食品中β-胡萝卜素的测定 标准文本(食品安全国家标准)

食品安全国家标准
食品中β-胡萝卜素的测定
1范围
本标准规定了食品中β-胡萝卜素的测定方法。

本标准适用于食品中β-胡萝卜素的测定。

2原理
试样经皂化后，使β-胡萝卜素完全变为游离态。

用石油醚萃取后，反相色谱法分离，外标法定量。

3试剂和材料
注：除非另有规定，本方法所用试剂均为分析纯，水为GB/T 6682 规定的一级水。

3.1试剂
3.1.1α-淀粉酶：酶活力≥1.5 U/mg。

3.1.2氢氧化钾（KOH）。

3.1.3无水硫酸钠（Na2SO4）。

3.1.4抗坏血酸(C6H8O6)。

3.1.5石油醚：沸程30 ℃～60 ℃。

3.1.6甲醇(CH4O)：色谱纯。

3.1.7乙腈(C2H3N)：色谱纯。

3.1.8三氯甲烷(CHCl3)：色谱纯。

3.1.9正己烷(C6H14)：色谱纯。

3.1.10甲基叔丁基醚[CH3OC(CH3)3]：色谱纯。

3.1.11乙醇：体积分数为95 %。

3.2试剂配制
3.2.1氢氧化钾溶液：称固体氢氧化钾250 g，加入200 mL 水溶解。

临用前配制。

3.3标准品
3.3.1β-胡萝卜素标准品，CAS：7235-40-7。

3.3.2α-胡萝卜素标准品，CAS：7488-99-5。

3.4标准溶液的配制
3.4.1β-胡萝卜素标准储备液（500 g/mL）：准确称取β-胡萝卜素标准品50 mg（精确到0.1mg），用正己烷定容至100 mL 棕色容量瓶中。

注：β-胡萝卜素标准储备液需要-10 ℃以下避光储存，使用期限不超过3个月。

标准储备液用前需校正，具
体操作见附录A。

3.4.2β-胡萝卜素标准中间液（100 μg/mL）：从β-胡萝卜素标准储备液中准确移取10.0 mL 溶液于50 mL 棕色容量瓶中，用正己烷定容至刻度。

3.4.3β-胡萝卜素标准工作液：从β-胡萝卜素标准中间液中分别准确移取0.50 mL、1.00 mL、2.00 mL、3.00 mL、4.00 mL 溶液至5 个100 mL 棕色容量瓶。

，用正己烷定容至刻度，得到浓度为0.5 μg/mL、1.0 μg/mL、2.0 μg/mL 、3.0 μg/mL 、4.0 μg/mL 的系列标准工作液。

3.4.4α-胡萝卜素标准储备液（500 μg/mL）：准确称取β-胡萝卜素标准品50 mg（精确到0.1mg），用正己烷定容至100 mL 棕色容量瓶中。

注：α-胡萝卜素标准储备液需要-10 ℃以下避光储存，使用期限不超过3个月。

标准储备液用前需校正，具体操作见附录A。

3.4.5α-胡萝卜素标准中间液（100 μg/mL）：从α-胡萝卜素标准储备液中准确移取10.0 mL 溶液于50 mL 棕色容量瓶中，用正己烷定容至刻度。

3.4.6α-胡萝卜素和β-胡萝卜素混合标准工作液：分别从α-胡萝卜素标准中间液和β-胡萝卜素标准中间液中准确移取0.50 mL、1.00 mL、2.00 mL、3.00 mL、4.00 mL 溶液至5 个100 mL 棕色容量瓶，得到浓度为α-胡萝卜素和β-胡萝卜素浓度均为0.5μg/mL、1.0μg/mL、
2.0μg/mL 、
3.0μg/mL、
4.0 μg/mL的系列混合标准工作液。

4仪器与设备
4.1高效液相色谱仪，带紫外检测器。

4.2旋转蒸发器。

4.3恒温磁力搅拌器：20 ℃～80 ℃。

4.4离心机：转速≥5000rpm。

4.5分析天平：感量为0.1 mg 。

4.6氮吹仪。

4.7恒温水浴箱：控温精度±1℃。

5分析步骤
5.1试样制备
谷物、豆类、坚果等试样需粉碎、研磨、过筛（筛板孔径0.3 mm～0.5 mm)；蔬菜、水果、蛋、藻类等试样用匀质器混匀；谷粉、乳粉等试样用前振摇混合。

4℃冰箱可保存1周。

5.2试样处理
5.2.1 无添加β-胡萝卜素的试样
称取粉碎或匀浆混匀的试样（约含β-胡萝卜素20 μg，精确至0.001 g）于250 mL 锥形瓶中，加入1g 抗坏血酸，加入75 mL 乙醇，60 ℃±1 ℃水浴回流加热30 min。

5.2.2 添加β-胡萝卜素的试样
5.2.2.1 高淀粉试样：称取混合均匀的试样（约含β-胡萝卜素20 μg，精确至0.001 g）于250 mL 三角瓶中，加入1.0 g 抗坏血酸，固体试样需用50 mL45 ℃～50 ℃的水溶解并混合均匀。

