转基因方法

转基因方法
一、基因枪法：
1、综述：
基因枪法又称为高速微弹法、微粒抢法、微粒轰击法，是由康奈尔大学的Sanford等于1987年首次研制出的火药引爆基因枪，并与该校工程技术专家Wolf及Kallen合作研究出的一种基因转移的新方法。

1990年美国杜邦公司推出商品基因枪PDS-1000系统。

在此期间，高压放电、压缩气体驱动等各种基因枪相继出现，并都在重复的实践中得到改进和发展。

其改进的核心是粒子加速系统，以提高射弹的可控度，即粒子速度和射入的浓度等。

2、基本原理：
其基本原理是将外源DNA包被在微小的金粒或钨粒表面，然后在高压的作用下微粒被高速射入受体细胞或组织。

微粒上的外源DNA进入细胞后，整合到植物染色体上，得到表达，从而实现基因的转化。

根据基因枪的动力系统，可将它们分为三种类型：一类是以火药爆炸力为加速动力，其显著特征是塑料子弹和阻挡板。

塑料子弹前端载放已沉淀有DNA的钨金粉。

当火药爆炸时，塑料子弹带着钨金粉向下高速运动，至阻挡板时，塑料子弹被阻遏，而其前端的钨金粉粒子继续以高速向下运动，击中样品室的靶细胞。

其粒子的速度主要是通过火药的数量及速度调节器控制，不能做到无级调整，可控度较低。

第二类是以高压气体作为动力，如以氦气、氢气、氮气等。

其工作原理是把载有DNA 的钨金粉喷洒在一张微粒载片上，电极间悬滴众着微水滴。

在压缩空气的冲击下，微水滴雾状喷射，驱动载片。

当载片受阻于金属筛网时，载有DNA的钨金粒继续向下冲击射入细胞。

第三类是以高压放电为驱动力。

其最大优点是可以无级调速，通过变化工作电压，粒子速度及射入浓度可准确控制，使载有DNA的钨金粉粒子能到达具有再生能力的细胞层。

3、步骤：
（1）微粒体的洗涤。

取60-100mg钨或金粉，溶于1ml无水乙醇中，用超声波振荡洗涤。

微粒体处理后可在密闭条件下室温贮存一周。

离心除去乙醇，密闭贮存于室温中，备用，保存时间不要超过一周。

（2）DNA微粒载体的制备。

（3）靶外植体材料准备。

在无菌条件下截取靶外植体，放于样品皿中，外植体大小按基因枪要求选择；在无菌条件下把靶外植体放入基因枪的样品室，并对准子弹发射中心。

（4）DNA微弹轰击，按照不同的基因枪说明书操作。

（5）轰击后外植体的培养。

DNA微弹轰击后立刻转入相应的培养基中培养，以免材料脱水加重细胞受伤害的程度，获得再生植株。

4、影响因素：
（1）基因枪轰击参数，如基因枪类型、氦气压力、基因枪真空度、包裹金属粒子类型、金属粒子大小、载体膜位置、靶材料位置轰击次数、微粒加速装置参数等都会影响转化效率的高低。

其中金属粒子以金粒效果最好、94.92kPa左右的氦气真空度为佳。

（2）转化质粒的参数，如转化质粒的纯度要高、且浓度不宜过大。

加入一定量的氯
化钙与亚精胺对质粒的包被有促进作用。

（3）转化材料的类型。

对于不同物种，它都有其适应的转化材料，如水稻胚性愈伤组织和配型悬浮系细胞的基因枪转化效率要高于幼胚的转化效率。

（4）启动子、选择培养基类型等，其中启动子是调节外源基因在转化细胞中表达的重要因素，不同启动子调控的基因在受体材料中的表达水平差别很大。

5、优缺点：
优点：
（1）无宿主限制，对双子叶和单子叶植物以及动物和微生物都同样适用。

（2）靶受体类型广泛。

基因枪技术可以选用易于再生的受体，绕过原生质体再生的困难。

它不仅以原生质体、叶圆片为靶受体，而且悬浮培养细胞，茎或根切段以及种子胚、分生组织、幼穗、愈伤组织、花粉细胞等几乎所有具有潜在分生能力的组织或细胞都可用基因枪进行转化。

