鸡胚繁殖病毒技术
病毒的鸡胚培养
病毒的鸡胚培养一、目的掌握病毒鸡胚接种、收获、HA试验方法和原理二、实验内容1、种蛋选择、消毒与孵化：种蛋为健康未免疫ND疫苗、受精率为90﹪以上的新鲜种蛋。
15g高锰酸钾、30mL甲醛/m3熏蒸消毒30分钟，气室向上38.5-39℃孵化，相对湿度60-70%。
每2小时翻番一次。
2、画蛋与打孔：孵化9-11日龄鸡胚，暗室内画出气室边缘和胚头位置。
于胚头一侧气室边缘上方0.5cm处打孔。
3、接种与封孔：NDV Lasota种毒以灭菌生理盐水作一定倍数稀释（20倍）,尿囊腔内接种0.1ml/胚，以融化的石蜡封孔，继续孵化，不翻蛋。
每日照蛋一次，弃去72h内死亡鸡胚。
至120h全部取出于4℃冰箱过夜。
4、收毒：无菌操作打开气室部位蛋壳，撕开壳膜、尿囊膜和羊膜,吸出尿囊液，观察鸡胚肉眼变化。
5、HA效价测定：原理。
1%鸡RBC制备：采取3只青年公鸡血液，抗凝，以生理盐水离心洗涤3次，制成1%RBC悬液。
血凝试验按下表操作。
病毒鸡胚培养病毒培养可用动物接种、鸡胚培养和组织培养法。
鸡胚接种培养是病毒学的重要方法之一，来自禽类的病毒，均可在鸡胚中繁殖，哺乳动物的病毒如蓝舌病病毒、流感病毒等也可在鸡胚中增殖。
目前鸡胚尤其是SPF、鸡胚被广泛利用于分离病毒、制造疫苗和抗原等，其来源丰富，操作简便。
除病毒外，衣原体、立克次氏体也可用鸡胚来培养，衣原体可在鸡胚卵黄囊繁殖，致死鸡胚；部分立克次氏体也可在卵黄囊中繁殖。
[目的要求](1)掌握鸡胚的孵化过程和不同日龄鸡胚的接种途径和接种方法。
(2)掌握新城疫病毒在鸡胚尿囊腔增殖过程，掌握接毒和收毒的方法。
[实验材料]白壳鸡胚、孵化箱、1mL注射器、蛋架、新城疫工系和Ⅱ系弱毒苗等。
[实验准备]1．鸡胚的选择和孵化应选健康无病鸡群或SPF鸡群的新鲜受精蛋。
为便于照蛋观察，以来航鸡蛋或其他白壳蛋为好。
用孵卵箱孵化，要特别注意温度、湿度和翻蛋。
孵化条件一般选择相对湿度为60％，最低温度36℃，一般37．5℃。
实验六十四 鸡胚胎接种技术
微生物學實驗11-7實驗六十四 雞胚胎接種技術增殖病毒以供病毒學研究用。
很多病毒皆能在雞胚胎之某些部位增殖，例如各種痘病毒在絨毛尿囊膜上增殖良好，而禽流感病毒、新城病病毒都很容易在尿囊腔內增殖，藉由收取尿囊液可獲得大量增殖之病毒，可做為疫苗製造、診斷試劑以及其他病毒學研究之用。
(一) 材料1. 5-6日齡與9-11日齡之雞胚胎蛋2. 病毒接種液3. 1 ml 針筒附26號5/8吋針或23號1又1/3吋針4. 碘酒5. 打洞用鐵釘6. 融化之液態蠟(二) 設備1. 照蛋器2.37℃培養箱第十一章 病毒與血清學的相關技術11-8(一) 尿囊腔接種（allantoic cavity inoculation ）：1. 取9-11日齡之雞胚胎蛋。
2. 以照蛋器透視雞胚胎蛋，調整蛋之位置使氣室在上端，於氣室邊緣上方約 5 mm 以及雞胚之對角處作記號。
3. 以碘酒徹底擦拭消毒後於記號處打洞。
4. 用26號5/8吋針垂直插入洞內約1.2-1.3公分，注入0.1-0.2 ml 之接種液。
5. 以融化之蠟封住洞口。
(二) 卵黃囊接種法（yolk-sac inoculation ）1. 取5-6日齡之雞胚胎蛋。
2. 調整蛋之位置使氣室在上端。
3. 以碘酒徹底消毒後於氣室端做記號並打洞。
4. 以23號1又1/3吋針垂直插入洞內，注入0.5-1.0 ml 之接種液。
5. 以融化之蠟封住洞口。
(三) 絨毛尿囊膜接種法（chorio-allantoic membrane inoculation ；CAM ）1. 取9-11日齡之雞胚胎蛋。
2. 水平調整蛋之位置使氣室在右側。
3. 藉由照蛋器之透視，選擇胚胎之相對位置處，以碘酒徹底消毒後做記號並 打洞。
4. 另外在氣室端也以碘酒徹底消毒後做記號並打洞。
5. 以矽膠吸球吸附於氣室端洞口，原先胚胎相對位置處之絨毛尿。
微生物學實驗11-96. 囊膜集陷落而形成一人工氣室。
7. 以23號針將0.5-1.0 ml 之接種液注入人工氣室上之洞內。
《动物病毒学实验》课件：实验一 病毒在鸡胚中的培养
一、原理
鸡胚为活的动物机体，组织分化程度低，病毒易 于增殖，可选择不同的日龄和接种途径，感染病毒的 组织和液体中含大量病毒。
二、实验目的
了解鸡胚的基本结构与功能，掌握常用的鸡胚 接种方法。