加入l g α-淀粉酶，向三角瓶中充氮后盖上瓶塞，置60 ℃±2 ℃培养箱内酶解30 min。

5.2.2.2 非淀粉类试样：称取混合均匀的试样（约含β-胡萝卜素20 μg，精确至0.001 g ），置
于250 mL三角瓶中，加入1.0 g 抗坏血酸，固体试样需用50 mL 45 ℃～50 ℃的水溶解并混合均匀。

5.3待测液的制备
5.3.1 皂化
5.3.1.1无添加β-胡萝卜素的试样:将25 mL 氢氧化钾溶液加入到试样溶液中，放入磁力棒，充入氮气排出空气，盖上胶塞。

将1000 mL 的烧杯中加入约300 mL 的水，将烧杯放在恒温磁力搅拌器上，当水温控制在53 ℃±2 ℃时，将三角瓶放入烧杯中，磁力搅拌皂化约30 min 后，取出立刻冷却到室温。

5.3.1.2添加β-胡萝卜素的试样:95%乙醇加入到添加β-胡萝卜素的试样溶液中，混匀并加入25 mL 氢氧化钾溶液，放入磁力棒，充入氮气排出空气，盖上胶塞。

将1000 mL 的烧杯中加入约300 mL 的水，将烧杯放在恒温磁力搅拌器上，当水温控制在53 ℃±2 ℃时，将三角瓶放入烧杯中，磁力搅拌皂化约30 min 后，取出立刻冷却到室温。

5.3.2 萃取：
将皂化液全部转入500 mL 分液漏斗中，加入100 mL 石油醚，轻轻摇动，排气，盖好瓶塞，室温下振荡10 min 后静置分层，将水相转入另一分液漏斗中按上述方法进行第二次提取。

合并有机相，用水洗至近中性。

有机相通过无水硫酸钠过滤脱水。

滤液收入500 mL 烧瓶中，于旋转蒸发器上在40 ℃±2 ℃的充氮条件下蒸至近干（绝不允许蒸干），用氮气吹干，立即加入石油醚溶解残渣并转移至10 mL 容量瓶中定容。

从上述容量瓶中准确移取2.0 mL石油醚溶液于10 mL螺盖试管中，在40 ℃±2 ℃氮吹仪上吹干。

向试管中加2.0 mL正己烷，振荡溶解残渣，经0.45 μm膜过滤后备用。

注：实验操作过程中应注意避光。

5.4色谱测定
5.4.1参考色谱条件
5.4.1.1 无添加β-胡萝卜素的试样
色谱柱：C30柱，150mm×4.6 mm，5 μm，或具同等性能的色谱柱。

流动相：A相：甲醇：乙腈=75:25（含2% H2O）
B相：甲基叔丁基醚
表1 梯度程序
流速：1.0 mL/min 。

检测波长：450 nm 。

柱温：30 ℃±1 ℃。

进样体积：20 μL 。

5.4.1.2 添加β-胡萝卜素的试样
色谱柱：C 18柱，250 mm ×4.6 mm ，5 μm ，或具同等性能的色谱柱。

流动相：三氯甲烷：乙腈：甲醇=3：12：85，将1 L 的流动相中加入0.4 g 的抗坏血酸，经0.45 μm 膜过滤后备用。

流速：2.0 mL/min 。

检测波长：450 nm 。

柱温：35 ℃±1 ℃。

进样体积：20 μL 。

5.4.2 标准曲线的绘制
5.4.2.1 无添加β-胡萝卜素的试样
分别将α-胡萝卜素和β-胡萝卜素混合标准工作液注入液相色谱仪中（色谱图参见附录B.1），得到α-胡萝卜素和β-胡萝卜素的峰面积。

分别以峰面积为纵坐标，以浓度为横坐标绘制标准曲线。

5.4.2.2 添加β-胡萝卜素的试样
分别将β-胡萝卜素标准工作液注入液相色谱仪中（色谱图参见附录B.2），得到峰面积。

以峰面积为纵坐标，以β-胡萝卜素标准工作液浓度为横坐标绘制标准曲线。

5.4.3 试样测定
将待测液注入液相色谱仪中，得到峰面积，根据标准曲线得到待测液中β-胡萝卜素和α-胡萝卜素的浓度。

6
分析结果的表述
6.1 无添加β-胡萝卜素的试样中β-胡萝卜素的含量按式（1）计算
10100
10100
/1002
X g g m
m βαρρ⨯⨯⨯⨯+
⨯（）=
(1)
式中：
X ——试样中β-胡萝卜素的含量，单位为微克每百克（μg/100g ）；
ρβ——从混合标准曲线得到待测液中β-胡萝卜素的浓度，单位为微克每毫升（μg/mL ）； ρα——从混合标准曲线得到待测液中α-胡萝卜素的浓度，单位为微克每毫升（μg/mL ）； m ——试样的质量，单位为克（g ）； 100——将结果表示为百分含量的系数； 10——样液定容体积；
2 ——α-胡萝卜素转化为β-胡萝卜素的换算系数。

以重复性条件下获得的两次独立测定结果的算术平均值表示，结果保留三位有效数字。

6.2 添加β-胡萝卜素的试样中β-胡萝卜素的含量按式（2）计算。