基因工程制取干扰素共47页文档
干扰素生产工艺(共45张PPT)
第二十八页，共45页。
3.4．菌体收集
连续流离心机：冷却的发酵液，16000 r/min离心收集。菌体保存：－20℃冰柜，不超过12个月。检测：干扰素含量、菌体蛋白含量、菌体枯燥失重、质粒结构一致性、质粒稳定性。
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4 干扰素的别离纯化工艺过程
4.1、干扰素别离工艺过程 4.2、干扰素的纯化工艺过程
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免疫调节活性机制
对巨噬细胞的作用：IFNγ可使巨噬细胞外表MHCⅡ类分子的表达增加，增强其抗原递呈能力；此外还能增强巨噬细胞外表表达Fc受体，促进巨噬细胞吞噬免疫复合物、抗体包被的病原体和肿瘤细胞。对淋巴细胞的作用：干扰素对淋巴细胞的作用较为复杂，可受剂量和时间等因素的影响而产生不同的效应。在抗原致敏之前使用大剂量干扰素或将干扰素与抗原同时投入会产生明显的免疫抑制作用；而低剂量干扰素或在抗原致敏之后参加干扰素那么能产生免疫增强的效果。在适宜的条件下，IFNγ对B细胞和CD8+T细胞的分化有促进作用，但不能促进其增殖。IFNγ能增强TH1细胞的活性，增强细胞免疫功能；但对TH2细胞的增殖有抑制作用，因此抑制体液免疫功能。IFNγ不仅抑制TH2细胞产生IL-4，而且抑制IL-4对B细胞的作用，特别是抑制B细胞生成IgE。
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〔4〕初级别离
盐析: 4M硫酸铵，2℃～10℃，搅匀,静置过夜。离心：连续流离心机，16000 r/min保存：收集沉淀，粗干扰素，4℃保存。
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4.2、干扰素纯化工艺过程
溶解粗干扰素沉淀与疏水层析阴离子交换层析与浓缩阳离子交换层析与浓缩凝胶过滤层析无菌过滤分装
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1.5.干扰素生产工艺路线〔1〕
基因工程干扰素制备流程
基因工程干扰素制备流程下载温馨提示:该文档是我店铺精心编制而成，希望大家下载以后，能够帮助大家解决实际的问题。
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干扰素制备的工艺流程PPT课件
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质粒DNA的纯化②
6)吸出上清，用400μl TE(pH8.0)溶解质粒DNA沉淀。用酚、酚：氯 仿、氯仿各抽l次。
7)将水相转到另一微量离心管中，加100μl 10mol/L乙醇铵，充分混 匀，加2倍体积(约lml)乙醇，于室温放置10分钟，于4 ℃以 12000g离心5分钟，以回收沉淀的质粒DNA。
3 破碎细胞,提取细胞总mRNA.
4
用逆转录试剂盒逆转录,把总mRNA逆转录成cDNA
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以cDNA为模板、干扰素引物为引物,PCR,得到完全的干扰素基因的PCR产物
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目的基因与克隆载体进行体外重组
1.提取载体(连接
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,现在 来进行生
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基因工程菌的制备
目的基因的分离
目的基因与克隆
克隆载体
载体的体外重组
