血清清蛋白、γ-球蛋白的分离、提纯与鉴定

血清清蛋白、γ-球蛋白的分离、提纯与鉴定

一、实验目的

1.掌握盐析法、凝胶层析法、离子交换层析法分离蛋白质的原理和基本方法；

2.掌握醋酸纤维素薄膜电泳法的原理和基本方法；

3.了解柱层析技术。

二、实验原理

血清蛋白主要由清蛋白和球蛋白组成，各行使其重要的功能。

本实验利用盐析方法将血清中的清蛋白和球蛋白分离，并用电泳技术观察蛋白质分离教果。

1．盐析

蛋白质分子能稳定存在于水溶液中是因为有两个稳定因素：表面的电荷和水化膜。当维持蛋白质的稳定因素破坏时，蛋白质分子可相互聚集沉淀而析出，蛋白质分子沉淀析出的方法很多，根据对蛋白质稳定因素破坏的不同有中性盐析法、有机溶溶剂法、重

金属盐法以及生物碱试剂法等。盐析法的原理是：中性盐如硫酸铵((NH

４)

２

SO4)等对蛋

白质作用破坏了蛋白质表面水化膜，并且中和了部分电荷，从而使蛋白质相互聚集而析出。由于血清中各种蛋白质分子的颗粒大小、所带电荷的多少和亲水程度不同，故盐析所需的盐浓度也不同，因此调节盐的浓度可使不同的蛋白质沉淀从而达到分离的目的。血清球蛋白在半饱和状态下发生沉淀，而血清清蛋白在完全饱和状态下沉淀，利用此特性可把蛋白质分段沉淀下来，即在半饱和的中，血清蛋白不沉淀，而血球蛋白沉淀，离心后清蛋白主要在上清液中，沉淀蛋白加少量蒸馏水即可溶解，由此达到分离清蛋白和白蛋白的目的。

2．脱盐

盐析得到的蛋白质含有高浓度中性盐，需要有脱盐过程去除蛋白质遗留的中性盐，

常用方法有：透析法脱盐和凝胶层析法脱盐。本实验采用凝胶层析法脱盐，在葡聚糖凝胶柱中，蛋白质与盐的分子量不同，当样品通过层析柱时，分子量较大的蛋白质因为不能通过网孔而进入凝胶颗粒，沿着凝胶颗粒间的间隙流动，所以流程较短，向前移动速度较快，最先流出层析柱；反之，盐的分子量较小，可通过网孔而进入凝胶颗粒，所以流程长，向前移动速度较慢，流出层析柱的时间较后。分段收集蛋白质洗脱液，即可得到脱盐的蛋白质。

3.纯化（离子交换层析）

离子交换是溶液中的离子和交换剂上的离子进行可逆的的交换过程。带正电荷的交换剂称为阴离子交换剂；带负电荷的交换剂称为阳离子交换剂。

本实验采用的DEAE纤维素是一种阴离子交换剂，溶液中带负电荷的离子可与其进行交换结合，带正电荷的点正电荷的离子则不能，这样便可达到分离纯化的目的。

脱盐后的蛋白质溶液尚含有各种球蛋白，利用它们的等电点的不同可进行分离。血清中各种蛋白质的pI各不相同，因此，在同一醋酸铵缓冲液中，各蛋白质所带的电荷不同，可以通过DEAE离子交换层析将血清清蛋白和伽马球蛋白分离出来。

4.纯度鉴定（电泳）

血清中各种蛋白质的等电点不同，一般都低于pH7.4。它们在pH8.6的缓冲液中均解离带负电荷，在电场中向正极移动。由于血浆中各种蛋白质分子大小、形状及所带的电荷量不同，因而在醋酸纤维素薄膜上电泳的速度也不同。因此可以将它们分离为清蛋白（Albumin)、α1-球蛋白、α2-球蛋白、β-球蛋白、γ-球蛋白5条区带。

