BCIP、NBT底物显色试剂盒使用说明

碱性磷酸酶显色剂使用方法

5-Bromo-4-Chloro-3-Indolyl Phosphate (5-溴-4-氯-3-吲哚基-磷酸盐), BCIP/NBT （四唑硝基蓝）是碱性磷酸酶底物, 产物为深蓝色, 在碱性磷酸酯酶的催化下，BCIP被水解, 水解产物与NBT发生反应，形成不溶性的深蓝色至蓝紫色的NBT-formazan。

使用方法1. 在膜或组织切片，最后一次洗涤完毕后，加入适量BCIP/NBT染色工作液2. 室温避光孵育5-30分钟或更长时间(可长达24小时)，直至显色至预期深度.3. 用蒸馏水洗涤1-2次即可终止显色反应4. 膜标本可干燥后避光保存；组织切片或细胞样品，显色反应终止后，可以用中性红复染染色干细胞成骨诱导的常用染色方法有几种碱性磷酸酶（ALP）是成熟成骨细胞的标志性酶，同时成骨细胞形成的钙结节也是成骨细胞的标记物。

成骨细胞染色方法以ALP为目标物的检测方法：1 Gomori钙钴法【染色原理】ALP在pH值9.4的环境下，以镁离子作为激活剂，能够把β-甘油磷酸钠水解出磷酸，磷酸与高浓度的钙盐结合形成无色的磷酸钙，再与硝酸钴作用形成磷酸钴，经硫化胺处理形成黑色的硫化钴沉淀在酶活性处。

【孵育液配制】3%β-甘油磷酸钠5ml2%巴比妥钠5ml蒸馏水10ml2% CaCl2 10ml2% MgSO4 1ml【步骤】（1）将无菌的玻片放入培养皿中，传代时加入适量的细胞悬液，作细胞爬片，呆细胞长满玻片后取出。

（2）PBS冲洗后用冷丙醇固定10min，蒸馏水冲洗数次。

（3）入孵育液中，37℃孵育4-6h。

自来水冲洗数次。

（4）2%硝酸钴中浸3-5min，蒸馏水洗数次。

（5）1%的硫化铵中2min，自来水冲洗，自然干燥，封固。

【结果】胞质中阳性反应呈现灰黑色颗粒或块状沉淀。

2偶氮偶联法：【孵育液配制】萘酚AS-BI磷酸盐20mgDMSO 0.5ml0.2mol/L巴比妥醋酸缓冲液（PH 9.2）50ml六偶氮副品红0.5ml1mol/L NaOH调PH 9-10，混合后过滤使用。

NBT-BCIP 问题

Nitroblue tetrazolium, or NBT, is a chemical used in biochemistry and immunology in the detection of an enzyme called alkaline phosphatase. Scientists also use the compound to diagnosis conditions of the immunodefense system, such as chronic granulomatous disease. BCIP stands for 5-Bromo-4-chloro-3-indolyl phosphate. This chemical compound is often used in conjunction with NBT to detect alkaline phosphatase through a series of protocols.BCIP/NBT Alkaline Phosphatase Substrate SolutionDuring this protocol, scientists prepare a solution with BCIP, NBT, levamisole and the enzyme alkaline phosphatase buffer at pH 9.5. AP buffer contains tris(hydroxymethyl)aminomethane, magnesium chloride, the polysorbate detergent Tween 20 and sodium chloride. The solution is incubated at room temperature for 24 hours and is then available to use.Detection of mRNA with Alkaline PhosphataseDetection of mRNA with alkaline phosphatase is a protocol used to study the nucleic acids mRNA and DNA in animal embryos. During this procedure, BCIP/NBT is used as a substrate for the enzyme alkaline phosphatase. BCIP/NBT is added to the embryos after they are rinsed twice in alkaline phosphatase staining buffer. Nucleic acid sites appear in purple.Electrophoresis and Western BlottingDuring this protocol, technicians separate and identify the components of proteins using electrophoresis gel apparatus and a technique called Western blotting, which requires the use of a piece of equipment containing a nitrocellulose membrane and specific antibodies. After standard electrophoresis, technicians perform the Western blotting protocol, incubating the membranes for 30 minutes in a buffer solution and at room temperature. The antibody p47-phox is added and incubated for one hour. Conjugated alkaline phosphatase antibody is added, and after one hour, also BCIP/NBT. The reaction is stopped after 15 minutes of incubation by rinsing the membrane with water.Isolation and Differentiation of Medaka CellsMedaka is a small fish that produces eggs daily and is widely used in embryonic stem cell research. According to Kursad Turksen in "Embryonic Stem Cell Protocols: Isolation and Characterization," Medaka eggs are incubated in embryo medium at 78.8 degrees Fahrenheit for seven days. Embryos are then washed in phosphate buffered saline solution, fixed in a methanol-acetone mix and stained with BCIP/NBT. Samples are then kept in the dark for 24 hours at 82.4 degrees Fahrenheit. The cells chromosomes are then observed under a microscope.References1.IHC World: BCIP/NBT Alkaline Phosphatase Substrate Solutio Protocol2.SpringerLink: Two-Color Detection of mRNA Transcript Localizations in Fish and Fly EmbryosUsing Alkaline Phosphatase and b-Galactosidase Conjugated Antibodies3."Neutrophil Methods and Protocols"; Mark T. Quinn; 20074."Embryonic Stem Cell Protocols: Isolation and Characterization"; Kursad Turksen; 2006Promega产品名称目录号数量规格浓度价格(元)BCIP/NBTColorS3771 1 1.25/2.5ml 623 DevelopmentSubstrate说明BCIP (5 - 溴- 4 - 氯- 3 - 吲哚- 磷酸) 与NBT ( 四唑硝基蓝)合用，可用于碱性磷酸酶活性的比色法检测。