三、鸡胚的结构与功能
➢卵壳 ➢壳膜 ➢气室 ➢绒毛尿囊膜
➢尿囊腔 ➢羊膜与羊膜腔 ➢卵黄 ➢卵白
五、受精卵的选择
➢最好是来自SPF鸡群，以降低母源抗体的影响 ➢受精卵的壳最好是白色的 ➢受精卵必须新鲜，保存在5-20℃不要超过10天，
保存一个月的受精卵，孵化率将近于零。
六、孵育
➢温度：37.5-38.5℃ ➢相对湿度：50%-60% ➢新鲜空气流通，特别是在孵化5-6天以后 ➢翻卵：从孵育后第3天开始，每天翻卵一次。
十一、NDV接种鸡胚后对鸡胚的影响
NDV以尿囊腔接种于9-10日龄鸡胚，强毒株 在30-60h死亡，弱毒株3-6d死亡。死亡的鸡胚 以尿囊液含毒量最高，胚胎全身出血，以头部、 足趾、翅膀出血尤为明显。
十二、收毒
收毒前将鸡胚直立放置于4℃冰箱半小时以上，冻死 胚胎，防止出血。
根据接种途径的不同，收获相应的材料 1. 绒毛尿囊膜接种 收获接种部位绒毛尿囊膜 2. 尿囊腔接种 收获尿囊液（5-8ml） 3. 卵黄囊接种 收获卵黄囊或胚体 4. 羊膜腔接种 收获羊水（0.5-1ml）
• 实验结果观察：周四下午3:50 • 走之前签到，不能代签 • 实验报告选择思考题中3题作答
6.用1ml注射器滴2-3滴接种物于绒毛尿囊膜上。
7.用透明胶纸封住卵窗，或用玻璃纸盖于卵窗中， 周围涂上熔化的石蜡密封，气室中央的小孔用 石蜡密封。
8.胚横卧于卵箱中，不许翻动，保持卵窗向上。
（三） 尿囊腔接种 主要用于正粘病毒和副粘病毒，如流感病
鸡胚接种实验报告
一、实验目的1. 掌握鸡胚接种病毒的方法和步骤。
2. 了解病毒在鸡胚中的生长和繁殖情况。
3. 学习病毒分离和培养的基本原理。
二、实验原理鸡胚接种是一种常用的病毒分离和培养方法。
病毒接种于鸡胚后，能够在鸡胚中繁殖，从而便于观察和分析病毒的生物学特性。
本实验主要采用尿囊腔接种法，将病毒接种于鸡胚尿囊腔内，观察病毒在鸡胚中的生长和繁殖情况。
三、实验材料1. 实验动物：9-11日龄的鸡胚。
2. 实验试剂：新城疫病毒悬液、生理盐水、碘酒、酒精、消毒棉球等。
3. 实验仪器：照蛋器、无菌手术刀、镊子、注射器、剪刀、平皿等。
四、实验方法1. 鸡胚准备：取9-11日龄的鸡胚，用碘酒和酒精消毒鸡胚蛋壳，用手术刀在鸡胚气室处划一小孔，用注射器吸取适量新城疫病毒悬液。
2. 尿囊腔接种：将鸡胚置于卵盘上，气室端向上，用注射器将病毒悬液注入鸡胚尿囊腔内，注入量约为0.1-0.2ml。
3. 孵育：将接种后的鸡胚放入37℃孵卵箱中孵育48-72小时。
4. 观察：定期观察鸡胚的生长发育情况，记录死亡、畸形等现象。
5. 病毒分离：取出死亡鸡胚，无菌操作下取出尿囊液，进行病毒分离和培养。
五、实验结果1. 接种后，部分鸡胚出现死亡现象，死亡时间集中在接种后24-48小时。
2. 死亡鸡胚的尿囊液中检测到新城疫病毒。
3. 成活鸡胚生长发育正常，未出现明显异常。
六、实验讨论1. 鸡胚接种是一种简单、有效的病毒分离和培养方法，适用于多种病毒的研究。
2. 尿囊腔接种法是一种常用的鸡胚接种方法，适用于新城疫病毒、流感病毒等多种病毒。
3. 本实验结果表明，新城疫病毒能够在鸡胚中繁殖，为新城疫病毒的研究提供了有力支持。
七、实验结论1. 鸡胚接种是一种简单、有效的病毒分离和培养方法。
2. 尿囊腔接种法适用于新城疫病毒等多种病毒的分离和培养。
3. 本实验成功分离和培养了新城疫病毒，为新城疫病毒的研究提供了有力支持。
八、实验心得1. 实验过程中，无菌操作至关重要，需严格按照无菌操作规程进行。
病毒的鸡胚接种
病毒的鸡胚接种教学目标使学生掌握病毒的鸡胚接种方法和收获方法。
材料准备1.器材温箱、照蛋器、蛋架、超净工作台、1 mL注射器、20～27 号针头、镊子、酒精灯、灭菌吸管、灭菌滴管、灭菌青霉素瓶、铅笔、透明胶纸等。
2.种毒新城疫病毒悬液。
3.受精卵健康鸡群的受精卵，无母源抗体，产后10 d之内5 d最佳。
4.其他石蜡，质量分数为2.5%的碘酊及质量分数为75%的酒精棉球。
方法步骤（一）鸡卵的保存、孵育及检卵1.保存孵育前，保存在4.5～20 ℃的室温内，以10 ℃左右最佳，最多不能超过10 d。
2.孵育先将温箱调节温度为37.3～37.8 ℃，湿度45%～60%。
将鸡卵孵入后，每日翻卵2～3次。
3.检卵孵后第4~6 d，用照蛋器检查发育情况，检出未受精及死亡鸡胚。