重组导入大肠杆菌K12
受体菌的培养 及筛选
从受体菌中获取目的基因 重组质粒
表达载体
导入大肠杆菌
受体菌的筛选（表达性、稳定性等检测）
工程菌
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工艺流程
目的基因的分离与获得
2、细菌的收获和裂解
1）用合适转头于4℃以4000转/分离心15分钟,弃上清,敞开离心管口并倒置离心管使上清全
部流尽。
2）将细菌沉淀重悬于100ml用冰预冷的STE中。
STE 0.1mol/L NaCl
10mmol/L Tris.Cl(Ph8.0)
1mmol/L EDTA(Ph8.0)
按步骤1）所述方法离心，以收集细菌细胞。
级联调节通气量和搅拌转速，控制溶解氧30%,培养4小时。然后控制培养温度20℃ ，pH6.0, 溶解氧60%,继续培养5-6.5小吋。同时进行发酵液杂菌检查，当0D值达9.0±1.0后，用5℃冷 却水快速降温至15℃以下，以减缓细胞衰老。或者将发酵液转入收集罐中，加入冰块使温 度迅速降至10℃以下。
基因工程重组人干扰素共14页word资料
根据来源、基因序列和氨基酸组成分类I 型干扰素：IFNα、IFNβ、IFN τ、IFN ω来源：白细胞、成纤维细胞、病毒感染的组织细胞等功能：抗病毒感染、抗肿瘤生长免疫调节(较弱）其中IFN-α为多基因产物，有23种以上的亚型。
II 型干扰素：干扰素γ（IFNg)来源：活化的T细胞和NK细胞产生功能：免疫调节➢提高单核巨噬细胞、树突状细胞的抗原提呈能力➢增强Tc细胞和NK细胞的杀伤活性➢抑制TH2细胞形成，下调体液免疫应答➢趋化作用➢抗病毒和抗肿瘤作用（次要）2. 根据动物来源确定分类，例如人干扰素（HuIFN），小鼠干扰素（MuIFN）。
免疫调节作用表现在对宿主免疫细胞活性的影响，如对巨噬细胞、T细胞、B细胞和NK细胞等均有一定作用。
●对巨噬细胞的作用：IFNγ可使巨噬细胞表面MHCⅡ类分子的表达增加，增强其抗原递呈能力；此外还能增强巨噬细胞表面表达Fc受体，促进巨噬细胞吞噬免疫复合物、抗体包被的病原体和肿瘤细胞。
●对淋巴细胞的作用：干扰素对淋巴细胞的作用较为复杂，可受剂量和时间等因素的影响而产生不同的效应。
在抗原致敏之前使用大剂量干扰素或将干扰素与抗原同时投入会产生明显的免疫抑制作用；而低剂量干扰素或在抗原致敏之后加入干扰素则能产生免疫增强的效果。
在适宜的条件下，IFNγ对B细胞和CD8+T细胞的分化有促进作用，但不能促进其增殖。
IFNγ能增强TH1细胞的活性，增强细胞免疫功能；但对TH2细胞的增殖有抑制作用，因此抑制体液免疫功能。
IFNγ不仅抑制TH2细胞产生IL-4，而且抑制IL-4对B细胞的作用，特别是抑制B细胞生成IgE。
●对其它细胞的作用：IFNγ对其他细胞也有广泛影响：①刺激中性粒细胞，增强其吞噬能力；②活化NK细胞，增强其细胞毒作用；③使某些正常不表达MHCⅡ类分子的细胞（如血管内皮细胞、某些上皮细胞和结缔组织细胞）表达MHCⅡ类分子，发挥抗原递呈作用；④使静脉内皮细胞对中性粒细胞的粘附能力更强，且可分化为高内皮静脉，吸引循环的淋巴细胞。
干扰素的工艺制备流程
取体重18-20克小鼠5只，每只尾静脉注射剂量按人
每千克体重临床使用最大量的3倍，观察7天，若动物全部存
活，说明成品合格。
4 国内基因工程药物产业发展状况
我国的生物技术药物却一直苦于缺乏 自主创新的产品，绝大多数上市药物为仿 制药，创新药物的开发一直未能打开局面。
一种新药从研发到投放市场，投入大 约为30亿~60亿美元。
基因工程菌的制备
❖ 目的基因的分离 克隆载体
→ 目的基因与克隆
载体的体外重组
重组体导入大肠杆菌K12
→
→
受体菌的培养及筛选 从受体菌中获取目的基因
表达载体
重组质粒
导入大肠杆菌
→
受体菌的筛选，表达性、稳定性等检测
工程菌
一、目的基因的分离与扩增
❖ 1. 破碎细胞，用Trizol法提取总的RNA ❖ 2. 将生产干扰素的人白细胞的mRNA分级分离然后进行凝胶