预混型BCIP、NBT溶液

预混型BCIP/NBT溶液Premixed BCIP/NBT Solution华越洋----------------------------------------------介绍：华越洋预混型BCIP/NBT溶液是在BCIP/NBT底物显色试剂盒的基础改良而得的。

特点：含有BCIP和NBT两种成分的混合液，不需混合和稀释，直接使用，十分方便。

在碱性磷酸酶存在时形成暗紫色沉淀，具有和其他AP底物（包括分开提供的BCIP/NBT溶液）一样的灵敏度。

稳定，使用精心优化的溶剂，在低温条件下可以保存一年。

可用于Western Blot。

运输及保存常温运输和保存（避光），有效期一年。

自备试剂Western印迹膜洗膜液或TBST缓冲液。

使用方法按常规方法进行Western印迹膜杂交，直到跟二抗-AP复合物保温这步结束。

用Western印迹膜洗膜液洗印迹膜5次，每次至少1分钟。

注意：可以用TBST缓冲液代替Western印迹膜洗膜液。

用水迅速冲洗一次。

将印迹膜转移到本产品中（每cm2印迹膜需要0.1mL 本产品），室温平缓摇晃5-30分钟显色。

37℃可加速反应。

细心观察蛋白条带的颜色变化，显色到满意程度后（一般需要20分钟，具体跟蛋白浓度密切相关）迅速将印迹膜转移到盛有超纯水的托盘中摇晃，终止显色反应。

数分钟后需要换水，共三次。

用吸水纸吸干膜上的水分，照相或扫描处理后避光干燥保存印迹膜。

BCIP/NBT反应原理BCIPNBTBCIP被碱性磷酸酶水解后形成一个中间体。

这个中间体被异构化以后的产物与NBT 反应生成白色的中间体二聚体和NBT-蓝紫色结晶物。

深圳依诺金生物地高辛杂交检测试剂盒 I 产品说明书

深圳依诺金生物科技有限公司 - 1 - 产品说明书地高辛杂交检测试剂盒 I目录号: DIGD-110装量: 10次显色检测反应保存期: 12个月.存储条件:NBT/BCIP显色底物–20℃抗DIG-AP酶结合物4℃其它组分室温试剂盒组成:阻断液母液(10x) 50 ml抗DIG-AP 酶结合物20 µl NBT/BCIP显色底物 2 ml检测缓冲液(5×) 50 ml顺丁烯二酸缓冲液母液(2x) 500 ml Tween-20 3 ml 10% SDS 20 ml 20×SSC 100 ml使用前先用DEPC/无RNase水将5×检测缓冲液及2×顺丁烯二酸缓冲液母液稀释成1×工作液.一.预杂交:1. 将膜从包装袋中取出，用干净的剪刀将膜溴酚蓝以下的部分剪去。

放入杂交袋中，在封口机上将杂交袋三面封口。

2. 加入65℃预热的Hyb高效杂交液5mL，排尽气泡，封口。

放65℃水浴振荡杂交1～2小时。

3. 如果使用杂交管杂交，则根据杂交管体积，加入适量的杂交液(5-10ml)。

如果膜的大小适中，也可以用无菌的50ml离心管(BD公司)进行，5ml杂交液已足够。

将杂交仪设定为65℃，8-15转/分钟预杂交1～2小时。

二.杂交:1. 探针的处理：将标记好的探针放100℃煮10分钟，立即放冰浴冷却10分钟。

2. 将杂交袋从水浴中取出，剪去一角并尽可能的排尽袋中的预杂交液，取5mLHyb高效杂交液，加入变性的探针(1-3µl/膜，5－20ng/mL Hyb杂交液)，混匀。

加入到杂交袋中，小心排尽气泡，封口，65℃水浴振荡杂交过夜。

3. 如果使用杂交管杂交，则倒出预杂交液，另取适量的Hyb高效杂交液(5-10ml)，加入变性过的探针(1-3µl/膜，或5－20ng/ml Hyb高效杂交液)，混匀。

加入到杂交管中，杂交仪设定为65℃，8-15转/分钟，杂交过夜。

BCIP、NBT底物显色试剂盒使用说明

BCIP、NBT底物显色试剂盒使用说明货号：PR1100规格：25ml/125ml保存：-20℃避光保存，复检期至少半年。

产品内容：25ml125ml25×BCIP1ml5ml25×NBT1ml5ml1×AP反应缓冲液30ml75ml×2产品简介：NBT即氯化硝基四氮唑兰(Nitroblue tetrazolium chloride)，为深蓝色无定形微溶物质。

BCIP即5-溴-4-氯-3-吲哚基-磷酸盐(5-Bromo-4-Chloro-3-Indolyl Phosphate),在碱性磷酸酶（Alkaline phosphatase,AP）的催化作用下，BCIP会被水解产生强反应性的产物，该产物会和NBT发生反应，形成不溶性的深蓝色至蓝紫色的沉淀。

