草鱼出血病浸泡灭活疫苗的制作与应用
草鱼出血症的诊断与防治方法研究进展
草鱼出血症的诊断与防治方法研究进展摘要：草鱼是大型鲤科经济鱼类，为我国四大家鱼之一，也是我国养殖产量最高的鱼类。
然而，由呼肠孤病毒引起的草鱼出血病是危害草鱼最为严重的病毒性疾病，给养殖者造成重大的经济损失。
因此，建立简单、快速的检测技术和有效的预防与治疗措施对于草鱼出血症的疾病控制相当重要。
本文主要从草鱼出血症的诊断及防治方法的研究进展做一综述。
关键词：草鱼出血症；诊断；防治Resent progress about diagnosis and prophylaxis methods of Grass Carp Hemorrhage VirusAbstract:Grass carp as one of four famous fish in our country is a large cyprinidae economic fish, also is the highest fish farming production. However, grass carp reovirus hemorrhagic a serious viral disease caused great economic losses for farmers. Therefore, to establish a simple and rapid detection technology and effective prophylaxis and treatment measures for grass carp out of disease control is quite important. This article mainly outlines the grass carp disease diagnosis and prevention methods.Key words:Grass Carp Hemorrhage Virus;diagnosis;prophylaxis 草鱼因其生长迅速，饲料来源广，是中国淡水养殖的“四大家鱼”之一，其产量约占淡水养殖总产量的20％。
草鱼病毒性出血病灭活疫苗的简易制备与应用
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!+! 出血病疫苗的灭活 取 !+$ 所述悬液按剂量 加入 "+-. 的福尔马林溶液， 充分摇匀， 放入 &’, 恒 温箱中灭活 ’! 小时， 灭活期间， 每 ! / % 小时振荡一 次， 每次 $" / $* 分钟。灭活后再加入 $". 的甘油进 行保护， 即成为出血病灭活疫苗， 并放入 # %, 冰箱 中保存备用。 & 灭活疫苗的检验 将制备好的 &+$ 无菌检验 按成品检验有关规定， 灭活苗随机抽取数瓶， 混合后， 用接种环蘸取混合液 分别接种于不同的培养基上， 在有氧、 微氧、 无氧的 不同条件下， &’, 恒温箱培养 %- / ’! 小时分别进行 观察， 无细菌生长。 &+! 安全检验 选 &+!+$ 毒性检验 用 %+$ 无菌检验后的混合液， 健康无病、 无外伤， 根 * / $" 厘米的幼龄草鱼 &" 尾， 据大 小 每 尾 腹 腔 注 射 "+& 毫 升， 注 射 后 "+*、 $+"、 结果 &" 尾 !+"、 %+"、 (+"、 $!、 !% 和 %- 小时进行观察， 均无中毒发病和死亡现象， 全部健活。 &+!+! 不同剂量的安全性观察 选健康无病长约 随机分为 * 组 （分 $" 厘米左右的幼龄草鱼苗 $"" 尾， 别为 1、 ， 每组 !" 尾。用出血病灭活苗 2、 3、 4、 5 组） 进行腹腔注射， 每组注射剂量依次为 "+$67、 "+!67、 水温控 "+&67、 "+%67、 "+*67。注射后进行室内饲养， 制在 !’, 左右， 观察 $% 天。结果五组均无发病和死 亡现象， 全部健活。见表 $。