鸡胚的生长情况分为以下几类：（1）未受精 4 ~6d后仅见模糊的卵黄黑影，无鸡胚迹象。
（2）生活鸡胚 4~6 d后可见到清晰的血管小团，内有鸡胚暗影，较大的鸡胚可见胚动。
（3）濒死或死亡鸡胚鸡胚活动呆滞或不能主动运动，血管昏暗或断折沉落。
（4）作标记将待接种的鸡胚取出，在照蛋器上照视，划出气室范围，并在鸡胚黑影，或绒毛尿囊膜发育中心等处，按接种途径要求标出记号。
（二）各种途径的鸡胚接种方法1.尿囊腔接种（1）接种方法孵育9～11日龄的鸡胚（实图6-20），经照视后，划出气室及胚胎位置，标明胚龄及日期，气室朝上立于卵架上。
在气室中心或远离胚胎侧气室边缘先后用碘酊棉球及酒精棉球消毒。
以钢锥在气室的中央或侧边打一小孔，针头沿孔垂直或稍斜插入气室，进入尿囊，向尿囊腔内注入0.1～0.3 mL新城疫病毒悬液，拔出针头,用融化的石蜡封孔，直立孵化（实图6-21）。
孵化期间，每晚照蛋，观察胚胎存活情况。
弃去接种后24 h内死亡的鸡胚。
实图6-20鸡胚的结构实图6-21尿囊腔接种（2）收获方法收获时间须视病毒的种类而定。
新城疫病毒在接种后24～48 h 即可收获病毒。
病毒的鸡胚培养法
（四）收获病毒
鸡胚为活的有机体，因此要严格无菌操作， 同时动作要仔细，以免造成物理死亡。接种 后24小时内死亡应不计结果。
病 毒 的 鸡 胚 培 养 法
刘映乐
1911年 Rous首先将鸡胚应用于Rous肉瘤病 毒的培养 1938年 Cox应用卵黄囊培养立克次氏体
鸡胚培养法的优点：
1. 组织分化程度低
2. 有神经血管的分布及脏器的构造
3. 来源充足，操作简单 4. 胚体通常无菌
5. 对接种的病毒不产生抗体
鸡胚培养法的缺点：
（三）接种途径
尿囊腔接种
该途径一般用于病毒的（流感、新城鸡瘟病毒 和腮腺炎）适应和传代。
尿囊腔接种
卵黄囊接种
该途径主要用于抗病毒（流感）的药物实验。
羊膜腔接种
该途径主要用于临床材料（如患者的鼻洗液及咽 漱液）的病毒分离。
绒毛尿囊膜接种
该途径主要用于病毒滴定、中和试验和药物实验。
1. 病毒通常不能使鸡胚产生特异性的感染指征。 2. 常规饲养方式的不足
3. 培养病毒的种类有限
鸡胚的结构与生理
鸡胚由三个胚层发育而来，即外胚层，中胚
层和内胚层，它们构成了胚胎的组织与器官
鸡 胚 培 养 的 病 毒 接 种（一）活胚检查 Nhomakorabea1.血管
2.胎动 3.绒毛尿囊膜
（二）实验材料
鸡受精卵, 照蛋灯, 打孔器或剪刀, 蛋盘, 无菌注 射器和针头, 消毒酒精, 酒精灯, 石腊 病毒毒种用生理盐水稀释备用
鸡胚繁殖病毒技术
二、鸡胚的孵化
• 1、消毒 • 新入孵的种蛋都要进行表面消毒，一般采用消毒 液浸泡或福尔马林熏蒸。 • 0.1%～0.2%的新洁尔灭溶液浸泡。 • 福尔马林熏蒸：种蛋放入孵化器后，孵化器温度 达到37℃，相对湿度达到90%，每立方米用13ml 甲醛和6.5g高锰酸钾，放入烧杯中混合，迅速放 入孵化器中关闭箱门，20分钟后打开箱门，通风 排除甲醛蒸汽，继续孵化。
2、病毒含量测定：
• 可以根据情况多瓶混合后进行检验，根据 不同的病毒采用不同的方法测定病毒含量， 为配苗提供依据。
3、其他检验：
• 支原体检验、外源病毒检验、安全检验等， 一般半成品不做，只检验成品。
七、病毒液的保存
• 经过检验的病毒液应马上加入抗生素，防 止细菌污染，塞上胶塞，放-15℃冷库保存， 保存期限视不同病毒而定，一般不应超过6 个月。
2、孵化
• 种蛋的孵化一般温度设定为38℃，相对湿 度设定为65%，每天翻蛋1～4次。 • 孵化过程中要求有专人管理，记录种蛋的 入孵时间、数量、出蛋时间、数量，还要 每4小时记录孵化器内的温度、湿度等参数， 如果遇到故障应马上报告以便及时进行维 修，避免造成损失。
三、鸡胚接种
• 鸡胚接种前要先进行检蛋，选择发育良好、 血线清晰的鸡胚。发育不良或没有发育 （没有受精）的、变黑的、死亡的鸡胚应 弃去不用。
四、接种后鸡胚的检验
• 接种后24小时照蛋，挑出死亡的鸡胚弃去 不用。 • 以后每4～6小时照蛋一次，随时取出死亡 的鸡胚，放入2℃～8℃冷库中冷胚。
五、收获病毒液内，先 用5%的碘酊在鸡蛋的气室处涂抹 消毒，15分钟后用75%的酒精脱碘。