使用说明：1.取40ul25×NBT加入到1ml1×AP反应缓冲液中，混匀后，再加入40ul25×BCIP混匀，即配成反应工作液，此反应液最好现配现用。

注意：根据膜的大小，1×AP反应缓冲液、25×BCIP、25×NBT的量可以等比例扩大。

2.把经洗涤的PVDF/NC膜浸入反应工作液中，于室温平缓摇动进行温育。

3.当蛋白带的颜色深度达到要求（一般约20-30分钟）时，把膜浸入去离子水中停止反应。

注意事项：BCIP、NBT为可疑致癌物，请采取必要的防范措施。

操作时应戴手套，尽量避免与皮肤接触，用后及时彻底冲洗。

相关试剂：A1800抗体稀释液（普通型）A1830AP标记抗体稀释液SA0012SABC(小鼠IgG)-AP kit。

碱性磷酸酶底物显色试剂盒

⒉ 取 1ml AP reaction Buffer 中加 10μl NBT 溶液和 10μl BCIP 溶液，混匀。
注意：根据膜的大小，AP Buffer、NBT、 BCIP 的量等比例混合物中，于室温平缓摇动进行温育。
⒋ 细心观察反应过程，待蛋白膜上条带呈色明显，而无明显背景时(一般约 5-15 分钟)，把膜浸入水中漂洗停止反应。
注意：若信号太弱可增加反应时间。
⒌ 拍摄膜照片或直接保存膜留作永久试验纪录。
碱性磷酸酶底物显色试剂盒(BCIP/NBT)
目录号： 1925
目录编号 192501
包装单位 100ml
实验室使用，仅用于体外
产品介绍：
BCIP/NBT 是碱性磷酸酶（ Alkaline phosphatase ,AP）的显色底物，经免疫反应固定的碱性磷酸酸酶可催化 BCIP/NBT 产生化学呈色反应，在蛋白转印膜阳性蛋白条带处原位形成蓝紫色的化合物沉淀。
注意：若信号太弱可增加反应时间。
⒌ 拍摄膜照片或直接保存膜留作永久试验纪录。
产品组成、储存、稳定性：
试剂盒组成 AP reaction buffer NBT stock
BCIP stock
保存
室温或者 4℃ －20℃ 避光－20℃ 避光
192501 100 ml 1 ml 1 ml
常温运输，本产品收到后按照上面指示温度存放，6 个月内有效。
操作方法：
⒈ 按常规操作，将蛋白样品进行 SDS-PAGE 电泳，转膜（硝酸纤维素膜和 PVDF 膜均可使用）。封闭 30~120 min，一抗孵育 1 小时或过夜；漂洗 3~5 次，碱性磷酸酶标记二抗孵育 30~120 min，漂洗 3~5 次。如上述步骤采用磷酸缓冲液，需换用 Tris 缓冲液漂洗 3~5 次以完全去除磷酸成分对于 AP 抑制作用。

“敏筛”说明书

Instruction manual (说明书)：AllergyScreen过敏原检测试剂盒1.用途AllergyScreen过敏原定量检测系统采用免疫印迹方法，定量检测人血清中过敏原特异性IgE抗体。

2.概述IgE免疫球蛋白发现始于1964年，它在I型变态反应发生机制中起重要作用。

免疫应答时B淋巴细胞分化成熟为浆细胞，并合成和分泌不同类型的抗体。

该过程由Th和Ts细胞调节，如果调节失控，通常不会造成损害的抗原也能激发免疫应答，刺激抗原特异性B细胞分化成熟为浆细胞，并产生IgE抗体, IgE抗体通过Fc段同嗜碱性粒细胞和肥大细胞表面Fc受体结合。

当同一变应原再次进入机体，直接作用于IgE，并通过它的决定簇与IgE分子Fab段间的结合，形成IgE 受体聚集成片,这些变化最终导致嗜碱性粒细胞和肥大细胞脱颗粒释放组胺等生物活性物质，从而产生如麻疹`荨麻疹、皮炎、关节炎，枯草热（过敏性鼻炎）`哮喘及过敏性休克等典型的I型变态反应症状。

3.检测原理特异性过敏原被吸附于硝酸纤维素膜表面，置于反应槽中。

用移液器加入病人血清，室温下孵育，标本中过敏原特异性的IgE抗体与过敏原发生反应，并连接在硝酸纤维素膜上。

将多余的抗体冲洗脱掉，再加入标记了生物素的抗人IgE 抗体，室温下孵育，冲脱未结合上的抗抗体。

然后加入结合有碱性磷酸酶标记的链霉亲和素，室温下孵育，链霉亲和素和生物素结合。

将未结合上的酶标链霉亲和素冲洗干净。

当再加入BCIP/NBT酶作用底物并孵育后，碱性磷酸酶发生特定的酶显色反应，试剂条上出现沉淀。

颜色深浅与血清中sIgE抗体含量成正比。

待试剂条干燥后，CCD相机照相，读取检测结果。

4.检测系统组成每套检测系统包括：1×12 检测条：标记有20种过敏原的硝酸纤维素膜，置于塑料反应槽中（混合过敏原组，吸入组，食物组）1×洗脱液：（TRIS/NaCl，包含0.1%NaN3）可稀释成1x500ml 的清洗液，pH=7.5 （20ml）1×标记有生物素的抗人IgE抗体（白盖，多抗），含 0.1%NaN3 1×酶标链霉亲和素（红盖），连接有碱性磷酸酶的链霉亲和素1×底物（蓝盖），BCIP/NBT12×加样吸管（300微升）1×使用说明书5.未提供的实验所需的其他工具5.1稀释液蒸馏水或去离子水5.2 其他搅拌器；量筒（500毫升），500毫升洗瓶，具10个不同板型的洗板机（也可无），避光的孵育箱（具体要求见MEDIWISS说明书）；水平混匀器；电吹风（也可无）；专用阅读仪（RAPID READER）和电脑（Windows98，Windows2000 ME或Windows2000 PROF 带USB接口）及打印机。