草鱼出血病细胞培养灭活疫苗生产工艺的比较
表3 几种疫苗制备工艺的经 济效益比较
制备工艺
生产 周期 ( 天)
一次 生产1L 疫苗所
生产量 需培养液成本
( L)
( 元)
方瓶法 14～18 0. 3
76. 00
转管法 14～18 1～1. 5 16. 48～23. 92
反应器法 14～18 24～30 9. 26～11. 18
操作 控制 条件
人工
College of V et erinary M ed icine, N anjing A gricult ure U nivers it y, N anj ing 210095
Abstract Each of t he 121 A eromonas hy dr op hil a st rains w ere cult ured o n each of t he t hree select ive m edium s, AHM ( A eromonas hyd rop hi la M edium ) , A PM ( A er omonas Py razinam idase A ct ivity M edium ) and RS( Rimler-Sho tt s Medium ) . T he rat e of detection by t he three mediums w as 54. 76% , 81. 33% and 83. 54% respect iv ely . T he st rains w hose ox idase w ere posit iv e in AHM or RS may be prelim inary ly ident if ied as Ah. AHM and RS w er e recom mended f or ident ification of Ah str ains fr om clinic samples. key words A eromonas hy dr op hil a, Select ive cult ures, Com parison
草鱼出血病及其疫苗研究进展
草鱼出血病及其疫苗研究进展作者：王强汪开毓来源：《南方农业·下旬》2014年第12期摘要草鱼（Grass carp）是我国淡水养殖的四大家鱼之一，养殖范围广，经济价值高。
但在草鱼养殖饲养过程中，易发生各种疾病，给草鱼养殖业带来巨大损失。
其中，草鱼出血病是影响草鱼养殖的重要疾病之一，其病原为草鱼呼肠孤病毒。
对于该病国内目前对其做了大量研究，化学药物难以达到治疗目的而免疫技术在该疾病的防治上取得了一定成就。
基于此，首先总结了近年来关于草鱼出血病的研究，着重阐述草鱼出血病的病原生物学特征以及流行病学相关情况；而后就国内目前草鱼出血病疫苗研究情况做一介绍并提出该病防治的新展望。
关键词草鱼出血病；草鱼呼肠孤病毒；流行病学；疫苗中图分类号：S941.41+1 文献标志码：A 文章编号：1673-890X（2014）12--4草鱼（Grass carp）属鲤形目，鲤科，雅罗鱼亚科，草鱼属。
一般喜居于水的中下层和近岸多水草区域，性活泼，游泳迅速，为典型的草食性鱼类。
因其生长迅速，饲料来源广，是中国淡水养殖的四大家鱼之一。
但是在草鱼饲养过程中易发生各种疾病，其中草鱼出血病是一种最为常见的草鱼疾病，这种疾病严重应先我国草鱼养殖业的发展[1]。
早在20世纪70年代我国就开始研究草鱼出血病，80年代发现草鱼出血病病源——病毒颗粒[2-3]，90年代初国际病毒分类委员会将草鱼出血病病源命名为草鱼呼肠孤病毒（Grass carp reovirus，GCRV）[4]。