存在的问题：
（1）同种产品生产厂家过多，造成市场恶性竞 争， 严重影响产业的健康发展。
（2）融资渠道单一、产业发展资金不足。 （3）医药市场竞争无序，行业不正之风严重。 （4）企业管理相对滞后，技术兼经营型人才匮 乏。
后面附件PPT常用图标，方便大家提高工作效率
140 BUSINESS & FINANCE ICONS
源性DNA应低于100pg。
❖ （7）残余血清IgG含量测定
❖
在应用抗体亲和层析法作为纯化方法时必须进行此项
检定。
❖ （8）残余抗生素活性测定
❖
半成品中不应有抗生素活性存在。
❖ （9）紫外光谱扫描
❖
检查半成品的光谱吸收值，最大吸收值应在280±2纳
米。
基因工程药物-干扰素的制备
基因工程技术为干扰素的制备带来了革命性的突破。本节将介绍干扰素的概 述以及基因工程在干扰素制备中的应用。
基因工程技术在干扰素制备中的应用
1
基因克隆
通过克隆干扰素基因，实现大规模制备。
2
表达与纯化
将干扰素基因导入宿主细胞，并优化表达和纯化工艺。
3
转化与改性
通过转化和改性技术，提高干扰素的稳定性和疗效。
市场增长潜力
随着生命科学技术的发展，干 扰素药物市场有望持续增长。
疗效和安全性
干扰素在疾病治疗中的广泛应 用为其市场发展提供了机遇。
竞争格局
多家制药公司已进入干扰素药 物市场，竞争激烈。
பைடு நூலகம்
干扰素的生产工艺
步骤1
干扰素基因的克隆和构建。
步骤2
干扰素基因的表达与纯化。
步骤3
干扰素的转化和改性。
常见干扰素药物的种类和特点
α-干扰素
广谱抗病毒活性，治疗病毒感染和肿瘤。
β-干扰素
用于多发性硬化症等自身免疫性疾病的治疗。
γ-干扰素
具有免疫调节和抗肿瘤活性。
干扰素药物的临床应用
抗病毒治疗
干扰素可用于治疗乙型肝炎、丙 型肝炎等病毒感染。
自身免疫疾病
用于多发性硬化症等自身免疫性 疾病的治疗。
抗肿瘤治疗
干扰素可用于肝癌、黑色素瘤等 肿瘤的辅助治疗。
干扰素药物的不良反应与副作用
1 注射部位反应
2 全身反应
局部疼痛、红肿等不良反应常见。
发热、乏力、恶心等全身不适感可能发生。
3 免疫反应
干扰素可引起免疫相关不良反应，如抑制造血功能等。
干扰素药物市场前景分析
(完整word版)基因工程制备干扰素
(完整word版)基因工程制备干扰素毕业论文(设计)题目浅谈基因工程生产人干扰素姓名乔雪姣学号11111807专业微生物技术及应用指导教师鞠守勇职称讲师中国·武汉二○一二年十一月目录摘要........................................................................................................... 错误!未定义书签。
关键词......................................................................................................... 错误!未定义书签。
Abstract .. (4)Key words ................................................................................................. 错误!未定义书签。
前言. (5)1、干扰素作用及其机理详述 (6)1.1干扰素的种类 (6)1.2干扰素的性质 (7)1.3干扰素的作用.............................................................................. 错误!未定义书签。
1.3．1 干扰素的作用...................................................................... 错误!未定义书签。