酶联免疫斑点法的操作方法

酶联免疫斑点法的操作方法酶联免疫斑点法是一种广泛应用于免疫学和生物化学领域的分析技术，用于检测和定量分析抗原-抗体相互作用。

下面将详细介绍酶联免疫斑点法的操作方法。

一、实验材料与试剂准备1. 试剂- 抗原：根据实验需要准备相应的抗原。

- 抗体：根据实验需要选择合适的抗体，可以是多克隆抗体也可以是单克隆抗体。

- 酶标记的二抗：选择适当的酶标记二抗，如HRP、碱性磷酸酶等。

- 底物：根据所选择的酶标记物选择相应的底物。

- 缓冲液：根据实验需要选择相应的缓冲液，如PBS、TBST等。

- 洗涤液：常用的洗涤液为PBS或TBST。

- 显色底物：根据所选择的酶标记物选择相应的显色底物，如TMB、BCIP/NBT 等。

2. 实验仪器- 酶标仪：用于测定底物酶解的吸光度或荧光值。

- 扫描仪：用于获得斑点形成的图像。

二、实验步骤1. 制备实验板- 选择合适的固相载体，如微孔板、膜、条或片等。

- 洗涤载体：根据选择的载体类型使用洗涤液充分洗涤载体，通常为3-4次洗涤。

- 固定抗原：将抗原溶液加入载体孔中，进行固定，通常需要孵育一段时间，如1-2小时。

- 停止固定反应：洗涤载体，用洗涤液洗涤3-4次。

2. 孔位的处理- 阻断孔位：加入阻断液阻断非特异性吸附，如BSA、Bovine serum albumin 等。

- 洗涤液洗涤孔位：用洗涤液洗涤3-4次。

3. 添加抗体和酶标记二抗- 加入抗体：添加适当稀释的抗体溶液到孔位中，孵育一段适当的时间，如1-2小时。

- 洗涤液洗涤孔位：用洗涤液洗涤孔位，洗涤3-4次。

- 加入酶标记二抗：添加适当稀释的酶标记二抗溶液到孔位中，孵育适当的时间，如1-2小时。

- 洗涤液洗涤孔位：用洗涤液洗涤孔位3-4次。

4. 显色和停止反应- 加入显色底物：加入适当的显色底物，添加适当的底物溶液，使酶解产生可见的色斑或显色反应。

- 停止反应：根据所使用的显色底物的不同，选择适当的反应停止液。

5. 结果读取与分析- 读取结果：将实验板放入酶标仪测定吸光度或荧光值，记录下各孔位的数值。

BCIP NBT碱性磷酸酶显色试剂盒

仅供科研使用版本号：180718BCIP/NBT碱性磷酸酶显色试剂盒【产品组成】【保存条件】4℃,避光,12个月。

【产品概述】BCIP/NBT碱性磷酸酯酶显色试剂盒(BCIP/NBT Alkaline Phosphatase Color Development Kit)是一种用于免疫组化显色、Western等膜显色和诱导多功能干细胞iPS鉴定等的试剂盒。

BCIP/NBT是碱性磷酸酯酶的常用底物，在碱性磷酸酯酶的催化下，BCIP会被水解产生强反应性的产物，该产物会和NBT发生反应，形成不溶性的深蓝色至蓝紫色的NBT-formazan。

BCIP/NBT Alkaline Phosphatase Color Development Kit可用于细胞或组织的碱性磷酸酯酶显色包括诱导多功能干细胞iPS的鉴定，也可用于Western等结合有碱性磷酸酯酶的膜的显色检测\细胞或组织内源性的碱性磷酸酯酶显色。

【使用方法】1、对于组织切片或细胞样品或膜，在与碱性磷酸酯酶标记的抗体或其它形式的探针孵育后，用适当洗涤液洗涤3～5次，每次3～5min。

2、对于检测内源性碱性磷酸酯酶的组织或细胞样品，在适当固定后，也用适当洗涤液洗涤3～5次，每次3～5min。

3、按照如下比例依次加入各溶液，混匀后即配制成BCIP/NBT染色工作液：4、洗涤完毕后，去除洗涤液。

5、加入适量BCIP/NBT染色工作液，确保能充分覆盖样品。

5、室温避光孵育5～30min或更长时间(可长达24小时)，直至显色至预期深浅。

6、去除BCIP/NBT染色工作液，用蒸馏水洗涤1～2次即可终止显色反应。

7、对于组织切片或细胞样品，显色反应终止后，如有必要可以用中性红染色液(neutral red stainingsolution)染色，以便于观察。

对于膜，显色反应终止后，可以室温晾干避光保存。

【注意事项】1、BCIP对人体有刺激性，NBT对人体有害，请注意适当防护。

PH0405 BCIP-NBT即用型显色试剂盒实验操作手册

PH0405|BCIP/NBT即用型显色试剂盒Ready-to-use BCIP/NBT Solution,PremixedCatalog No：PH0405Size：☐100mL Store at2~8℃简介BCIP(5-Bromo-4-chloro-3-indolyl phosphate)5-溴-4-氯-3-吲哚基-磷酸盐＋NBT(四唑硝基蓝)是碱性磷酸酶（AP）最佳的底物组合之一。