三、材料与方法：以流程图示意

1.实验材料

人血清、葡聚糖凝胶G-25(Sephadex G-25)层析柱、二乙基氨基乙基(DEAE)纤维素离子交换层析柱、饱和硫酸铵溶液、0.3mol/l的PH6.5醋酸铵缓冲液、0.06mol/l的PH6.5醋

酸铵缓冲液、0.02mol/l 的PH6.5醋酸铵缓冲液、1.5mol/l 的NaCl-0.3mol/NH4AC 溶液、20%磺基水杨酸、1%BaCl2溶液、电泳仪、电泳槽。

2.实验方法

1) 实验流程

2)

实验步骤

①

盐析：中性盐沉淀步骤

注意：上层清夜尽量全部吸出，但不可吸出沉淀物。

② 脱盐：过凝胶层析柱步骤

注意：a.当层析柱的缓冲液面或样品液面刚好下降到纤维素床表面时，不要使液面低于纤维素膜表面，以免空气进入凝胶床。b.往层析住加样品或缓冲液洗脱事，要小心缓慢加入，不要将纤维素冲起或破坏纤维素床表面平整。C.切勿将检测蛋白质的磺基水杨酸与检查硫酸根的氯化钡混淆，因为二者相应生成物的沉淀均为白色。d.洗脱是应注意及时收集样品，切勿使蛋白质峰溶液流失。e.葡萄糖凝胶价钱昂贵，要回收再生避免损耗，严禁倒掉。

③球蛋白的纯化：过DEAE纤维素阴离子交换层析柱

注意：a.当层析柱的缓冲液面或样品液面刚好下降到纤维素床表面时，不要使液面低于纤维素膜表面，以免空气进入凝胶床。b.往层析住加样品或缓冲液洗脱事，要小心缓慢加入，不要将纤维素冲起或破坏纤维素床表面平整。C.切勿将检测蛋白质的磺基水杨酸与检查硫酸根的氯化钡混淆，因为二者相应生成物的沉淀均为白色。d.洗脱是应注意及时收集样品，切勿使蛋白质峰溶液流失，特别是收集伽马球蛋白时。

④清蛋白的纯化：过DEAE纤维素阴离子交换层析柱

注意：a.当层析柱的缓冲页面或样品页面刚好下降到纤维素膜表层时，不要是液面低于纤维素膜表面，以免空气进入凝胶床。b.往层析住加样品或缓冲液洗脱事，要小心缓慢加入，不要将纤维素冲起或破坏纤维素床表面平整。C.使用时切勿将各时段所用的溶液浓度搞混。d.洗脱是应注意及时收集样品，切勿使蛋白质峰溶液流失。

⑤纯度鉴定（醋酸纤维素薄膜电泳）

步骤操作

准备电泳槽准备：将电泳槽置于水平平台上，两侧注入等量的巴比妥

缓冲溶液，使其在同一水平a，页面与支架距离2~2.5cm，用三层

滤纸或双层纱布搭桥

薄膜准备：将醋酸纤维薄膜裁成2cm乘以8cm大小共四段，在薄

膜一段1.5cm处用铅笔轻轻画上一条横线为点样线，末端用铅笔

做记号。进入巴比妥溶液中直至浸润完全。用镊子青青取出，粗

面朝上，平放在两层干滤纸中间，轻轻拭去多余的缓冲液。

点样薄膜片置于干净的玻璃或滤纸片上，粗面朝上，用玻片或载玻片

一段的截面在盛有样品的直接沾取2~3微升待测品，让后将样品

与薄膜点样先轻轻接触，均匀分布在点样线上，带样品渗入薄膜

后移开，四种样品分别点样。

电泳将已点好的样品薄膜放在铺有滤纸盐桥的电泳槽上，点样面朝下，点样端至阴极，轻轻拉平薄膜。平衡约5min，使缓冲液渗透大道

平衡。接好电路，调节电压开始电泳。待各个样品没有变化停止

电泳，并轻轻取出。

染色漂洗和鉴定将染色液倒入大培养皿中，电泳完毕后用镊子取出薄膜，直接浸入染色约5min。后将薄膜取出，漂洗至背景无色，观察电泳情况