2、收获：根据不同的病毒收获不同的成 分，最常用的是鸡胚尿囊液。用大镊 子剪去气室部分的蛋壳，注意蛋壳的 碎屑不要掉到里面，用灭菌的医用眼 科镊子斜插入绒毛尿囊膜内，压向胚 胎一侧，用玻璃吸管把尿囊液吸入无 菌的500ml瓶中，尽量把胚液吸净。 3、编号：把收获的病毒液每瓶贴上标签， 注明名称、批号、编号、生产日期等 信息，避免混淆。
病毒的鸡胚培养法
卵黄囊接种
鸡胚的各种接种途径
1.绒毛尿囊膜接种 2.尿囊腔接种 3.羊水腔接种 4.卵黄囊接种
3.收毒：病毒的收毒根据接种的途径而定。
绒毛尿囊腔内接种 ★★
尿囊液
绒毛尿囊膜接种
绒毛尿囊膜
羊膜腔接种 卵黄囊内接种
羊水 卵黄液和卵黄膜
4.废料处理
• 操作完毕，将所有的用具煮沸消毒，擦净 后再以消毒水浸洗，卵壳、壳膜和胚胎等 残物煮沸消毒后弃去。
• b.病毒材料的准备：要分离培养的病毒材料应
是无菌的，因此在处理材料的过程中，应严格按 照无菌操作进行，将新城疫弱毒活疫苗按照每 1000羽份配成250ml,为达到无菌的目的，可在 每毫升接种物中加入青霉素和链霉素各1005000IU，置室温中1h处理。
法氏囊病毒的分离
• 取疑似感染病毒的法氏囊，称重，按1:5 （w/v）加入生理盐水，研磨，-20℃，反复 冻融2次；每次冷冻时间以研磨物结冰为准；
绒毛尿囊膜接种
1.鸡胚胎2.羊膜腔3.绒毛尿囊膜
羊膜腔接种
取10-12日龄的鸡胚，消
毒气室顶上的蛋壳，并
将气室顶端的蛋壳锉一
三角形的裂痕，用灭菌
镊子揭去裂痕部位的蛋
壳和壳膜，用灭菌平头
镊子刺破尿囊膜，并轻
轻夹去羊膜，用小号针
头刺进羊膜腔内，注入
0.05-0.1ml的病毒接种
液，以氧化锌胶布封口，
滴上溶化的固体石蜡。
（三）实验器材
• 1.鸡胚：要选择SPF鸡胚或低母源抗体的鸡胚。
从实践看，法氏囊炎病毒对抗体相当敏感，所以 要用无母源抗体的鸡胚；而新城疫病毒、禽流感 病毒等可抵御母源抗体的作用而得以繁殖致死鸡 胚。
• 孵化前的鸡胚应注意消毒，置37-38℃、相对湿
鸡胚培养法
鸡胚培养法（病毒分离培养）鸡胚是发育的机体，适合许多人类和动物病毒及立克次体的生长增值，常用于痘类病毒、粘液病毒、和疱疹病毒的分离、鉴定、抗原准备、疫苗生产以及病毒性质等方面的研究。
鸡胚培养病毒，常用的接种途径包括绒毛尿囊膜，尿囊腔、羊膜腔以及卵黄囊接种四种。
根据不同病毒，不同实验目的以及不同来源的标本，选择不同的途径接种鸡胚进行培养，即可达到分离培养病毒和传代病毒的目的。
本片主要介绍尿囊腔和羊膜腔两种接种途径在病毒分离培养和传代中的应用。
鸡胚的接种方法、孵育及收获一、仪器和器材SPF鸡卵或鸡胚、二级生物安全柜、孵卵箱或恒温箱、检卵灯、照蛋灯、开卵钻、卵盘、1ml、1次注射器、医用胶布、液体石蜡、无菌镊子、巴氏吸管、15 ml无菌离心管、试管架、96孔微量反应板、加样槽、移液器、75%酒精、生理盐水等。
二、鸡胚的孵育应选择保存温度在100左右，时间不超过10天，卵壳薄而色浅的鸡卵，用于鸡胚的孵育。
特别脏的鸡卵需用清水清洗，用布擦干后孵育，干净的鸡卵不必做任何处理。
将鸡卵置于380C---390C孵卵箱，在孵卵箱底层盛水器中放入干净自来水，以保证鸡胚发育的湿度，病保持良好的通风，孵育至第四天，于检卵灯上检查鸡胚受精与否及发育情况。
受精鸡卵可见清晰地血管小团和发育的鸡胚迹象，似蜘蛛壮，未受精鸡卵仅能看见模糊的卵黄黑影，无鸡胚迹象。
在孵育过程中，应随时对鸡胚进行检查，淘汰濒死或已经死亡的鸡胚。
若在恒温箱里孵育鸡胚，则应在恒温箱底层放入装满水的广口容器，并从孵育的第3天起，每天180度转到鸡胚1—2次，是鸡胚发育匀称。
也可直接订购孵育9—11日龄的鸡胚。
如何判断鸡胚存活状态：1胎动：于检卵灯下可见活胎有明显的自然运动，但胎龄大于14天的胚胎，胎动不明显，甚至无胎动，死胎则无任何胎动，胎发红似出血样，有的呈现黑快。
2血管：活胚可见清晰地血管，卵壳较薄者还可见血管的搏动。
死胎血管模糊，成淤血带或淤血块。
3绒毛尿囊膜发育界限：生活良好的胚胎可见密布血管的绒毛尿囊膜，与胚胎的另一面形成良好的界限须将上面三个方面结合起来进行观察，如果胚胎活动呆滞或不能主动地运动，血管模糊扩张，或折断沉落，绒毛尿囊界限模糊，则可判断胚胎濒死或已经死亡。
病毒的鸡胚培养
病毒的鸡胚培养一、目的要求掌握鸡胚尿囊腔接种培养新城疫病毒的操作技术。
二、器材1.鸡胚应选用健康鸡群的受精蛋，接种鸡的鸡胚应无母源抗体，以免影响病毒在胚胎中的增殖。
实验用的鸡胚多采用9—10日龄的活胚。