1.3.2 干扰素的作用示意图............................................................. 错误!未定义书签。
1.4 干扰素的作用机理 .................................................................... 错误!未定义书签。
干扰素的制备
将cDNA克隆到含有四环素、氨苄青霉素抗性基因的 质粒pBR322中，转化到大肠杆菌，重组的载体 DNA 分 子在一定条件下转化入大肠杆菌，形成携带质粒的菌 株。
图为：质粒pBR322
四、从大肠杆菌k12获取目的基因
由于质粒重组时有3种基本方式，即：目的基因与克 隆载体重组，目的基因片段与目的基因片段重组，克 隆载体与克隆载体重组；另外重组过程可能会发生基 因突变情况 • 流程：步骤一：将细菌涂布到含氨苄青霉素的培养基 上培养，就可得到质粒PBR322或重组质粒的细菌单菌 落。 • 步骤二：步骤一获得的每一个细菌单菌落标记 为a、b、c、d等，在每一个单菌落中挑取部分细菌转 涂到含有四环素的培养基上，不能生长的是绝大部分 含有重组质粒的细菌及少量可能发生突变的非重组质 粒的细菌单菌落。原因：因为PBR322含有抗四环素基 因，重组质粒中目的基因插在抗四环素基因中，使其 结构破坏，失去抗四环素作用。
启开种子 粗提 精提 分装 冻干 制备种子液 发酵培养
半成品制备
半成品检定
成品检定
成品包装
• 1．菌种制备 取－70℃下保存的甘油管菌种（工作种 子批），于室温下融化。然后，接入摇瓶，培养温度30℃， pH7.0，250 r/min活化培养18±2小时后，进行吸光值测定 和发酵液杂菌检查。 • 2．种子罐培养 将已活化的菌种接入装有30L培养基的 种子罐中，接种量10%，培养温度30℃，pH7.0，级联调节通 气量和搅拌转速，控制溶解氧为30%，培养3～4小时，转入 发酵罐中，同时取样发酵液进行显微镜检查和LB培养基划线 检查，控制杂菌
基因工程制取干扰素
（2）质粒与目的基因的连接
1、取2μl（50 -400ng）载体和7倍摩尔量的插入片段混合好以后置于 45度水浴5min马上置于冰上冷却 （插入片段和载体在之前的操作过 程中有部分粘性末端已经匹配，如果直接连接可能会有多重插入和 多载体自连的情况，45度处理是其粘性末端打开。由于片段与载体 混合、预热后马上置于冰上，使得片段与载体最大限度匹配，从而 提高连接效率。）。 2、加入2 μl 10×Ligation Buffer（连接缓冲液，内含ATP），用双蒸 水调整总体积为20 ul，混匀。然后加入T4连接酶1ul，轻柔充分混匀 （切勿剧烈震荡，可能导致酶部分失活）。16℃连接2小时
6、人工加尾形成 “粘性末端” 、 粘性末端”
同聚物加尾 法 1972年，斯坦福大学的P. Labban和P. Kaiser提出。 年 斯坦福大学的 提出。 和 提出
①原理： 原理： DNA末端转移酶能在没有模板的情况下给DNA的3’-OH端加上脱氧核苷酸。 末端转移酶能在没有模板的情况下给 末端转移酶能在没有模板的情况下给 的 端加上脱氧核苷酸。 ②加尾—碱基互补 加尾— 分别给载体和插入片断加上互补的核苷酸。 分别给载体和插入片断加上互补的核苷酸。 互补的核苷酸
• 2、细菌的收获和裂解
１）用合适转头于4℃以4000转/分离心15分钟，弃上清，敞开离心管口并 倒置离心管使上清全部流尽。 ２）将细菌沉淀重悬于100ml用冰预冷的STE中。 STE 0.1mol/L NaCl 10mmol/L Tris.Cl(pH8.0) 1mmol/L EDTA(pH8.0) 按步骤１）所述方法离心，以收集细菌细胞。
提取重组质粒