在碱性磷酸酶的催化下，BCIP会被水解而产生强反应性的产物，该产物与NBT发生反应，形成不溶性的深蓝色至蓝紫色化合物。

该试剂盒可用于AP系统的IHC和Western Blot实验的酶促显色。

在AP催化下，在组织切片或印迹膜上结合了AP偶联物的地方产生深蓝色沉淀，可根据颜色反应来确定目的蛋白的位置及表达情况。

本染色液为即用型工作液，可以直接使用，不用稀释。

使用参考1.印迹膜显色：将本品滴加在待检测的印迹膜上（或将印迹膜浸入到BCIP/NBT显色液中），室温避光孵育10-20分钟。

显色完毕后，将膜浸入水中，终止反应。

注：印迹膜显色前要用1×TBST漂洗3次，每次10分钟。

不要用1×PBST漂洗，因为无机磷是AP的强烈抑制剂。

2.组织切片或细胞爬片显色：滴加适量的BCIP/NBT显色液于需要显色的组织切片或细胞爬片上，室温避光孵育10-20分钟。

显微镜下观察控制显色时间，当达到最佳显色效果后，自来水冲洗终止显色。

显色后的切片经复染、脱水透明，封片后可长期保存。

注意事项1）BCIP对人体有刺激性，NBT对人体有害，请注意适当防护。

2）为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。

地高辛中文操作说明

所用试剂盒为Roche公司的DIG High Prime DNA Labeling and Detection Starter Kit I，具体操作过程如下：①向一个反应管中加入1μg 模板DNA（线性或超螺旋）和高压灭菌的双蒸水，终体积达16μL；②沸水浴10min以变性DNA，然后迅速插入冰水混合物中；注意：完全变性对于标记的有效性是十分重要的。

③充分混合DIG-High Prime(1号管)，并取4μL加入到变性DNA中，混合并简单离心；④37℃孵育，过夜；⑤65℃加热10min，终止反应。

2）探针的纯化与回收用PCR产物快速回收试剂盒（上海生工）回收标记好的探针，同时除去随机引物和未掺入的DIG-dUTP。

具体操作步骤如下所示：①在PCR反应液中加入5倍体积的Buffer B3，充分混匀；②8,000×g离心30秒。

倒掉收集管中液体；③加入500μl Wash Solution，9,000 ×g 离心30秒，倒掉收集管中液体；④重复步骤4一次；⑤空柱于9,000 ×g离心1分钟；⑥将吸附柱放入一个干净的 1.5 ml离心管中，在吸附膜中央加入15-40μl Elution Buffe r，室温静置1分钟后，离心1分钟。

保存管中DNA溶液。

⑦电泳检测探针的完整性，紫外分光光度法测定探针浓度，稀释到1 ng/μL 。

注：标记好的探针最好立即使用，最长使用时间一般不宜超过3天。

标记好的探针可以保存在-20℃。

3）检测探针标记的效率直接标记法：将地高辛标记DNA的一系列稀释梯度点到一小块带正电荷的尼龙膜上。

尼龙膜部分区域已经点好一系列稀释梯度的地高辛标记的对照DNA（2号管）作为标准。

具体操作步骤：（注意在全部的步骤中，用足够的缓冲液体积完全覆盖膜）①分别从你标记的探针和标记对照DNA的2-9号管中取出1 μL点在尼龙膜上；②通过120℃烘烤30min的方法将核酸固定在膜上；③将膜转移到一个装有20mL 马来酸缓冲液的塑料容器中，在15-25℃中振荡孵育2min；④在10mL 封阻液中孵育30min；⑤在10mL 抗体溶液中孵育30min；⑥用10mL洗涤缓冲液洗涤两次，每次15min；⑦在10mL检测缓冲液中平衡2-5min；⑧将膜上带有DNA的一面朝上，放在一个折叠夹上（或者杂交袋），向膜上加入2mL的新鲜配制的的底物显色液，均匀的铺平底物，且膜上不能有气泡。

原位杂交实验操作步骤

原位杂交实验操作步骤撰写人：范为民一、实验原理原位杂交是指借助于核酸分子杂交的方法，在显微镜水平检测和定位特异的核苷酸片段。

现在原位杂交已经成为在分子水平研究肿瘤和遗传性疾病的发生，发展和调控等根本性问题的有力工具。

二、试剂盒本实验室常用的原位杂交试剂盒是博士德公司生产的敏感加强型原位杂交检测试剂盒，此试剂盒分为两种，一种为过氧化物酶（POD）检测（MK1030型），一种为碱性磷酸酶(AP)检测系统（MK1032型），用于mRNA的杂交。

