸氢二钠溶解在去离子水中并定容至1000ml；

3.3PH

4.0缓冲溶液：将0.1M柠檬酸12.29ml与0.2M磷酸氢二钠7.71ml混匀。

3.4 4mM Z-Gly-Pro-pNA(N-卞氧羰基-甘氨酸-脯氨酸-硝基苯胺，分子量

426.43，瑞士Bachem)，准确称取0.0171g Z-Gly-Pro-pNA (N-卞氧羰基-甘氨酸-脯氨酸-硝基苯胺)，加入4ml二恶烷溶解，加入6mlPH4.0柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲溶液溶解后即为PH5.0的底物溶液。

3.5 终止剂：0.2 mol/L碳酸钠溶液

称取无水碳酸钠2.12g于烧杯中溶解，转至100mL容量瓶中定容。

4仪器和设备

4.1 实验室常用仪器设备。

4.2 恒温水浴：（37±0.1℃）。

4.3 分光光度计：有10mm比色皿，可在410nm下测定吸光度。

4.4 磁力搅拌器。

4.5 酸度计：精确至小数点后2位。

5试验流程

5.1酶样的准备：

5.1.1 液体酶:直接吸取酶液做适当稀释，使测定光吸收值在0.25—0.4范围内。

5.1.2固体酶：称取适量于烧杯中(精确至0.0001g)，用少量水润湿并调成糊状，再用水溶解，离心上清液做适当稀释。

5.2活力测定步骤

按顺序加入以下试剂，严格控制反应时间

6活力计算

酶活力的计算：

U＝N×(ΔA÷min)×（V×106）÷（γ×V×β）

＝N×ΔA×153.4

U –酶活力

N—稀释倍数

ΔA/min--吸光度变化；

V一1.35，反应体系体积(m1)；

106一将mol换算成μmol；

γ-8800，消光系数(cm2／mol)；

v一0.1，样品量(m1)；

β一1，比色杯光程

注意：此方法对于DSM商品脯氨酸蛋白酶测定时的稀释倍数为1或2，即原液或稀释到2倍测定，ΔA吸光值在范围之内；对于发酵液可将酶液加量扩大到5～10倍，即0.5ml～1.0ml，进行测定，ΔA 吸光值在范围之内，计算活力时将酶液毫升数V带入公式计算即可，及V为0.5或1.0ml。