秀丽线虫的研究和饲养教案资料

M9缓冲液——每升缓冲液中含15.12gNa2HPO4#12H2O(或 6gNa2HPO4),3gKH2PO4,5gNaCl,0.25gMgSO4#7H2O,宜现 用现配
S缓冲液——0.1mol/LNaCl,0.05mmol/L K2HPO4-KH2PO4缓 冲液(pH=6.0)
喂养方法
➢ 用冰M9缓冲液清洗虫体 ➢ 置4℃环境20min ➢ 1000r离心，弃上清,沉淀物用M9缓冲液重悬 ➢ 置4℃环境20min 弃上清 ➢ 取200ul沉淀物以靠接法接种到涂有大肠杆菌OP50的 NGM培养基上 ➢将培养基放置到16℃生化培养箱中，72h后可繁育至第二 代
• 冻存 准备1mlEP管，加入700ul30%甘油（s缓冲
液溶解）
用冰M9缓冲液清洗虫体
置4℃环境20min，1000r离心弃去上清 将虫体转入事先准备好的EP管中，置于-80℃
冰箱冻存（可保存2个月），需要时取出室 温解冻重置培养基
研究范围
➢ 细胞程序性死亡的遗传调控机制 ➢ RNAi 及其作用机制 ➢ 秀丽线虫的功能基因组学及其他研究 ➢ 低氧应答模式生物
显微注射后的整合
•目前常用的整合方法有：用 y射线和 X射线照射，或用光敏剂补骨脂素 加长波紫外线照射整合(TMP/UV integration)． 基本策略是大量筛选经 •射线照射过的转基因线虫，一般挑取数百只 F1 代繁殖，筛选 F4 代， 检测是否有 100%的转基因表达，若是则说明整合成功． 一般一次整合 能得到若干个独立种系，可选择最好的一个进行实验．
将一小玻片放在加了注射油的 固定垫上，操纵微操使注射针 与玻片边缘相撞，若针头尖端 撞破，可观察到有液泡自动渗 出
注射时将 线虫挑至 琼脂糖固 定垫上， 调整线虫 使性腺暴 露，滴加 注射油覆 盖整个虫 体． 固定
好后的操 作要迅速， 否则线虫 容易脱水 而死
将琼脂糖固定垫放 在载物台上，40x物 镜下找到线虫，使 性腺聚焦在正确的 平面． 操作微操或
➢ 基因组学和功能蛋白组学的研究 ➢ 其他（MAPK 信号传导 、 TGF- b 信号传递途径 、衰老和年龄及脂
肪代谢等）
方法 —— 线虫基因显微注射
显微注射技术是线虫研究领域的常用技术，对 线虫进行转基因操作的一种高效且相对简单的 方法，主 要用于研究线虫突变种系的功能恢复 (mutant rescue)、特定基因的过表达或异位表 达、标 签 蛋白的 表达、特 定 蛋白 质 结构域 的功 能、DNA 或 RNA 调节元件的分析及 RNA 干扰等． 此外，这项转基因技术对于特 异表型的筛选也是个强有 力 的 工具 ， 并 且 它还 可 用于 将人 工 合 成 mRNAs 或其他分 子接引入细胞
通过研究miRNA在线虫细胞内对于靶 基因翻译表达的阻碍作用，为疾病治疗 提供新手段，特别是探究其对RNA病毒 侵染的抑制作用
首个时序调控的miRNA 基因 lin-4发现于线虫，转 录后形成两种长度的RNA，较小的一个与基因lin14的mRNA互补配对阻碍其翻译，随后又发现了类 似作用的let-7.
秀丽线虫的研究和饲养
饲养与冻存
设备试剂： 大肠杆菌OP50 —— 大肠杆菌OP50是尿嘧啶渗漏突变型,作为 秀丽隐杆线虫的食物。
NGM培养基——1000ml的NGM培养基内加有:3gNaCl,2.5g蛋 白胨,17g琼脂,1mol/LK2HPO4-KH2PO4缓冲液 (pH=6.0)25ml,975ml蒸馏水,灭菌后加入分别抽滤除菌的1ml胆固 醇溶液(5mg/ml乙醇),1mol/LMgSO41ml,1mol/L的 CaCl 21ml
CED-9:抗凋亡蛋白,与 人体bcl-2同源
CED-4:促凋亡蛋白,同 源体为Apaf-1
CED-3:凋亡蛋白,与 ICE(caspase家族)同 源
低氧能够引起秀丽线虫发生相应的生理和行为学变 化，并可保护机体免受缺氧损伤。秀丽 线虫的低氧诱导因子(HIF-1)的恒定性调控通路和人 类的相应通路之间具有高度保守性，因此秀丽线虫 也已成为研究低氧应答调控通路进化保守性的重要 工具之一。阐明秀丽线虫的低氧应答机制将为了解 人类低氧相关疾病的发病机制提供有价值的线索。
子代目的基因表达检测
注射后约 3 天，观察孵出的 F1 代是否有目的 DNA 表达． 目前，线虫外源基因表达的标记通常 用：a． 荧光蛋白与目的蛋白形成融合蛋白，但 需要确定荧光蛋白的连接不影响目的蛋白的功能； b． 目的基因与荧光标记基因共注射；c． 目的基因 与具有明显表型的标记基因共注射，我们通常使用易观察的 pmyo-3::TDimer II作为 荧光标记，它在所有体壁肌肉细胞表达，转基因效率高且本身对线虫的行为 和功能 没有 影响。
衰老和寿命控制机制 DAF-16 蛋白可以转运到细胞核中激活 靶基因转录时 线虫的寿命就可延长 反 之则缩短
设备
• 显微注射全套仪器 • 琼脂糖固定垫 •Hale Waihona Puke Baidu添 加 了 4% 葡萄糖 (glucose) 的 M9 缓 冲
液
注射步骤
制剂及破针
固定虫
注射
恢复
将纯化的 DNA 溶解在 TrisEDTA(TE)缓冲液中即可接用 于注射。在注射液中加入终浓 度约 10 mg/L 的线虫基因组 DNA，则会有效地提高转基因 效率。
现阶段研究已发现了十几个控制细胞 凋亡的基因，这些凋亡基因之间通过 遗传相互作用组成一条线性的调控途 径控制细胞程序性死亡，包括凋亡的 激活阶段、凋亡的起始 、凋亡细胞的 清除及凋亡细胞内部的 DNA 降解
EGL-1：促凋亡蛋白，属 BCl—2蛋白家族，与哺乳动 物BAD、BIK/NBK及HRK同 源
轻移滑动载物台， 将注射针尖刺入性 腺． 启动微量加压
器进行注射，能观 察到注射液在性腺 中快速流动，注射 后的性腺被液体充 满．
在体视显微镜下， 滴加恢复缓冲液至 注射后的线虫正上 方，由于与油互不 相溶，缓冲液会渗 入油下使线虫浮起 ． 一般等待 2～ 5 min，线虫活力恢 复，身体开始游动 ，即可挑至培养板 上，20℃ 常规培养 ．