草鱼出血病病毒主要侵染草鱼的内脏组织，而化学药物难以达到治疗目的，目前仍然没有找到一种效果良好的特效药。
但是，从免疫系统角度出发研究此病，能够在水产养殖疾病方面取得一些进展[5]。
随着生物制剂技术的发展，免疫接种疫苗能够有效地减少疾病的发生。
故探讨草鱼出血病流行病学特征以及草鱼出血病疫苗的研制情况对于草鱼出血病的预防，减少草鱼养殖业中的经济损失非常重要。
酵母展示草鱼出血病疫苗及其制备方法的制作方法
本技术公开了一种利用酵母表面展示技术制备的草鱼出血病疫苗，涉及基因工程疫苗制备。
该疫苗通过糖基化基因敲除后的酿酒酵母细胞EBY100△Mnn9表面展示GCRV-VP7蛋白制备。
酿酒酵母是真核的表达系统，其表达的病毒外壳蛋白会经过糖基化修饰，能诱导草鱼免疫系统产生病毒中和抗体。
本技术的优点在于：本技术所使用的糖基化缺失酵母菌株EBY100△Mnn9可以有效去除酵母表面蛋白超糖基化，从而避免GCRV-VP7抗原被掩盖而导致疫苗效率缺失和下降的问题；由于酵母细胞培养简单，生产廉价，可以大规模低成本生产草鱼出血病疫苗。
技术要求1.一种酵母展示草鱼出血病疫苗，其特征在于，该疫苗为表面展示GCRV-VP7蛋白的EBY100△Mnn9酵母细胞。
2.制备权利要求1所述的一种酵母展示草鱼出血病疫苗的方法，其特征在于，该方法包含下列步骤：a、用玻璃珠破碎Mnn1基因敲除的酿酒酵母BY4741△Mnn1酵母细胞壁，用苯酚和氯仿从酵母细胞裂解液中抽提基因组DNA；b、设计一对长引物，上游引物F9的序列为：GAATTTAAAAGAGCTAGAATAAAAAGTTAGGAAACAATGCGGATCCCCGGGTTAATTAA，下游引物R9的序列为：AACGCTATAGCTTCTGTATGCTTTTTGCTCAGTTGCTCAGAATTCGAGCTCGTTTAAAC，用该对引物从BY4741△Mnn1酵母基因组中扩增出含有Mnn9基因同源臂序列的KanMAX抗性基因片段；c、用醋酸锂法将扩增出的含有Mnn9基因同源臂序列的KanMAX抗性基因片段转化到EBY100酵母菌中，含有Mnn9基因同源臂序列的KanMAX抗性基因片段与EBY100酵母中的Mnn9基因发生同源重组，从而敲除Mnn9基因，并替换为KanMAX基因，然后用PCR和测序的方法确定Mnn9基因成功敲除，获得EBY100△Mnn9酵母细胞；d、用上游引物VP7-F和下游引物VP7-R从pR/GCRV-VP7质粒上扩增GCRV-VP7基因，上游引物VP7-F序列为：CCGGGATCCATGCCACTTCACATGATTCC；下游引物VP7-R序列为：CCGCTCGAGATCGGATGGCTCCACATGCA，将扩增出的GCRV-VP7基因片段连接到pMD18-T 载体中，用限制性内切酶切下GCRV-VP7基因，再连接到pYD1质粒中，构建重组质粒pYD1-VP7；e、将pYD1-VP7重组质粒通过醋酸锂法转入EBY100△Mnn9酵母细胞，培养并用半乳糖诱导该酵母细胞，通过流式细胞术确认GCRV-VP7蛋白展示到EBY100△Mnn9酵母细胞表面，该酵母细胞即为酵母展示草鱼出血病疫苗；f、用表面展示有GCRV-VP7蛋白的EBY100△Mnn9细胞经腹腔注射的方式免疫BALb/c小鼠，三次免疫结束后，抽取小鼠血液制备抗血清；g、用小鼠抗血清在CIK细胞上测试血清对GCRV病毒的中和能力，结果显示该抗血清对GCRV-873病毒具有中和作用，表明酵母表面展示的GCRV-VP7蛋白诱导小鼠产生了能中和病毒的抗体，可用作疫苗用于草鱼出血病防治。
草鱼出血病及其防治技术