2.接种材料新城疫I系疫苗3.各种器械孵卵器、照蛋箱、蛋架、打孔器、1ml结核菌素注射器、41/2号注射针头、镊子、3%碘酊、75%酒精棉球、铅笔、酒精灯、剪刀、眼科镊子、灭菌的疫苗瓶、灭菌滴管和固体石蜡等。
三、内容和方法（一）接种前的准备1.鸡胚的准备本实验选择9—10日龄的鸡胚，在照蛋时以铅笔勾划出气室，于气室稍下方胚胎活跃而血管明显的区域中，在血管之间的间隙划上记号，作为接种部位；用0、 1%新洁尔灭把蛋壳搽洗干净并抹干，再以2%碘酊对接种部位进行消毒，用75%酒精再擦一遍，在接种定位出打孔，气室向上竖放于蛋架上。
2.病毒接种材料的准备要分离培养的病毒材料应是无菌的，因此为达到材料无菌的目的，可在每ml接种物质中加青霉素和链霉素各100—500IU，置室温中1小时或冰箱中12—24小时处理。
或经滤器除菌。
（二）接种绒毛尿囊腔内注射：用6号针头的1ml注射器吸取新城疫病毒材料，针头从已打好的小孔中向鸡胚方向插入0.5—-1cm,注入0、1ml （相当0、5羽份），再加氧化锌胶布贴封,再加融化的固体石蜡封口,放回孵化箱中进行孵化,每天翻蛋两次,照视一次.24小时内死亡的舍去。
（三）收获新城疫I系病毒材料，在接种24—48小时即可收获。
收获前应将鸡胚置4度冰箱冷藏4小时或过夜，以免解剖时血管破裂。
碘酒消毒蛋壳，用镊子去卵壳和尿囊膜，用吸头吸尿囊液于瓶内，可收集5-8ml，无菌检查，冰冻保存。
病毒培养技术
悬浮培养
通过振荡或转动装置使细胞始终处于分散悬浮于培养液内 的培养方法，主要用于一些在振荡或搅拌下能生长繁殖的细 胞，如生产单克隆抗体的杂交瘤细胞。
微载体培养
微载体直径应为60～105nm，无毒性，透明，颗粒密度与培 养液密度相近似，略重于液体，低速搅拌即能悬浮，不吸收 培养液和化学反应，表面光滑、硬度小、有弹性，易于细胞 吸 附 在 表 面 ， 如 DEAE—SephadexA-50 、 Cytodexl 、 Cytodex2、Cytodex3等。
有些病毒不产生CPE。 病毒收获：CPE达80％时收获，反复冻融多次使病毒释放，
然后离心除去细胞碎片，上清病毒液-20℃保存。 病毒毒价：TCID50、中和试验、AGP效价、HA
疫苗制造工艺流程
病毒性细胞疫苗制造工艺流程
病毒性组织疫苗制造工艺流程
细菌疫苗和类毒素制造工艺流程
寄生虫疫苗制备的工艺流程
3. 细胞培养要素
•培养液 •血清 •细胞接种量 •pH •温度 •无菌条件 •培养器皿清洁度
RPMI-1640、199、 DMEM、F12
血清
• 成分：必需氨基酸、促进细胞生长和贴壁的成分。α-珠蛋 白和白蛋白能促进细胞生长；白蛋白具有毒作用；糖蛋白、 a2-球蛋白和β脂蛋白G2能促进细胞贴壁。
（1）原代细胞(primary cell)
指由新鲜组织经剪碎和胰酶消化制备的细胞，如CEF细胞。
（2）细胞株(cell strain) 又称二倍体细胞
指自继代培养的细胞中选育出具有特殊生物学性质和标记的 细胞。这类细胞且能保持原来的二倍染色体数目，能连续传很 多 代 (50 ～ 100 代 ) ， 但 为 有 限 生 命 ； 没 有 肿 瘤 原 。 如 PKl5 、 BHK21和Vero （3）传代细胞（continued cell line）\ 细胞系(cell line)
3-3动物微生物--病毒的鸡胚接种技术(实验四)
室端 3）用钢锥在气室中央锥 一 小孔
4） 用注射器吸取病毒悬液，沿气室端所穿小
孔垂直刺入3cm，注入0.1-0.5ml病毒液。
5）用熔化的石蜡封孔，置孵卵箱内继续孵育，
每天翻卵1-2次，24h内死亡者废弃。
方法二：
1）2）同一 3）将卵横放在卵座上， 胚胎位置向下。在卵长 径的1/2处用碘酊和酒 精消毒。 4）用钢锥打一小孔，将针头刺入约1.5cm， 注入病毒液0.1-0.5ml 5）用熔化的石蜡封孔，置孵卵箱内继续孵
羊膜与羊膜腔 其中盛有羊水，胎体浸泡于其中
卵黄 在胚胎发育早期供给鸡胚营养。
卵白 在胚胎发育晚期供给鸡胚营养。
四、材料
1、鸡胚 10日龄
2、病毒 鸡新城疫病毒（NDV） 3、照蛋灯 4、打孔器 5、石蜡 6、注射器 7、蛋座 8、酒精棉球自SPF鸡群，以降低母源抗体的影响 受精卵的壳最好是白色的
受精卵必须新鲜，保存在5-20℃不要超过10天，
保存一个月的受精卵，孵化率将近于零。
六、孵育
孵卵箱内的温度应保持在37.5-38.5℃ 相对湿度：50%-60%