• 1、对上一步获得含目的基因的大肠杆菌在含有氯霉素的培养基中扩大培养 15h。培养时间：前人实验证实大肠杆菌K12生长前6h为迟缓期, 6~15. 5h 为对数增时期, 15. 5~ 19. 5h为稳定期, 19. 5h后为衰亡期。氯霉素：氯霉素 可抑制宿主的蛋白质合成，结果阻止了细菌染色体的复制，然而，松弛型 质粒仍可继续复制。
基因工程药物——干扰素的制备PPT课件
干扰素（IFN）是一种广谱抗病毒剂，并不直接杀 伤或抑制病毒，而主要是通过细胞表面受体作用使 细胞产生抗病毒蛋白，从而抑制乙肝病毒的复制； 同时还可增强自然杀伤细胞（NK细胞）、巨噬细胞 和T淋巴细胞的活力，从而起到免疫调节作用，并 增强抗病毒能力。干扰素是一组具有多种功能的活 性蛋白质（主要是糖蛋白），是一种由单核细胞和 淋巴细胞产生的细胞因子。它们在同种细胞上具有 广谱的抗病毒、影响细胞生长，以及分化、调节免 疫功能等多种生物活性。。
上海生物制品研究所 北京三元基因工程有限公司 长春海伯尔生物技术有限责任公司 深圳科兴生物工程有限公司 哈药集团生物工程有限公司 天津华立达生物工程有限公司 沈阳三生制药有限责任公司 安徽安科生物工程(集团)股份有限公司 ……
干扰素在病毒细胞表面与特殊膜受体结合发挥抗DNA和RNA作 用，包括对某些酶的诱导作用，阻止受病毒感染细胞中病毒 的复制，抑制这些细胞的繁殖。本品具有免疫调节作用，可 增强巨噬细胞的吞噬作用，增强淋巴细胞对靶细胞的特殊细 胞毒性。 1.抗病毒作用：其抗病毒活性不是杀灭而是抑制病毒，它一 般为广谱病毒抑制剂，对RNA和DNA病毒都有抑制作用。当病 毒感染的恢复期可见干扰素的存在，另一方面用外源性干扰 素亦可缓解感染。 2.抑制细胞增殖：干扰素抑制细胞分裂的活性有明显的选择 性，对肿瘤细胞的活性比正常细胞大500～1000倍。干扰素 抗肿瘤效果可以是直接抑制肿瘤细胞增殖，或通过宿主机体 的免疫防御机制限制肿瘤的生长。 3.干扰素对体液免疫、细胞免疫均有免疫调节作用，对巨噬 细胞及NK细胞也有一定的免疫增强作用。
药浓度波动，浓度过高时会导致较为严重的不良反应，但浓度过低又 会导致病毒重新复制和反弹；此外，一旦注射了普通干扰素，它广泛 期只有2至5小时，必须频繁注射用药，因而干扰素的临床应用受到了 很大限制。 到1990年代末2000年代之初，聚乙二醇化(PEG)技术的出现使干扰素 终于成为人类与乙肝斗争中的真正利器。2002年，罗氏研究生产的聚 乙二醇化干扰素α-2a(派罗欣)正式上市，聚乙二醇与干扰素的结合， 大大改善了干扰素的药物特性，使血药浓度变得更加稳定，同时聚乙 二醇分子支链对干扰素有效成分的保护作用，大大降低了它的抗原性， 高，副反应显著减少。
干扰素的制备
把得到的杂交阳性克隆中的重组质粒 DNA放到一个无细胞蛋白合成体系中进行 翻译，对每一个翻译体系的产物进行抗病 毒的干扰素活性检测，经过多轮筛选获得 了产生干扰素的cDNA。 最后将干扰素cDNA克隆入大肠杆菌表 达载体中，转化大肠杆菌进行高效表达。
二、基因工程干扰素的制备
制备种子液 发酵培养 提 半成品制备 半成品检定 分装 干 成品检定 成品包装 启开种子 粗 冻
1、半成品检定
（4）纯度 纯度 电泳纯度用非还原型SDS-PAGE法，银染显色应 为单一区带，经扫描仪测定纯度应在95%以上。
（ 5）相对分子量测定 ）
还原型SDS-PAGE，加样量不地域微克，同时用 已知相对分子量的蛋白标准系列做对照，以迁移率为横 坐标，相对分子量的对数为纵坐标作图，计算相对分子 量。与理论值比较，误差不得高于10%。 （6）残余外源性 ）残余外源性DNA含量测定 含量测定 用放射性核素或生物素探针法测定，每剂量中残 余外源性DNA应低于100pg。
（1）物理性状 物理性状
2、成品检定
冻干品白色或微黄色疏松体，加入注射水后 不得含有肉眼可见不溶物。 （2）鉴别试验 鉴别试验 应用ELISA或中和试验检定。 （3）水分测定 水分测定 用卡氏法，应低于3%。 （4）无菌试验 无菌试验 同半成品。
