脯氨酸检测方法

试验目的：在逆境条件下（旱、盐碱、热、冷、冻），植物体内脯氨酸（proline，Pro）的含量显著增加。植物体内脯氨酸含量在一定程度上反映了植物的抗逆性，

抗旱性强的品种往往积累较多的脯氨酸。因此测定脯氨酸含量可以作为抗旱育种的生理指标。另外，由于脯氨酸亲水性极强，能稳定原生质胶体及组织内的代谢过程，因而能降低冰点，有防止细胞脱水的作用。在低温条件下，植物组织中脯氨酸增加，可提高植物的抗寒性，因此，亦可作为抗寒育种的生理指标。

一、原理

用磺基水杨酸提取植物样品时，脯氨酸便游离于磺基水杨酸的溶液中，然后用酸性茚三酮加热处理后，溶液即成红色，再用甲苯处理，则色素全部转移至甲苯中，

色素的深浅即表示脯氨酸含量的高低。在520nm波长下比色，从标准曲线上查

出（或用回归方程计算）脯氨酸的含量。

二、材料、仪器设备及试剂

（一）材料：待测植物（水稻、小麦、玉米、高粱、大豆等）叶片。

（二）仪器设备：1. 722型分光光度计；2. 研钵；3. 100ml小烧杯；4. 容量瓶；

5. 大试管；

6. 普通试管；

7. 移液管；

8. 注射器；

9. 水浴锅；10. 漏斗；11. 漏斗架；12. 滤纸；13 剪刀。

（三）试剂1. 酸性茚三酮溶液：将1.25g茚三酮溶于30ml冰醋酸和20ml6mol/L 磷酸中，搅拌加热（70℃）溶解，贮于冰箱中；2. 3％磺基水杨酸：3g磺基水杨酸加蒸馏水溶解后定容至100ml；3. 冰醋酸；4. 甲苯。

三、实验步骤

1. 标准曲线的绘制

（1）在分析天平上精确称取25mg脯氨酸，倒入小烧杯内，用少量蒸馏水溶解，然后倒入250ml容量瓶中，加蒸馏水定容至刻度，此标准液中每ml含脯氨酸100μg。

（2）系列脯氨酸浓度的配制取6个50ml容量瓶，分别盛入脯氨酸原液0.5，1.0，1.5，2.0，2.5及3.0ml，用蒸馏水定容至刻度，摇匀，各瓶的脯氨酸浓度分别为1，2，3，4，5及6μg/ml。

（3）取6支试管，分别吸取2ml系列标准浓度的脯氨酸溶液及2ml冰醋酸和2ml 酸性茚三酮溶液，每管在沸水浴中加热30min。

（4）冷却后各试管准确加入4ml甲苯，振荡30S，静置片刻，使色素全部转至甲苯溶液。

（5）用注射器轻轻吸取各管上层脯氨酸甲苯溶液至比色杯中，以甲苯溶液为空白对照，于520nm波长处进行比色。

（6）标准曲线的绘制：先求出吸光度值（Y）依脯氨酸浓度（X）而变的回归方程式，再按回归方程式绘制标准曲线，计算2ml测定液中脯氨酸的含量（μg/2ml）。

2. 样品的测定

（1）脯氨酸的提取：准确称取不同处理的待测植物叶片各0.5g，分别置大管中，然后向各管分别加入5ml3％的磺基水杨酸溶液，在沸水浴中提取10min，（提取过程中要经常摇动），冷却后过滤于干净的试管中，滤液即为脯氨酸的提取液。（2）吸取2ml提取液于另一干净的带玻塞试管中，加入2ml冰醋酸及2ml酸性

茚三酮试剂，在沸水浴中加热30min，溶液即呈红色。

（3）冷却后加入4ml甲苯，摇荡30S，静置片刻，取上层液至10ml离心管中，

在3000rpm下离心5min。

（4）用吸管轻轻吸取上层脯氨酸红色甲苯溶液于比色杯中，以甲苯为空白对照，

在分光光度计上520nm波长处比色，求得吸光度值。

四、结果计算根据回归方程计算出（或从标准曲线上查出）2ml测定液中脯氨酸

的含量（Xμg/2ml），然后计算样品中脯氨酸含量的百分数。计算公式如下：

脯氨酸含量（μg/g）＝[X×5/2]/样重（g）。

脯氨酸测定

方法名称：脯氨酸的测定—电位滴定法

应用范围：该方法采用滴定法测定脯氨酸的含量。该方法适用于脯氨酸。

方法原理：供试品加冰醋酸溶解后，照电位滴定法，用高氯酸滴定液（0.1mol/L）滴定，记录高氯酸滴定液的使用量，计算，即得。

试剂：

⒈水（新沸放置至室温）

⒉高氯酸滴定液（0.1mol/L）

⒊冰醋酸

⒋基准邻苯二甲酸氢钾

⒌结晶紫指示液

⒍醋酐

⒎醋酸汞试液

试样制备：

①高氯酸滴定液（0.1mol/L）

配制：取无水冰醋酸（按含水量计算，每1g水加醋酐5.22mL)750mL，加入高氯酸（70%-72%）8.5mL，摇匀，在室温下缓缓滴加醋酐23mL，边加边摇，加完后再振摇均匀，放冷，加无水冰醋酸适量使成1000mL，摇匀，放置24小时。若所测供试品易乙酰化，则须用水份测定法测定本页的含水量，再用水和醋酐调节至本液的含水量为0.01%-0.2%。

标定：取在105℃干燥至恒重的基准邻苯二甲酸氢钾约0.16g，精密称定，加无水冰醋酸20mL使溶解，加结晶紫指示液1滴，用本液缓缓滴定至蓝色，并将滴定的结果用空白试验校正。每1mL高氯酸滴定液（0.1mol/L）相当于20.42mg 的邻苯二甲酸氢钾。根据本液的消耗量与邻苯二甲酸氢钾的取用量，算出本液的浓度，即可。

贮藏：置棕色玻璃瓶中，密闭保存。

②结晶紫指示液

取结晶紫0.5g，加冰醋酸100mL使溶解，即得。

操作步骤：精密称取供试品0.1g，加冰醋酸50mL溶解后，照电位滴定法，用高氯酸滴定液（0.1mol/L）滴定，并将滴定的结果用空白试验校正，记录消耗高氯酸滴定液的体积数（mL），每1mL高氯酸滴定液（0.1mol/L）相当于11.51mg 的脯氨酸（C5H9NO2)，即得。

注1：“精密称取”系指称取重量应准确至所称取重量的千分之一，“精密量取”系指量取体积的准确度应符合国家标准中对该体积移液管的精度要求。

参考文献：中华人民共和国药典，国家药典委员会编，化学工业出版社，2005年版，二部，p.657。