必须保证有充分的新鲜空气流通，特别是在孵
化5-6天以后
从孵育后第3天开始，每天翻卵一次。
七、检卵
自孵育后的第4天开始检卵，每天一次。
育，24h内死亡者废弃
（二）绒毛尿囊膜接种 主要用于痘病毒和疱疹病毒的分离和增殖。 方法一： 1）取10-12日龄鸡胚，画出气室部，消毒 2）在气室端的卵壳上开一1.5×1.5cm的口 3）用灭菌眼科镊子撕去一小片内壳膜 4）滴入接种物 5）用胶布或透明胶纸封闭切口
方法二：（要做人工气室） 1、在胚胎附近近气室处，选择血管较少的部位，用 电烙器在卵壳上烙一个直径约3-4mm的烤焦圈。
鸡胚接种的方法与步骤
鸡胚接种的方法与步骤
鸡胚接种是一种常用的病毒分离和培养方法，其基本步骤如下：1. 选择合适的鸡胚：通常选择9-12 日龄的鸡胚，此时鸡胚的免疫系统尚未完全发育，适合病毒的生长和繁殖。
2. 准备接种材料：将待接种的病毒样品稀释到适当的浓度，并准备好接种工具，如吸管、针头、注射器等。
3. 接种鸡胚：将稀释后的病毒样品接种到鸡胚的尿囊腔、卵黄囊或绒毛尿囊膜等部位。
接种时要注意操作规范，避免污染和损伤鸡胚。
4. 孵化鸡胚：将接种后的鸡胚放入孵化箱中，在适当的温度和湿度条件下孵化，让病毒在鸡胚中生长和繁殖。
5. 观察和检测：在孵化过程中，定期观察鸡胚的生长情况和病变特征，如鸡胚是否死亡、是否出现出血点、是否出现痘斑等。
同时，可以进行病毒的分离和鉴定，以确定病毒的种类和特性。
6. 收获病毒：当病毒在鸡胚中生长和繁殖到一定程度时，可以收获病毒。
收获病毒的方法包括离心、过滤、沉淀等，具体方法取决于病毒的种类和特性。
7. 保存病毒：收获的病毒可以保存在适当的温度和湿度条件下，以备后续的实验和研究使用。
需要注意的是，鸡胚接种是一项技术性较强的操作，需要严格遵守实验操作规范和安全注意事项，以确保实验的准确性和安全性。
同
时，在进行鸡胚接种实验时，应该遵循相关的法律法规和伦理规范，确保实验的合法性和道德性。
实训四病毒的鸡胚接种技术.ppt
实训四 病毒的鸡胚接种技术
三、方法与步骤
鸡胚结构示意图
1. 气室 8.羊水腔
2. 胚壳
9.绒毛尿囊膜
3. 卵黄囊
4. 清蛋白
5. 尿囊腔
6. 壳膜
7. 胚体
实训四 病毒的鸡胚接种技术
实训四 病毒的鸡胚接种技术
三、方法与步骤
• 照蛋
以铅笔划出气室、胚胎位置及接种的位置，标明胚龄及 日期气室朝上立于蛋架上。尿囊腔接种选9～12日龄的鸡 胚，接种部位可选择在气室中心或远离胚胎侧气室边缘， 避开大血管。
实训四 病毒的鸡胚接种技术
实训四 病毒的鸡胚5%碘酊棉球和75%酒精棉从中央 向四周进行消毒。
• 打孔
用灭菌的锥子在事先消毒的部位打一小孔。
实训四 病毒的鸡胚接种技术
三、方法与步骤
• 接种NDV
无菌操作用一次性1ml注射器吸取新城疫病毒液垂直或稍斜插 入气室,刺入尿囊腔，向尿囊腔内注入0.1～0.3ml。
• 封孔
接种病毒完成后，用熔化的石蜡将小孔封闭。
实训四 病毒的鸡胚接种技术
三、方法与步骤
• 继续孵化与照胚
封孔完成后，将鸡胚置温箱中直立孵化3～7d。孵化期间，每 6h照蛋一次，观察胚胎存活情况。弃去接种后24h内死亡的 鸡胚，24h以后死亡的鸡胚应置0～4℃冰箱中冷藏4h或过夜 （气室朝上直立），一定时间内不能致死的鸡胚也放冰箱 冻死（新城疫Ⅳ系疫苗株一般培养至72小时）。
实训四 病毒的鸡胚接种技术
四、病毒的收获
实训四 病毒的鸡胚接种技术
四、病毒的收获
绒毛尿囊腔接种新城疫病毒时，一般收获尿囊液和羊水。 将鸡胚取出，无菌操作轻轻敲打并揭去气室顶部蛋壳及壳 膜，形成直径1.5～2.0cm的开口。用灭菌镊子夹起并撕开 或用眼科剪剪开气室中央的绒毛尿囊膜，然后用灭菌吸管 从破口处吸取尿囊液，注入灭菌青霉素瓶或试管内。
食品生物技术《实验三 动物病毒的鸡胚培养》
实验三动物病毒的鸡胚培养一、实验目的掌握鸡胚培养病毒的接毒和收毒方法，明确鸡胚培养病毒的应用三、器材1．病毒痘苗病毒〔Vaccinia virus〕，鸡新城疫病毒〔Newcastle distase virus〕。
2仪器或其他用具孵卵器，检卵灯，齿钻，磨壳器，钢针，蛋座木架，注射器，25％碘酒，70％乙醇，镊子，剪刀，封蜡〔固体石蜡加1／4凡士林，溶化〕，灭菌培养板，灭菌盖玻片等。
3白壳受精卵〔自产出后不超过10d，以5d以内的卵为最好〕。