过氧化物酶（POD）检测的最终信号为棕黄色，而碱性磷酸酶(AP)检测的信号为紫色，因后者信号比较突出，所以一般采用后一种检测方法。

两种检测方法的实验步骤相差不多，所用洗脱缓冲液也大同小异。

用于杂交的探针也可以分为两种，一种是DNA探针，即是用DNA与组织中的mRNA杂交，另一种是RNA 探针，即用RNA与组织中的mRNA杂交。

DNA探针处理操作简单，但杂交信号一般不如RNA探针强烈，所以条件允许的话一般采用RNA探针。

下面先介绍碱性磷酸酶(AP)检测试剂盒，采用RNA作为探针的操作步骤。

三、实验步骤原位杂交实验主要包括三大部分，即组织冰冻切片、RNA探针标记、原位杂交三部分。

（一）组织冰冻切片1. 实验准备（1）原位杂交专用载玻片：用多聚赖氨酸处理后的载玻片，使切片紧密粘附在玻片上，可以用于后面的洗脱。

一般一张载玻片上可以贴至多十张切片（可以是不同组织的切片），所以需要玻片的数目需要根据实验的要求而定。

这种专用载玻片可以从中杉金桥公司购买，目前价格是每片2.2元，玻片有一面的一端是毛玻璃，用于标记组织名称等，切片应该贴在此面，切勿贴到反面。

（2）缓冲液配备1.1器具准备剪刀、镊子各三把，开壳钳一把，100ml量筒一个，磁力搅拌子一个；100ml试剂瓶一个，250ml试剂瓶三个。

以上器具均洗净后置于180摄氏度以上烘烤6小时以上。

铅笔、显微镜、冰、吸水纸、一次性塑料手套等。

地高辛标记及检测试剂盒说明书

仅仅研究于生命科学，不适合在诊断过程使用只能在体外使用地高辛DNA标记和检测试剂盒1和NBT/BCIP一起用于颜色检测通过酶联免疫法采用地高辛-dUTP进行随机引物DNA标记，碱性标记和检测货号：11 745 832 910此试剂盒储存条件-15o C—-25o C此试剂盒可对10ng-3ugDNA进行12次标记反应可检测100cm2面积的杂交膜24张指导手册2009.11版1前言1.1内容表1前言 (2)1.1内容表 (2)1.2试剂盒内容 (3)2简介 (5)2.1产品概述 (5)3步骤和所需材料 (8)3.1开始之前 (8)3.2地高辛DNA标记 (9)3.3 标记效率的测定 (11)3.4 DNA 的转移和固定 (14)3.5杂交 (16)3.6免疫检测 (18)3.7 DNA印记的洗脱和再杂交 (20)4结果 (21)4.1典型的结果 (21)5附录 (23)5.1故障排除 (23)5.2引用 (24)5.3订购信息 (25)1.2 试剂盒内容附加仪器与所需试剂除了上表中列出的试剂外，你必须准备一些溶液。

在下表中，你可以找到不同操作程序需要准备的设备概要。

*标记的产品可以从Roche Applied Science 获得2 介绍2.1 产品概况实验原则此试剂盒采用地高辛（DIG），一种甾类半抗原，去标记DNA探针从而通过酶免疫分析应用地高辛标记DNA探针可以用于：所有类型的滤膜杂交总基因组DNA中单拷贝基因的检测，甚至对于高度复杂的生物也可以进行检测，如人，大麦和小麦。

样品材料至少100bp的DNA片段线性的质粒，cos质粒或者λDNA超螺旋的DNA实验时间此表格列出了每一步实验所需的反应时间检测数量一个试剂盒足够用于：不超过3ug的模板DNA的12个标准的标记反应和100cm2有24个斑点的检测质量控制根据操作步骤中的描述，对未标记的对照品DNA（PBR328）进行标记，0.1pg同源DNA 在点杂交中通过16h的显色来检测（1pg同源DNA可以通过1小时的显色进行检测）。

BCIP_NBT比色法测定碱性磷酸酶活力_陈国千

图 1 酶量与产物量的关系
二、反应时间与产物量的关系取经生理盐水稀释为 2. 0 U / L和 4. 0 U / L的两份血清标本 ,按附表操作 ,反应时间分别为 0. 5、 1、 1. 5、 2、 3、 4 h,结果见图 2。在 3 h 内 ,吸光度与反应时间基本成正比。
三、显色稳定性取 4份不同 ALP 活力的血清标本 ,反应 2 h 加终止液后 ,放置 0、 1、 2 h 比色 , 吸光度基本不变。
上海医学检验杂志 1999年第 14卷第 2期
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尿脂肪管型检测对肾病诊断的意义
沈忠新孙作鹏 (中国医科大学附属第一医院检验科沈阳 110001)
本文用自行配制的甲苯胺蓝、副品红复合染液 (以下简称甲、副染液 )制备尿沉渣涂片 ,用普通光镜观察肾病患者尿脂肪管型 ,探讨尿脂肪管型检测对肾病诊断的意义。
四、精密度试验两份血清标本用生理盐水稀释后 AL P活力分别为 5. 0 U / L 和 1. 0 U / L,然后分别作批内、批间各 10次重复性试验 , 5. 0 U / L标本 CV 值批内 1. 07% ,批间 4. 13% , 1. 0 U /L 标本 CV 值批内 1. 59% ,批间 4. 38% 。
A colo rim etric method fo r measuring alkaline pho sphata se ( AL P) activity with BCIP a nd N BT as substrates w as established. The low limit o f detection is 0. 2 U / L ( Bessy -Low r y method) . The within run CV s o f two lev els of A L P ac tiv ity ( 5. 0、 1. 0 U /L ) ar e 1. 07% a nd 1. 59% , betw een run CV s 4. 13% a nd 4. 38% , respectiv ely. The cor relation coefficient betw ee n this method and Bessy -Lo wr y me tho d ( kinetic ) is 0. 992. The results show ed that this metho d w as simple , reliable and sensitiv e.