草鱼出血病及其防治技术摘要介绍了草鱼出血病的起源、流行规律及诊断方法，并阐述了草鱼出血病的防治技术。
关键词草鱼出血病；诊断方法；防治技术草鱼是我国重要的淡水养殖鱼类之一，但是其多病、成活率低的特点严重制约了其发展。
尤其是草鱼出血病，发病快、流行广、死亡率高，是危害草鱼最为严重的病毒性疾病，常给养殖者造成重大的经济损失。
因此，草鱼出血病的防治工作十分重要。
1草鱼出血病及其病原1.1草鱼出血病病毒的起源早在1953年，倪达书等就注意到具有出血症状的草鱼病鱼。
1978 年，中国科学院水生生物研究所第三研究室的科研人员首先报道了草鱼出血病是一种病毒性鱼病，并初步认为其病原是一种疱疹病毒（Herpsvirus）。
1983年，陈燕新等用分离病毒的方法从病鱼组织中得到的滤液感染草鱼，获得典型的出血症状并能在单层细胞中传代繁殖，才正式确定草鱼出血病是由病毒引起。
1984年，中国科学院武汉病毒研究所和中国水产科学研究院长江水产研究所草鱼出血病研究协作组在对草鱼出血病病毒进行分离和精细结构核酸特性研究之后，首次确定该病原为鱼呼肠孤病毒（Fish Reovirus）。
1995年，病毒分类命名委员会对该病毒正式命名为草鱼呼肠孤病毒（Grass Carp Reovirus，GCRV）。
该病毒隶属呼肠孤病毒科（Reoviridae）水生呼肠孤病毒属（Aquare-ovirus），是我国分离的第1种鱼类病毒。
1.2草鱼呼肠孤病毒的生物学特性草鱼呼肠孤病毒为正二十面体，直径为65~72nm，具双层衣壳。
病毒核心具有RNA聚合酶，酶活最适温度28℃。
病毒耐酸（pH3），耐碱（pH10），耐热（56℃）。
病毒在敏感细胞上能产生明显的合胞体状细胞病变效应（CPE）。
1.3草鱼呼肠孤病毒的致病机理草鱼鱼种感染GCRV后，在潜伏期和发展期，鱼体红血球、血浆总蛋白、血和尿素氮明显减少，病鱼乳酸脱氢酶（SLDH）同工酶紊乱。
各脏器小血管内皮广泛受损，引起弥散性血管内凝血并形成微血栓，导致循环血量大为减少，使正常代谢发生障碍，导致脏器组织病变。
草鱼呼肠孤病毒出血病及疫苗注射方法
体在养殖池内麻醉清醒的时间，清醒时间过长应及时调整麻醉环节的时间。
初始注射期间随机抽取10尾已接种的鱼，解剖观察注射部位是否正确，是否出现出血症状，内脏是否有损伤，观察疫苗在腹腔内的分布。
注射部位如果出现错误应及时对相关操作人员进行修正，注射部位如果出现出血、内脏出现损伤等症状，应及时更换注射针头和修正相关人员注射操作。
三、疫苗接种后疫苗接种后因应激反应，鱼的行为与摄食会受到一定的影响，出现不聚群、摄食状态差等症状，为了降低应激反应，疫苗注射后应停食两天，开始投喂后饵料中应添加多维素等抗应激药物，正常摄食一般在两周后可恢复。
枫叶鲑在疫苗注射后每隔1个月，抽取10尾解剖检测疫苗在腹腔中的残留状态和粘连状态，并抽取血液样本检测抗体效价。
四、讨论所用疫苗必须是使用成熟工艺制备而成，才能保证疫苗对受体起到理想的保护效果。
疫苗注射过程中麻醉时间不能过长，本次疫苗注射死亡的142尾全部因麻醉时间过长致死，麻醉受体的时间和每次麻醉箱内受体的数量要把握适当，才能使疫苗注射操作快而稳地进行。
疫苗注射的剂量通常大于受体所需产生免疫的剂量，每尾每针定在0.1毫升，以满足受体所需剂量。
疫苗注射的速度主要跟注射人员的技术、集鱼速度和麻醉速度有关，一个有经验的技术人员每尾注射所需的平均时间约2.5秒，即约1500尾/时，综合集鱼、麻醉与注射各环节的衔接，接种疫苗个人平均速度约为600尾/时。
受体注射疫苗后自身可产生相应的免疫力，当有相应的病原体入侵受体时会自动免疫，对受体产生很强的保护。