（5）热原质试验 热原质试验 同半成品检定。 （6）干扰素效价测定 干扰素效价测定 同半成品检定，效价不应低于标示量。 （7）安全试验 安全试验 取体重为350-400克豚鼠3只，每只腹侧皮下注 射量为成人每千克体重临床使用最大量的3倍，观察7 天，若豚鼠局部无红肿、坏死、总体重不下降，说明 成品合格。 取体重18-20克小鼠5只，每只尾静脉注射剂量按 人每千克体重临床使用最大量的3倍，观察7天，若动 物全部存活，说明成品合格。
基因工程药物之干扰素的制备流程课件
纯化方法
采用色谱（如凝胶过ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ色谱、离子交 换色谱）、电泳等纯化技术，进一步 分离和纯化干扰素蛋白质。
纯度检测
通过SDS-PAGE、高效液相色谱等方 法检测干扰素的纯度，确保产品质量 。
04
干扰素制备过程中的质量控制
工程菌的质量控制
菌种鉴定
确保所使用的工程菌种是正确的，并通过基因测 序等方法进行验证，防止菌种污染或误用。
降低干扰素制备成本的发展需求
原料与耗材的成本控制
在干扰素的制备过程中，原料和耗材的成本占据了很大比例。因此，寻找更经济 、高效的原料来源，以及降低耗材的使用量，是降低成本的重要途径。
生产工艺的优化与改进
通过优化生产工艺，减少生产步骤、提高生产效率，可以降低干扰素的生产成本 。此外，开发连续化、规模化的生产工艺，实现资源的充分利用和能源的高效利 用，也是降低成本的关键。
种类
根据产生来源和受体特异性，干扰素主要分为三类：Ⅰ型干 扰素（包括α和β干扰素）、Ⅱ型干扰素（γ干扰素）和Ⅲ型 干扰素（λ干扰素）。
干扰素的生物学活性
抗病毒活性
干扰素能够抑制病毒的复制和 扩散，通过诱导细胞产生抗病 毒蛋白，降解病毒RNA、阻止 病毒蛋白合成等方式发挥作用
。
抗肿瘤活性
干扰素可以抑制肿瘤细胞的增殖， 诱导肿瘤细胞凋亡，同时激活免疫 系统，增强机体对肿瘤的免疫应答 。
免疫调节活性
干扰素能够调节机体的免疫功能， 激活免疫细胞，增强机体的免疫力 ，从而抵抗病毒和肿瘤的侵袭。
干扰素在医学领域的应用
抗病毒治疗：干扰素已被广泛应用于 病毒感染性疾病的治疗，如乙型肝炎 、丙型肝炎、尖锐湿疣等。
免疫治疗：干扰素可用于免疫调节， 治疗一些自身免疫性疾病和免疫缺陷 病。
重组人干扰素生产工艺(精品PPT)
功能：免疫调节
提高单核巨噬细胞、树突状细胞的抗原提呈能力 增强Tc细胞和NK细胞的杀伤活性
抑制TH2细胞形成，下调体液免疫应答 趋化作用
抗病毒和抗肿瘤作用〔次要〕 2. 根据动物来源确定分类，例如人干扰素〔HuIFN〕，小鼠干扰素〔MuIFN〕。
第五页，共四十五页。
上市重组干扰素: α2a、α2b、α1b、 β1b，γ
的免疫抑制作用；而低剂量干扰素或在抗原致敏之后参加干扰素那么能产生免疫增强的效果。在适宜的条件下，IFNγ对B细胞和CD8+T细胞的分化有促进作用，但不能促进其增殖。IFNγ能 增强TH1细胞的活性，增强细胞免疫功能；但对TH2细胞的增殖有抑制作用，因此抑制体液免疫功能。IFNγ不仅抑制TH2细胞产生IL-4，而且抑制IL-4对B细胞的作用，特别是抑制B细胞生成 IgE。
第十一页，共四十五页。
1.4 重组(zhònɡ zǔ)干扰素的临床应用
广谱抗病毒活性〔rhuIFNα〕 慢性乙型、丙型、丁型肝炎；疱疹、病毒性
角膜炎。 直接抗肿瘤活性〔rhuIFNα〕 毛细胞和慢性髓样白血病、 Kaposi肉瘤(ròuliú)、
非霍奇金淋巴瘤。 免疫调节活性——治疗慢性肉芽肿瘤〔rhuIFNγ〕 多发性硬化症 rhuIFNβ
第四页，共四十五页。
天然(tiānrán)干扰素 分类
1. 根据来源、基因序列和氨基酸组成分类 I 型干扰素： IFNα、IFNβ、IFN τ、IFN ω 来源：白细胞、成纤维细胞、病毒感染的组织细胞等
功能(gōngnéng) ：抗病毒感染、抗肿瘤生长 免疫调节(较弱〕
其中IFN-α为多基因产物，有23种以上的亚型。 II 型干扰素：干扰素γ〔IFN )