大肠杆菌的λ-噬菌体

基因工程实验中使用的受体是具有琥珀型突变
体校正功能的菌株。
4、加装选择标记
野生型λ-DNA上缺少合适的选择标记，因此加 装选择标记是λ-DNA克隆载体构建的重要内容。
选择标记主要有两类： 免疫功能类标记 颜色反应类标记
(1)免疫功能失活标记 (cI筛选)
加装选择标记cI基因 cI基因编码一种阻止λ-噬菌体进 入溶菌循环的阻遏物。 含有完整标记基因的λ-载体进入 受体细胞后，建立溶源状态，细 菌生长缓慢，形成混浊斑；
cI基因：编码阻遏蛋白，是感染了λ噬菌体的寄主细胞进 入溶源化的必要条件。cI基因失活或缺失的λ噬菌体无法 使寄主细胞发生溶源化效应。
DNA重组技术一般需要噬菌体处于溶源状态。
λ噬菌体DNA的整合与删除：
噬菌体基因组可以整合到大肠杆菌染色体DNA上， 成为原噬菌体。 适当条件下，原噬菌体又可以脱离寄主染色体， 重新变成独立的复制子，这种过程叫做ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ噬菌体 的删除作用。 超感染免疫性 溶源性细菌，由于含有原噬菌体，故不能再 次被同种噬菌体感染。溶源性细菌所具有的这种 抗御同种噬菌体再感染的特性叫做超感染免疫性。
•当外源DNA插入到标记基因中， 基因灭活， λ-重组分子便进入 溶菌循环，形成透明斑。
(2)加装选择标记lacZ（蓝白斑筛选）
lacZ基因编码β-半乳
糖苷酶，能催化无色的
X-gal生成蓝色化合物。 当外源基因插入到lacZ 基因中，基因灭活，不能 合成蓝色化合物；
而空载体λ-DNA则产
插入可供选择的标记基因；
建立体外包装系统。
1、缩短长度 野生型:上限51kb λ-DNA：48.5kb，外源基因2.5kb λ-DNA上有40-50%的DNA是复制，裂解所不必需的， 切除便提高装载量。
根据切除的多少，将λ-DNA分为两大类载体： 插入型载体、取代型载体
插入型载体（insertion vector）
（1）功能相近的基因在基因组中聚集在一起 目前已经被确定的基因至少61种，一半为必需 基因
（2）线状双链DNA，两端各有一个12bp的互补单链 （粘性末端，cohesive-end site），称λcos site ，粘性末端粘连接变成环状DNA。
λcos位点是噬菌体包装必需序列。
48.5kb
λ噬菌体基因大致分为3个区：
第一节
克隆载体
1. 质粒载体（plasimid vectors）
2. 噬菌体载体（phage vectors）
3. 柯斯质粒载体（cosmid vectors）
4. 人工染色体载体（B/Y/HAC）
噬菌体简介
Bacteriophage(phage) 是比细菌还小得多的微 生物，噬菌体侵犯细菌，可 以认为它是细菌里的“寄生 虫”。 组成：蛋白质、核酸. 结构：蛋白质外壳、尾巴
噬 菌 体 的 溶 源 和 裂 解
入侵E.coli后，可以按裂解或建立溶原两种生活方式生存和繁殖。 侵犯细菌时，只是DNA侵入，然后利用细菌的酶来复制、转录、翻译。
λ-DNA载体的构建
λ噬菌体的缺陷： • 基因组太大（48.5kb）；
• 酶切点太多，它有5个BamH1位点（G↓GATCC），6个 BgⅠ位点（A↓GATCT），5个EcoRⅠ位点 （G↓AATTC）。
• 野生型只能接纳一定长度的DNA。若相当于λ噬菌体 的75-105%，那么只能接纳48.5kb×5%=2.425kb的 DNA。 • 重组的λDNA分子难于直接导入宿主细胞—利用体外 包装成病毒颗粒，然后通过感染的方法注入DNA。
构建λ噬菌体克隆载体的基本策略：
切去部分非必须的区域；
抹去多余的限制性内切酶切割位点；
尾巴上的微丝可以把噬菌 体的DNA注入细菌内。
噬菌体或病毒的DNA能被开发
成为基因工程的有用载体，因为：
1.高效率的感染性能使外源基
因高效导入受体细胞；
2.自主复制繁殖性能使外源基
因在受体细胞中高效扩增。
大肠杆菌的λ-噬菌体
（一） λ-噬菌体的生物学特性 1、由外壳包装蛋白和λ-DNA组成 2、 λ-DNA的物理图谱
必须携带标记基因
经改造后只具有一个可供外源DNA插入的克隆位点,长度 为37kb，为包装的下限，它本身也能被包装，允许插入 片段最大为14kb.
取代型载体（substitution vector）
具有成对的克隆位点,空载的载体DNA只26kb，不能被包 装，无法进入受体细胞中去,不需要标记基因.
应用：
•结构区：A～ J19个基因，编码头、 尾部蛋白质 •非必须区： 非必须，基因重组int（intagrate） 及xis（excision）
•功能区：裂解相关S和R，复制相关O和P
3、感染周期（溶菌循环）
•λDNA复制早期：一个ori ，双向复制 •晚期：滚环复制--多个λDNA分子形成线状多联体
包装
E
头部包装蛋白首先结合在cos区的附近，形成包 装启动复合物，A蛋白切割cos位点。
4、溶源状态的建立
噬菌体感染大肠杆菌后，DNA直接整合到宿 主细胞染色体DNA上，并不裂解细胞，这种情况 称为溶源状态。
整合主要由cI和int基因的产物所激活，这两个基因的开放
与关闭取决于宿主细胞本身的性质。
插入型载体只能承受较小分子量（一般在
10kb以内）的外源DNA片段的插入，广泛 应用于cDNA及小片段DNA的克隆。
替换型载体可承受较大分子量的外源
DNA片段的插入，所以适用于克隆高等 真核生物的染色体DNA。
2、酶切位点的删除或增加 删除重复的酶切位点:野生型λDNA链上有
5个EcoRI位点和7个HindIII位点，不利于重
组操作，必须删除至1-2个.
为了便于各种来源的DNA片段的克隆，还
需要增加一些单一的酶切位点.
采用定点突变技术或甲基化酶处理必 需区内的酶识别序列使其失活。
3、灭活某些与裂解周期有关的基因
将无义突变引入噬菌体裂解周期所需的基因， 如将头部包装蛋白基因的CAG突变成UAG。这些 噬菌体只能在具有特异校正基因编码产物的菌株内 繁殖。 当这种λDNA进入一般大肠杆菌菌株后，不能合 成有活性的头部蛋白，也就不能被包装和裂解细 菌，可阻止有害重组体的生物污染及扩散。