地高辛标记与检测DNA试剂盒说明书

地高辛标记与检测D N A试剂盒DIGDNALabelingandDetectionKit采用地高辛-dUTP进行随机引物DNA标记，碱性标记，利用NBT/BCIP酶联免疫，随时即用。

此试剂盒可对10ng-3μgDNA进行25次标记反应，可检测10×10cm2面积的杂交膜50张指导手册1前言1.1内容表1前言1.1内容表1.2试剂盒成分2.介绍2.1产品简介3.操作步骤和所需材料3.1在你开始前3.2流程图3.3地高辛标记DNA3.4标记效率的确定3.5DNA的转移和固定3.6杂交3.7免疫检测3.8DNA印记的洗脱和再杂交1.2试剂盒的成分瓶号标记内容包括功能1 无标记对照DNA12 无标记对照DNA23 DNA稀释缓冲液2管1mL50μg/mL鱼精DNA,10mMTris-HCl,1mMEDTA,pH8.0在25℃澄清溶液4 DIG标记的对照DNA20μL5μg/mL质粒pBR328DNA（用BamHI线性化）澄清溶液用于确定标记效率5 六聚核苷酸混合物6 标记用混合物7 DNA聚合酶1大片段标记级8 抗地高辛的碱性磷酸酶结合物200μL750U/mL从羊中获取的，Fab段，结合碱性磷酸酶澄清溶液9 NBT/BCIP10 封阻试剂附加仪器与所需试剂除了上表中列出的试剂外，你必须准备一些溶液。

在下表中，你可以找到不同操作程序需要准备的设备概要。

在每个操作程序的前面提供了详细的信息。

操作程序仪器设备试剂3.3DIG-DNA标记水浴灭菌的双蒸水0.2MpH8.0灭菌的EDTA3.4标记效率的半定量带正电荷的尼龙膜* 地高辛洗涤和封阻缓冲组合*TE缓冲液或者洗涤缓冲液马来酸缓冲液检测缓冲液3.5DNA转移和固定紫外光盒或者商业化可用于紫外交联的其他设备2×SSC或者10×SSC3.6杂交尼龙膜，带正电荷*杂交袋*，或者耐热的塑料袋或者滚筒瓶（分子杂交炉）注意：当用地高辛杂交缓冲液工作时，不要用开口的托盘。

碱性磷酸酶标记试剂

碱性磷酸酶标记试剂碱性磷酸酶标记试剂BCIP／T是碱性磷酸酶最常使用的呈色底物，碱性磷酸酶标记的试剂应该用真核生物的碱性磷酸酶，因为这种酶容易被EDTA灭活。

细菌酶难以终止其活性，易引起显色过度，导致较高背景。

BCIP／T底物在酶结合位点形成强烈的黑紫色沉淀，此反应是一个稳定进行的过程。

因此，可设定一个精确的反应对照。

可以通过孵育时间的长短控制反应的敏感性。

1．需要的溶液和特殊设备碱性磷酸酶缓冲液：100retool／L NaCl，5mmol／L MgCl2，100mmol／L Tris(pH 9．5)；T溶液(0．5gT用10ml 70％DMF溶解，贮存在4C)；BCIP溶液(0．5gBCIP[二钠盐]用10m1100％DMF溶解，贮存在413)；20mmol／LEDTA用溶解，DPX。

光学显微镜(通常带有照相机以便于记录结果)2．操作步骤(1)细胞染色前，准备3种贮存液：①T：用10ml 70％DMF溶解0．5gT；②BCIP：用1 0ml 100％DMF溶解0．5g BCIP[二钠盐儿③碱性磷酸酶缓冲液：100mmol／LNaCl，5 mmol／LMgCl2，100mmol／LTris(pH 9．5)。

所有的贮存液置4C可保存1年。

(2)实验前，底物液新鲜配制。

加66／ul T贮存液至10ml碱性磷酸酶缓冲液中，充分混合，加33ul BCIP贮存液，在1h内使用。

(3)将洗涤过的标本片放在一个适当的容器内。

加足够量的底物液覆盖标本片(3～5 ml适合于100mm平皿)。

在室温中进行反应直到染色达到适当黑色。

对一些试剂可在显微镜下定期监测。

一般孵育时间大约是30min。

(4)在含有20mmol／LEDTA的中漂洗以终止反应，螯合Mg2+。

(5)优化：如果需要，进行复染。

(6)用水冲洗，DPX封片。

【注意事项】大家在用药的时候，药物说明书里面有三种标识，一般要注意一下：1.第一种就是禁用，就是绝对禁止使用。

Western blot操作

Western blot操作（1）预处理将PVDF膜放置于100%的甲醇溶液中10 s，然后浸于去离子水中3 min，最后在转移缓冲液中浸泡20 min以上；同时，将电泳后的凝胶、滤纸也放在转移缓冲液中浸泡20 min以上；（2）转膜在电转仪阳极板上，自下而上依次叠放4层滤纸、PVDF膜、分离胶、4层滤纸，为防止短路，最好大小依次为4层滤纸>PVDF膜>分离胶>4层滤纸，并用玻棒赶去气泡；然后盖上电极板，接通电源，恒压80V，60 min；（3）封闭转印后的PVDF膜用去离子水冲洗一下，然后放入封闭液中37℃孵育1 h或4℃过夜。

PBST洗膜3次，每次间隔5~10 min；（4）一抗孵育PVDF膜与稀释好的抗血清（1:500，用抗体稀释液稀释）混合，室温下缓慢摇动孵育1 h。

PBST洗膜3次，每次间隔5~10 min；（5）二抗孵育PVDF膜与稀释好的碱性磷酸酶标记的羊抗鼠IgG （1:30,000，用抗体稀释液稀释稀释混合，室温下缓慢摇动孵育1 h。