本次注射枫叶鲑3万尾左右，未注射疫苗7000尾左右，从养殖至销售完毕16个月，产出成品鱼2.7万尾左右，注射疫苗组死亡3000尾左右，未发现因杀鲑气单胞菌致死病体，未注射疫苗组全体死亡，其中因杀鲑气单胞菌致死为5500尾左右，致死率为78.6%。
可以看出，疫苗在保护枫叶鲑对杀鲑气单胞菌的免疫防治过程中起到很理想的免疫效果。
济宁市是我国北方重要的淡水渔业大市，各类宜渔水利资源非常丰富，渔业经济在全市农业经济中占有较高比重，而其中草鱼作为一种优质大宗淡水鱼类品种，在我市渔业生产中占有举足轻重的地位。
草鱼夏花浸泡疫苗的注意事项
草鱼夏花浸泡疫苗的注意事项
草鱼夏花浸泡疫苗，是国家最新研究成果。
其（用途）主要预防草鱼出血病，对细菌性烂鲤、肠炎、赤皮也有一定的效果。
用法用量：增效剂（粉末状）用500克沸水冲泡15-20分钟，冷却后与另一包药剂（糊状）混合，在加入50公斤清洁塘水，稀释即为使用疫苗。
可浸泡夏花鱼种5公斤，浸泡时间为10~15分钟。
保质期：避光冷藏，有效期为6个月（生产日期见封口）。
注意事项：
1、本品以可以用于水花鱼苗（每袋疫苗可浸泡5~6万尾）；
2、夏花鱼种须经过拉网上箱锻炼；
3、浸泡时宜加入少量增氧剂慎防鱼种缺氧浮头；
4、操作宜在半晚时分阴凉处进行；
5、细菌及寄生虫鱼病尚需进行药物预防。
草鱼注射出血病灭活疫苗的试验报告
草鱼注射出血病灭活疫苗的试验报告
李秀瑜
【期刊名称】《福建水产》
【年(卷),期】1984(000)002
【摘要】草鱼饲料来源广，生长速度快，经济价值高，所以养殖草鱼的经济效益大，但草鱼多病，在成鱼养殖阶段，易受细菌性烂鳃、肠炎和赤皮病等“三病”的危害，养殖成活率一般只达30—60%。
且有时因防治不及时，导致大量死亡，使单产大幅度下降。
【总页数】5页(P41-45)
【作者】李秀瑜
【作者单位】闽侯县水产技术推广站
【正文语种】中文
【中图分类】S943
【相关文献】
1.草鱼出血病冻干细胞疫苗与三联灭活疫苗在草鱼精养中的应用研究 [J], 林明辉;刘春花;陈道印;黄志斌;陈德闻
2.草鱼出血病灭活疫苗注射治疗草鱼出血病试验 [J], 郑斌
3.草鱼出血病注射免疫技术推广试验报告 [J], 刘名镇
4.注射同源性草鱼出血病土制灭活疫苗效果好 [J], 李光照
5.草鱼“三病”多联灭活疫苗注射防病试验报告 [J],
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一种草鱼出血病口服型疫苗及其制备与用途[发明专利]
![一种草鱼出血病口服型疫苗及其制备与用途[发明专利]](https://img.taocdn.com/s3/m/c08bec3e7f1922791788e87d.png)
专利名称：一种草鱼出血病口服型疫苗及其制备与用途专利类型：发明专利
发明人：余新炳,姜红烨,林志鹏,周心怡,边青
申请号：CN201810949894.7
申请日：20180820
公开号：CN109053900A
公开日：
20181221
专利内容由知识产权出版社提供
摘要：本发明属于生物技术领域，具体涉及一种草鱼出血病口服型疫苗及其制备与用途。
本发明首先提供一种融合蛋白，含有枯草芽孢杆菌芽孢衣壳蛋白CotC和草鱼呼肠孤病毒VP4蛋白，所述草鱼呼肠孤病毒VP4蛋白的氨基酸序列对应于如SEQ ID NO.8所示核苷酸序列所编码的氨基酸序列。
采用所述融合蛋白制备成的口服疫苗，具有制备工艺简单、成本低，口服疫苗方便使用等优点，同时避免注射免疫方案中捕捞鱼和注射对鱼体的损伤。
且较已有疫苗对鱼体抵抗草鱼出血病具有更好免疫保护效果。
申请人：中山大学
地址：510275 广东省广州市新港西路135号
国籍：CN
代理机构：上海光华专利事务所(普通合伙)
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