四、操作步骤1．准备蛋胚孵育前的鸡卵先用清水以布洗净，再用干布擦干，放入孵卵器内进行孵育〔37℃，相对湿度是45%~60%〕，孵育3d后，鸡卵每日翻动1~2次。
孵至第4d，用检卵灯观察鸡胚发育情况，未受精卵，只见模糊的卵黄黑影，不见鸡胚的形迹，这种鸡卵应淘汰。
活胚可看到清晰的血管和鸡胚的暗影，比拟大一些的可以看见胚动，随后每日观察一次，将胚动呆滞的或没有运动的、血管昏暗模糊者，即可能是已死或将死的鸡胚，要随时加以淘汰。
生长良好的蛋胚一直孵育到接种前，具体胚龄视所拟培养的病毒种类和接种途径而定。
鸡卵孵化期间，箱内应保持新鲜空气流通，特别是孵化5~6d 后，鸡胚发育加快，氧气需要量加大，空气供给缺乏，会导致鸡胚大量死亡。
2接种〔1〕绒毛尿囊膜接种℃将孵育10~12d的蛋胚放到检卵灯上，用铅笔勾出其实与胚胎略近气室端的绒毛尿囊膜发育的好的地方。
℃用碘酒消毒气室顶端与绒毛尿囊膜记号处，并用磨壳器或齿钻在记号处的卵壳上磨开一三角形或正方形〔每边约5~6mm〕的小窗，不可弄破下面的壳膜。
在气室顶端钻一小孔。
℃用小镊子轻轻揭去所开小窗处的卵壳，露出壳下的壳膜，在壳膜上滴一滴生理盐水，用针尖小心地划破壳膜，但注意切勿伤及紧贴在下面的绒毛尿囊膜，以利两膜别离。
℃用针刺破其实小孔处的壳膜，再用橡皮乳头吸出气室内的空气，是绒毛尿囊膜下陷而形成人工气室〔图℃—4〕。
℃用注射器通过窗口的壳膜窗孔滴005~痘苗病毒液于毛绒尿囊膜上。
病毒学实验一鸡胚接种培养
实验要求
• 出勤率 • 实验过程中安静、有序、认真、无污染 • 实验报告书写 • 值日生打扫卫生
注意事项
1 最好选用SPF鸡胚。 2 受精卵入孵后要注意翻蛋。 3 检卵时避免照蛋时间过长引起鸡胚温度下
降过大。 4 接种鸡胚时应尽可能避开血管丰富区域。 5 温箱底盘中要加入足够量的蒸馏水以保持
一定的湿度。
思考题
为什么要将接种后孵化24h内死亡的鸡胚剔除？
鸡胚接种
1 选用9～11日龄发育良好的鸡胚。 2 在接种前用检卵器观察并标记出胚胎的气室及胚胎位置，
在气室下边的胚胎附近没有大血管区域标示出尿囊腔接种 部位。 3 把鸡胚气室向上放置于蛋托上，对接种的气室蛋壳表面 用酒精棉和碘酊消毒。 4 将钻孔器在酒精灯火焰下烧灼消毒后，在气室卵壳端打 孔，用1ml注射器吸取接种0.1ml病毒液，从气室下的蛋 壳侧面经气室将针头斜刺入要接种的尿囊腔部位约1.5cm， 注入接种液。 5 用熔化的蜡封闭卵壳上的孔，气室朝上置于温箱内孵育。 6 对已接种的鸡胚每天在检卵灯下检查胚卵，发现鸡胚死亡 立即放入冰箱，将24h内死亡的鸡胚剔除。 7 2～4天后，收获尿囊液。
• 实验原理：尿囊腔接种法广泛应用于病毒 的适应和传代培养，病毒被注射到尿囊腔 后，可在内皮细胞中被复制，复制的病毒 被释放到尿囊液中，因此，在尿囊液中含 有大量的病毒。
实验器材
• 鸡胚、孵化设备、检卵器、钻孔器、蛋托、 超净台、冰箱、酒精灯、碘酒、酒精棉球、 注射器、蜡烛
《动物病毒学实验》课件：实验一 病毒在鸡胚中的培养
十三、试验报告作业
1. 用于病毒培养的系统主要有哪些？ 2. 常用的鸡胚接种方法有哪些? 3. 简要说明鸡胚的结构及各部分结构的功能。 4. 用鸡胚来进行病毒的培养要注意哪些问题? 5. 如何区分无精卵、死胚、活胚？为什么最好
选用白壳蛋？
6. 卵黄囊接种与尿囊腔接种所用鸡胚日龄各是 多少？为什么两者不一样？
• 实验结果观察：周四下午3:50 • 走之前签到，不能代签 • 实验报告选择思考题中3题作答
2.在气室接近胚体处用碘酊和酒精依次消毒
3.用钢锥穿一小孔（右图哪种接种方式较好？）
4.将注射器针头经小孔沿卵长轴方向插入0.51.0cm，注入0.1-0.2ml接种物（插入部位的选择，
胚体、对面还是两侧？如果注射器打不起去说明什么？）
5.用石蜡封孔，并置孵卵箱中孵育，每天翻卵并 检卵一次，24h内死亡者废弃
（一）优点
➢组织分化程度低，病毒易于增殖 ➢可选择不同的日龄和接种途径 ➢感染病毒的组织和液体中含大量病毒 ➢容易采集和处理 ➢来源充足 ➢设备和操作简便易行
（二）缺点
➢胚内可能污染细菌和病毒 沙门氏菌、禽白血病病毒、新城疫、禽脑脊
髓炎病毒 ➢母源抗体 ➢许多病毒在鸡胚中增殖缺乏特异性的感染指针
十、接种途径
白鼠、大白鼠、豚鼠 ✓ 鸡胚 ✓ 组织细胞
✓ 怎么辨别公鸡母鸡？ ✓ 什么是鸡胚？（受精 还是未受精） ✓ 鸡胚如何生产？ ✓ 如何判断鸡胚是活的？