PBST洗膜3次，每次间隔5~10 min；注：在显色前要用去离子水洗膜1次（6）显色反应将PVDF膜放入10 mL底物稀释缓冲液预先浸泡2 min，然后加入25 μL NBT和15 μL BCIP，避光条件下室温平缓摇动至显色；（如用BCIP和NBT显色试剂盒，此步操作应按试剂盒说明书进行）（7）终止反应：倒去底物，把膜浸入水中停止反应。

试剂PBS buffer:4mM KH2PO4,16mM Na2HPO4,115mM NaCl,PH7.4PBS blocking buffer: PBS buffer with 3% BSA and 0.5%v/v Tween20PBS Tween buffer: PBS buffer with 0.1%v/v Tween20抗体稀释液：PBS buffer with 0.2% BSA with 0.1%Tween20转移缓冲液（pH8.3）Tris 5.8 gSDS0.37 gGlycine 2.9 g甲醇200 mL 加D.D.W定容至1,000 mL，调pH至8.3PBS buffer PH 7.4 (1L)KH2PO44mM 0.544 gNa2HPO416mM 2.27 gNaCl 115mM 6.72 gD.D.W定容到1L加D.D.W定容至1,000 mL，调pH至7.4。

(中文) DIG High Prime DNA标记及杂交检测试剂盒 I

DIG High Prime DNA Labeling and Detection Starter Kit I DIG High Prime DNA标记及杂交检测试剂盒I说明书版本：Version11 （2010年8月）利用随机引物法及DIG-dUTP（碱不稳定）进行DNA标记反应，采用酶联免疫方法及发色底物NBT/BCIP进行杂交分子的显色。

本试剂盒可对10ng-3μg DNA进行12次标记反应，可进行24次杂交检测反应（100cm2杂交膜）。

产品目录号：11 745 832 910试剂盒于-15 ~ -25℃保存1. 概况1.1 说明书内容1. 概况 (2)1.1说明书内容 (2)1.2试剂盒组成 (3)2. 介绍 (4)2.1 产品概述 (4)3. 实验步骤和需要的材料 (7)3.1 实验开始前准备 (7)3.2 DIG-DNA标记 (7)3.3定量标记反应效率 (10)3.4 DNA转膜和固定 (12)3.5杂交 (13)3.6 免疫检测 (14)3.7探针洗脱和重探 (16)4. 结果 (17)4.1 典型结果 (17)5 附录 (18)5.1 疑难问题解决 (18)5.2参考文献 (18)1.2 试剂盒组成杂交反应所需的仪器和其他反应试剂请根据您的实验操作流程准备杂交反应所需的仪器和其他试剂，参见下表：带*的试剂为罗氏应用科学部提供的试剂。

2. 介绍2.1 产品概述反应原理DIG High Prime DNA标记检测试剂盒（I）采用地高辛（DIG，一种甾类半抗原）进行DNA 标记，所获得的探针用于后续的杂交反应，带有地高辛分子的杂交子通过酶联免疫反应进行显色检测。

应用DIG标记的DNA探针可用于：•所有形式的膜杂交反应•（微生物，人类，植物等）基因组DNA中的单拷贝基因检测样本•大小在100bp以上的DNA片段•线性化质粒，粘粒或λDNA•超螺旋DNA分析时间试剂盒反应次数本试剂盒包含•对10ng-3μg DNA进行12次标记反应• 24次杂交检测反应（100cm2杂交膜）质量控制对DNA对照品（pBR328，未标记）进行标准标记反应，将0.1pg同源DNA点膜后进行斑点杂交，显色16h呈阳性检测结果（1pg同源DNA的杂交反应显色1h后呈阳性检测结果）。

NBT显色试剂盒

3. Ji YB, Qu ZY, Zou X. Juglone-induced apoptosis in human gastric cancer SGC-7901 cells via the mitochondrial pathway. Exp Toxicol Pathol. 2009 Oct 6.
注意事项：
¾ BCIP对人体有刺激性，NBT对人体有害，请注意适当防护。 ¾ 为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。
使用说明：
1. 对于组织切片或细胞样品或膜，在与碱性磷酸酯酶标记的抗体或其它形式的探针孵育后，用适当洗涤液洗涤3-5次，每次
3-5分钟。对于检测内源性碱性磷酸酯酶的组织或细胞样品，在适当固定后，也用适当洗涤液洗涤3-5次，每次3-5分钟。
¾ BCIP/NBT是碱性磷酸酯酶的常用底物。在碱性磷酸酯酶的催化下，BCIP会被水解产生强反应性的产物，该产物会和NBT 发生反应，形成不溶性的深蓝色至蓝紫色的NBT-formazan。
¾ 本试剂盒可以用于细胞或组织的碱性磷酸酯酶显色包括诱导多功能干细胞iPS的鉴定，也可以用于Western等结合有碱性磷酸酯酶的膜的显色检测。同时也可以用于细胞或组织内源性的碱性磷酸酯酶显色。
¾ 有Nature论文注明使C3206-1 C3206-2 C3206-3
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产品名称碱性磷酸酯酶显色缓冲液
BCIP溶液(300X) NBT溶液(150X)
说明书
包装 100ml 350µl 700µl
1份
保存条件：
4℃保存，一年有效。BCIP溶液和NBT溶液需避光保存。
产品编号 C3206
BCIP/NBT碱性磷酸酯酶显色试剂盒
产品名称 BCIP/NBT 碱性磷酸酯酶显色试剂盒