核酸分子杂交

一、核酸探针的设计
选择探针的最基本原则：
应具有高度特异性，其次是探针的来
源是否方便和制备探针的难易程度等。
（一）基因组DNA探针
1.来源：基因组DNA探针来源于某
种生物的基因组，多为某一基因的全 部或部分序列。
2.制备方法:
（1）基因克隆的方法 （2）聚合3'
3' 5'
α-P32 dGTP
G32G32G32G32
G32G32G32G32
④ T4 DNA聚合酶标记法
(4)同位素标 记RNA探针
①SP6 RNA聚 合酶体系 ②成对启动子 系列
RNA探针的优点：
（1）稳定性好，产量高，杂交信号强。 （2）用无RNA酶的DNA酶处理即可去除模 板。 （3）启动子特异性高，故在异常位点起 始RNA合成比率很低。
一、变性（denaturation）：
1.概念：
在理化因素作用下，维系 DNA 二级结 构的氢键和碱基堆积力遭到破坏，DNA双 螺旋的两条互补链松散而分开成为单链， 从而导致DNA的理化性质及生物学性质发 生改变，这种现象称为DNA的变性。
2、变性的方法：
（1）热变性：温性：pH值低于3或高于10时， 双链核酸分子链间的氢键断裂。 （3）化学试剂变性：如尿素、甲酰胺、 甲醛等使双链核酸分子链间的氢键断裂。
(3)DNA探针的末端标记法 • 只能对DNA5‘或3’端进行部分标记
• T4DNA聚合酶、T4多核苷酸激酶、末端 脱氧核苷酸转移酶、Klenow 酶等
①Klenow酶的末端标记法
②T4噬菌体多核苷酸激酶标记法 （polynucleotide kinase，PNK)
③末端脱氧核苷酸转移酶标记法
1.特点 : （1）根据需要来合成相应的核酸序列，避免了天 然探针的缺点； （2）大多数寡核苷酸探针长度较短,一般为 10~50bp,其序列复杂度低，所以和等量靶位点完 全杂交的时间比克隆探针短； （3）寡核苷酸探针尤其适合点突变的检测(短探 针中碱基的错配能大幅度地降低杂交体的Tm值)； （4）探针的长度较短，特异性较低，杂交信号较 弱。
常用放射性核素的物理性质
核素 半衰期 100％纯度时放射性活性 射线粒子的最大能量
（Ci/mmol）
β
32P 35S 3H 14C 131I 125I
Emax (keV)
a
14.3天 87.1天 12.1年 5100 年 8.6天 60天
9120 1490 29 62 16100 2400
1710 169 18.5 156 608 34.6 356 35.4
（2）化学修饰标记法：利用标记物分 子上的活性基团与分子探针上的某些 基团发生化学反应，将标记物直接结 合到探针分子上。
四、核酸分子杂交的技术要素
• 核酸探针的制备
• 核酸探针的标记 • 核酸标记探针的检测
• 核酸分子杂交的技术方法
第二节
核酸探针
分子探针（ molecular probe）:指带有标记的 已知分子，能与特定的靶分子发生特异性的结 合，并可被一定的方法所检测。
核酸探针 （ nucleic acid molecular probe ）： 指能与特定核酸序列发生特异性互补杂交，杂 交后可用特殊方法检测的、带有标记的、并已 知碱基序列的核酸片段。
本法适用于各种结构的双链的核酸探 针的标记，而不适用于单链DNA和RNA 的标记。 应使用大肠杆菌DNA聚合酶I全酶，不能 用Klenow片段 标记物是α-32P dNTP 探针的长短：以400～800bp为宜。取 决于DNase I的浓度、反应的温度和 时间。

(2)随机引物法
其原理是随机引物（人工合成的6~8个核 苷酸）能与各种单链DNA模板结合，作为合成 新链的引物，在DNA聚合酶的催化下，按53
• 温度：适宜的复性温度是比Tm低25℃。
• 离子强度（盐浓度）：适当的离子强度 可中和核酸分子上磷酸基团所带的负电， 减少双链间的静电斥力，有利于复性。
三、分子杂交概念
•分子杂交（ molecular hybridization ） ： 不同来源的核酸变性后，合并在一起，只要这 些核酸分子含有可以形成碱基互补配对的序列， 复性也会发生在不同来源的核酸链之间，形成 杂化双链，这个过程称为分子杂交。
（四） 寡核苷酸探针
2.设计原则: （1）探针长度：一般要求在10～50bp; （2）G／C含量为40％～60％; （3）探针分子中应避免互补序列; （4）避免同一碱基连续出现，一般不能多 于4个; （5）探针与非靶基因序列的同源性不能超 过70％或8个以上连续的碱基同源。
二、核酸探针的标记
一个理想的探针标记物特性 ： 灵敏度高 标记物与探针结合后，应不影响杂交反 应，尤其是杂交特异性、稳定性和Tm值 标记物对检测方法无干扰 检测方法要灵敏、特异、稳定、简便 标记物对环境污染小，对人体无损伤， 价格低廉。
↓
与载体连接（质粒、噬菌体）