是否有血丝？
一、原理
鸡胚为活的动物机体，组织分化程度低，病毒易 于增殖，可选择不同的日龄和接种途径，感染病毒的 组织和液体中含大量病毒。
二、实验目的
动物病毒学实验
病毒学实验要求
➢ 做好生物防护
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2、孵化
• 种蛋的孵化一般温度设定为38℃，相对湿 度设定为65%，每天翻蛋1～4次。 • 孵化过程中要求有专人管理，记录种蛋的 入孵时间、数量、出蛋时间、数量，还要 每4小时记录孵化器内的温度、湿度等参数， 如果遇到故障应马上报告以便及时进行维 修，避免造成损失。
三、鸡胚接种
• 鸡胚接种前要先进行检蛋，选择发育良好、 血线清晰的鸡胚。发育不良或没有发育 （没有受精）的、变黑的、死亡的鸡胚应 弃去不用。
2、病毒含量测定：
• 可以根据情况多瓶混合后进行检验，根据 不同的病毒采用不同的方法测定病毒含量， 为配苗提供依据。
3、其他检验：
• 支原体检验、外源病毒检验、安全检验等， 一般半成品不做，只检验成品。
七、病毒液的保存
• 经过检验的病毒液应马上加入抗生素，防 止细菌污染，塞上胶塞，放-15℃冷库保存， 保存期限视不同病毒而定，一般不应超过6 个月。
ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
1、接种方法：
• 根据不同的病毒（或其他微生物）选择不 同的接种方法。包括尿囊腔接种、绒毛尿 囊膜接种、羊膜腔接种、卵黄囊接种、静 脉接种、脑内接种等。
• 其中最常用的方法是尿囊腔接种，方法是 取9～10日龄鸡胚，画出气室范围，离气室 边缘0.3～0.5mm无大血管处做一个记号， 作为接种孔的位置。先用5%的碘酊消毒， 15分钟后用75%的酒精脱碘，然后用消毒 的锥子在记号处打一个小孔，用1ml注射器 的针头刺入0.5～1cm，注入种毒，用白蜡 封口。接种后继续孵化，一般温度设定为 37℃左右，相对湿度设定为70%～90%， 继续孵化2～7天，不必翻蛋。
四、接种后鸡胚的检验
• 接种后24小时照蛋，挑出死亡的鸡胚弃去 不用。 • 以后每4～6小时照蛋一次，随时取出死亡 的鸡胚，放入2℃～8℃冷库中冷胚。
五、收获病毒液
1、 消毒：
• 把冷却好的鸡胚放入无菌室内，先 用5%的碘酊在鸡蛋的气室处涂抹 消毒，15分钟后用75%的酒精脱碘。
2、收获：根据不同的病毒收获不同的成 分，最常用的是鸡胚尿囊液。用大镊 子剪去气室部分的蛋壳，注意蛋壳的 碎屑不要掉到里面，用灭菌的医用眼 科镊子斜插入绒毛尿囊膜内，压向胚 胎一侧，用玻璃吸管把尿囊液吸入无 菌的500ml瓶中，尽量把胚液吸净。 3、编号：把收获的病毒液每瓶贴上标签， 注明名称、批号、编号、生产日期等 信息，避免混淆。
六、病毒液的检验
• 1、无菌检验： • 收获的病毒液如果用于冻干苗的生产要逐瓶进行 无菌检验。 • 检验方法：先准备好检验培养基每套2支酪胨琼脂 和2支硫乙醇酸盐，将培养基与收获的病毒液对应 编号，每瓶病毒液用灭菌的注射器抽取2ml左右， 每支加入0.5ml左右，盖好塞后分别放入37℃和 25℃培养箱中培养，5天后观察结果，固体培养 基斜面上有菌生长、液体培养基变浑浊的判为污 染，应弃去不用。
二、鸡胚的孵化
• 1、消毒 • 新入孵的种蛋都要进行表面消毒，一般采用消毒 液浸泡或福尔马林熏蒸。 • 0.1%～0.2%的新洁尔灭溶液浸泡。 • 福尔马林熏蒸：种蛋放入孵化器后，孵化器温度 达到37℃，相对湿度达到90%，每立方米用13ml 甲醛和6.5g高锰酸钾，放入烧杯中混合，迅速放 入孵化器中关闭箱门，20分钟后打开箱门，通风 排除甲醛蒸汽，继续孵化。
鸡胚繁殖病毒技术
2012年10月
• 许多病毒尤其是禽源病毒都能 在鸡胚中生长繁殖，利用鸡胚 可以进行病毒的分离、鉴定、 抗原制备和疫苗生产。除了鸡 胚外，鹅胚和鸭胚也可以用于 某些病毒的增殖。
一、鸡胚的选择
• 1、冻干苗应选择受精率比较高的（90%以 上）SPF种鸡蛋，鸡蛋必须新鲜、洁净。原 因是SPF种鸡蛋不携带致病微生物，生产出 来的疫苗更安全。SPF种鸡蛋没有干扰病毒 增殖的母源抗体，与普通种蛋相比能明显 提高病毒含量。 • 2、灭活苗可以选择受精率比较高的（90% 以上）普通低免疫蛋，好处就是成本比较 低。