金黄色葡萄球菌的耐药性研究

金黄色葡萄球菌的耐药性研究

一、金黄色葡萄球菌的分离及培养

称取10g土样，在无菌条件下，放入无菌的三角瓶中，加入90ml的蒸馏水，再加入0.2mg复方磺胺甲恶唑振荡10min，使土样充分混合，利用金黄色葡萄球菌对磺胺类药物敏感性低的特性，杀死其他细菌。从三角瓶中取1ml上清液放入一支无菌试管（15*150mm）中按10倍梯度稀释成10-5的土壤稀释液后，分别取200μL涂布于牛肉膏蛋白胨培养基上，置于37℃培养箱中恒温培养24h。利用高盐培养基抑制其它细菌的生长，从而分离得到金黄色葡萄球菌。

二、金黄色葡萄球菌的鉴定

1.菌落形态：菌落较小，圆形，直径1-2mm，较湿，较透明，边缘整齐，隆起，略带淡绿色。

2.染色观察：从平板上挑取可疑性菌落进行革兰氏染色，金黄色葡萄球菌为革兰氏阴性菌，显微镜下呈单个或葡萄状排列，无芽孢、荚膜，单个菌体直径为0.5-1μm。

革兰氏染色：

1.涂片：取灭过菌的载玻片于实验台上，用移液枪吸取10μL待检样品滴在载玻片的中央，用烧红冷却后的接种环将液滴涂步成一均匀的薄层，涂布面不宜过大。

2.干燥：将标本面向上，手持载玻片一端的两侧，小心地在酒精灯上高处微微加热，使水分蒸发，但切勿紧靠火焰或加热时间过长，以防标本烧枯而变形。

3.固定：固定常常利用高温，手持载玻片的一端，标本向上，在酒精灯火焰处尽快的来回通过2-3次，共约2-3秒钟，并不时以载玻片背面加热触及皮肤，不觉得烫为宜（不超过60℃），放置待冷后，进行染色。

4.初染：在涂片薄膜上滴加草酸铵结晶紫1-2滴，使染色液覆盖涂片，染色约为1min。

5.水洗：斜置载玻片，在自来水龙头下用小股水流冲洗，直至洗下的水呈无色为止。

6.媒染：用100-1000μL移液枪吸取300μL碘液滴在涂片薄膜上，使染色液覆盖涂片，染色约1min。

7.水洗：重复步骤5。

8.脱色：斜置载玻片，滴加95％的乙醇脱色，至流出的乙醇不显紫色为止，大约需时20-30s，随即水洗。

9.复染：在涂片薄膜上滴加沙黄染液1-2滴，使染色液覆盖涂片，染色约1min。

10.水洗：重复步骤5。

11.干燥、观察：用吸水纸吸掉水分，待标本片干后置显微镜下，用低倍镜观察，发现目的物后，滴一滴浸油在玻片上，用油镜观察细菌的形态及颜色，紫色为革兰氏阳性菌，红色为革兰氏阴性菌。

三、实验中所需培养基配方及制法

（1）科玛嘉金葡萄球菌显色培养基：琼脂15.0g/L 蛋白胨及盐分65g/L 色素2.5g/L PH 6.9+0.2

金黄色葡萄球菌在科玛嘉黄色葡萄球菌显色培养基上，菌落颜色为紫红色、粉色或粉红色。

（2）广东环凯显色培养基：蛋白胨大豆胨和酵母粉氯化钠琼脂显色剂

金黄色葡萄球菌在广东环凯显色培养基上，菌落颜色为粉红——紫红色。

（3）13％NaCl牛肉膏蛋白胨培养基：牛肉膏5g 蛋白胨10g 氯化钠130g 琼脂15g 水1000ml PH 7.4-7.6

（4）MH肉汤培养基：乳糖5g 胰蛋白胨20g SDS 0.5g 氯化钠5g 磷酸氢二钠（无水）5.74 磷酸二氢钾（无水）1g 微量元素溶液0.5mL 蒸馏水1000mL

制法：将上述各固体成分加到蒸馏水中,加热溶解,pH为7.0±1冷却后再加微量元素溶液0.5mL,边加边摇匀,分装入有童汉氏小管的试管各5mL.双料成分均加倍,即将上述LTSE肉汤液浓缩二倍配制,分装入内有童汉氏小管的试管各10mL （仅分装30mL的供酱油及酱类检验用）,置高压蒸汽灭菌器中,以115℃灭菌20～30min,贮存于4℃冰箱或阴凉处备用。

四、耐药性分析

（1）抗菌药物及试剂：红霉素、螺旋霉素、克拉霉素、阿奇霉素、林可霉素、泰立霉素等

（2）药敏试验方法：

药液的制备：将受试药物配制成浓度为1280μg/ml的药液，置-20℃保存备用。试验时用灭菌蒸馏水稀释到所需浓度。

菌液的制备：将分离到的致病性金黄色葡萄球菌种，接种于新鲜肉汤培养基中，置于35℃恒温培养箱培养18-20h。将金黄色葡萄球菌稀释至106个/ml后置于4℃冰箱保存待用。

采用96孔板微量肉汤稀释法对部分分离的金葡萄球菌进行药敏试验，结果根据《抗微生物药物敏感性试验执行标准》进行判定。