↓
克隆(PCR扩增)
↓
酶切
3.特点:
（1）克隆在载体中的DNA片段，可以无限 繁殖，取之不尽。 （2）PCR制备探针更加简便和省时。 （3）相对RNA而言，DNA探针不易降解，
（4）DNA探针标记方法也较成熟。
（二）cDNA探针
1.制备: 以mRNA为模板，经逆转录获得cDNA分子。 2.特点: （1）不存在内含子和高度重复序列,杂 交效率高; （2）cDNA探针的制备受RNA酶的影响。
核酸分子杂交
特点：
• 灵敏度高（<1pg互补序列） • 速度快（<24h） • 简单易行
应用：
• 基因克隆的筛选 • 酶切图谱制作 • 基因组中特定基因序列的定量和定性检 测 • 基因突变分析 • 疾病的诊断、微生物病原体检测
第一节 核酸分子杂交的基本原理
• 具有互补序列两条单链核酸分子在一 定条件下按碱基互补配对原则退火形成 双链的过程。 • 杂交的双方是待测核酸和已知核酸序 列，已知核酸序列称探针。 • 杂交有固相杂交和液相杂交。
Tm值：DNA的热变性发生在一个很窄的温 度范围内，在这一范围内，A260达到最大 值一半时的温度称为DNA的解链温度，又 称为熔解温度（melting temperature， Tm）。
在Tm时，核酸分子中50%的双链结构 被解开。
影响Tm值的因素：
1.DNA分子的大小及分子组成：G-C含量越多,Tm 值越高（Tm=0.41 (G+C)%+69.3 ）；
核酸分子杂交技术
（molecular hybridization)
核酸分子杂交的发展
• 液相杂交：Hall等1961年将探针与靶序列 在溶液中杂交，通过平衡密度梯度离心分 离杂交体。该法很慢、费力且不精确，但 它开拓了核酸杂交技术的研究。
• 固相杂交： Bolton等1962年设计了第一种 简单的固相杂交方法，称为DNA-琼脂技术。
通过逆转录 ↓ 双链cDNA ↓S1核酸酶切平两端 加接头
↓限制酶
粘性末端 ↓ 载体连接 ↓ 克隆
（三）RNA探针
特点： （1）大多以单链形式存在，几乎不存在互补 双链的竞争结合，RNA探针与靶序列的杂交 效率较高;
（2）RNA/RNA和RNA/DNA杂交体稳定性高；
（ 3 ） RNA 分子中不存在高度重复序列，减少 非特异性杂交； （ 4 ） RNA 探针有易降解和标记方法复杂的缺 点。
3、化学键变化：维持双螺旋稳定的氢键 和碱基堆积力遭到破坏。 4、化学结构变化：DNA变性改变了其空间 结构，不涉及到其一级结构的改变。 这有别于引起DNA一级结构破坏的DNA 降解过程。
5、DNA变性后的性质改变：
① 增色效应
(hyperchromic effect)
② 密度增加；
③ 粘度降低；
2.溶液的离子强度:在低离子强度中,Tm值较低； 在高离子强度溶液中,Tm值较高。 3.pH值:核酸溶液的pH值在5-9范围内,Tm值变化 不明显, pH<4或pH>11不利于氢键形成； 4.变性剂:通过干扰碱基堆积力和氢键的形成而 降低Tm值.甲酰胺每增加1%,Tm可降低0.72℃。
Tm的高低与DNA分子中G+C的含量有关， G+C的含量越高，则Tm越高。
常用的标记物根据其特性分两类：
• 放射性同位素标记物 • 非同位素标记物
（一）放射性同位素标记
1. 常用标记探针的同位素： 32P、 3H、35S、14C、125I等
2. 特性：
①检测特异性强； ②灵敏度高；
③对酶促反应无任何影响，也不影响碱基 配对的特异性和稳定性；
④易造成放射性污染； ⑤半衰期短的同位素应用受到限制，随用 随标记，立即使用，不能长时间存放。
• 分子杂交技术：用标记的已知DNA或RNA片 段（探针）来检测样品中未知核酸序列， 通过核苷酸间碱基互补的原则发生异源性 结合，再经显影或显色的方法，将结合核 酸序列的位置或大小显示出来的技术。 • 待测的核酸序列，可以是克隆的基因片段， 也可以是未克隆化的基因组DNA和组织细胞 的DNA、RNA。
（3）局部双链周围的碱基如配对，则形 成中心序列 （4）形成完整的双链分子
3、影响复性的因素：
• 单链核酸的起始浓度：反应开始时的 总浓度可直接影响单链分子碰撞的几 率，浓度越高，复性越快。 • 核酸链长度（分子量）：分子越长， 形成配对的难度也大，复性也慢。
• 核酸分子的复杂性：复杂性越高，形成 正确配对的难度也越大，复性越慢。
• 膜杂交：60年代中期Nygaard 等的研究为 应用标记DNA或RNA探针检测固定在硝酸纤 维素（NC）膜上的DNA序列奠定了基础。 Brown等应用这一技术评估了爪蟾rRNA基因 的拷贝数。 • 原位杂交：Orth（1970）应用3H标记的兔乳 头状瘤病毒cRNA探针与兔乳头状瘤组织的 冰冻切片进行杂交，首次用原位杂交检测 了病毒DNA在细胞中的定位。