（3）可控度高。

近代的高压放电或高压气体可调控微弹的速度和射入的浓度，可以较高的命中率把DNA微粒载体射入特定层次的细胞。

（4）操作十分简便快速。

缺点：
（1）转化效率低，多在0.1%-1%之间，这就增加了选择难度；
（2）仪器设备昂贵，转化费用高；
（3）不易获得再生植株。

6、应用前景：
（1）植物基因转化：
目前已有十几种植物采用了此技术获得了转基因植株，如小麦、玉米、水稻等，显示了其广阔的前景。

近年来，多基因转化是一个新亮点，由于基因枪法转化容量大，一次能导入12-14个不同质粒，因而被认为是实现多基因转化的较理想的方法。

（2）将外源基因导入植物细胞的细胞器
在植物细胞中有三套遗传系统，即在细胞核、线粒体、叶绿体中都有自己的遗传物质。

它们相互调节，共同调控者细胞的生命活动。

细胞器的遗传系统同样具有重要作用，因此通过细胞器的基因转化改造生物同样是一条可行的途径。

现已证明基因枪法可将外源基因导入细胞器，并能得到稳定表达，因此，基因枪为细胞器的基因转化开拓了一片新领域。

（3）植物基因表达调控研究：
利用基因枪技术为外源基因导入特定组织提供了可能，因此可以用于研究植物的发育及调控。

如果把外源的特定基因导入不同的细胞或不同发育时期，则可以研究其基因表达的特点。

二、脂质体介导基因转化法：
1、综述：
脂质体法是用脂类化学物质包裹DNA成球体，通过植物原生质体的吞噬或融合作用把内含物转入受体细胞。

Deshayes等用脂质体包裹带有卡那霉素抗性嵌合基因的大肠杆菌质粒，用PEG诱导脂质体与烟草原生质体融合。

实验成功地从转化原生质体获得再生植株。

这一成功例子，为基因转化建立了新的方法。

2、基本原理：
脂质体是根据生物膜的结构功能特性合成人工膜，然后把DNA包裹在人工膜内。

反相蒸发法制备脂质体的原理，是在溶于有机溶剂的磷脂中加入核算水溶液。

磷脂即以其亲水基朝向水相，疏水的尾链伸向有机相而整齐地排列在两相界面上，经超声波处理后，在有机相中形成包有DNA水溶液的囊泡，通过减压蒸馏有机溶剂，并加入水溶液后即可形成包含有DNA的脂质体。

将脂质体与原生质体在适当的培养基中混合，通过原生质体的吞噬或融合可将外源DNA导入受体细胞。

为了避免在包裹DNA时超声波和有机溶剂对DNA的损伤，通常使用去垢剂透析法制备脂质体，也有人使用反相蒸发法。

3、步骤：
（1）用反相蒸发法制备脂质体，常用的脂类是牛脑磷脂酰丝氨酸和胆固醇。

（2）RNA和DNA核算制备。

（3）脂质体纯化。

（4）脂质体-原生质体保温培养转化。

（5）转化原生质体选择培养。

4、影响因素：
（1）脂质体的制备类型、方法均有明显差异；
（2）PEG的浓度、加入时间、pH值及Ca离子浓度均起到重要作用；
(3)保温培养及转化时的条件。

5、优缺点：
优点：方法简便、重复性好、对多种类型的细胞有效，而且包装容量大、安全性高。

缺点：有时大部分DNA会被溶酶体降解，所以效率不高。

6、应用前景：
近年来，美国BRL公司推出一种新型脂质体即转化脂，只要把转化脂与DNA简单的混合，即可形成转化脂与DNA的复合体，把DNA包裹在脂质体内，并可有效地转化动植物细胞。

此方法不仅可明显提高转化率，而且由于有商品出售，减少耗时，简便快捷，因此，脂质体介导转化原生质体法是值得广泛试用的一种转化方法。

脂质体在介导植物病毒RNA的转化方面应用更多，并取得重要进展。

脂质体在包裹植物病毒裸露的RNA后，与原生质体在特定的融合条件下保温，可获得较高的感染率。

此外，用脂质体转染可以大大降低核算的用量，TMV-RNA的用量可以从50ug降到5ug，使体外转录体的应用变为可能，具有很高的实用价值。

三、电激法介导基因转化：
1、综述：
电激法是利用高压电脉冲作用在原生质体膜上“点激穿孔”，形成可逆的瞬间通道，从而促进外源DNA的摄取。

此方法在动物细胞中应用较早并取得很好效果，李宝健等于1985年首次将其应用于植物细胞的基因转化。

现在这一方法已被广泛应用于各种单、双子叶植物中，特别是在禾谷类作物中更有发展潜力。

2、基本原理：
细胞膜主要由脂类组成，每一个脂质分子有极性的头部和疏水的尾部。

因此细胞膜可视为一个电容，当细胞处于一个外加电场中时，膜电位增高，最高部位与电场作用方向之间的夹角成正比，随着E的不断增加，V也不断升高，于是膜被压缩变薄。

当V升高到一定值时膜被击穿形成微孔，此电压称之为击穿电压。

如果电场强度不再继续增加，膜孔数量少，孔径小，间隔一段时间后即可复原，称之为“可逆击穿”。

相反，如果电场强度继续增加，膜上的穿孔区域增大，数量增多，孔径增大，最后引起“不可逆击穿”。

电激处理时输出脉冲电压波形有两种：一种是指数波，一种是方波。

方波脉冲的电场强度在整个脉冲的持续期内均保持恒定；而指数波脉冲持续期内由于使用电容进行辉光放电，从高于膜击穿电压呈指数下降到低于膜击穿电压，在使用方波时，E和t都能确定，而且由于方波脉冲所使用的E始终高于Ec，故一般采用短期多次处理。

在使用指数波时，E和t则难以确定，而且指数波脉冲的E高于Ec的时间极为短暂，故一般多采用长时间一次性脉冲，随后约有10分钟的收敛阶段。

具体情况需据仪器而定。

3、步骤：
（1）分离的原生质体加入电击缓冲液重悬，并离心3分钟去掉上清液，再加入适量的电击缓冲液，计数，调节原生质体密度；
（2）加入质粒DNA和样品DNA，混合后分装于电击反应槽内；
（3）冰浴5分钟；
（4）选择不同参数电击；
（5）冰浴10分钟；
（6）离心3分钟除去电击缓冲液，用液体培养基洗涤；
（7）将原生质体包埋于固体培养基中，28度黑暗条件下选择培养。

4、影响因素：
（1）电击的处理方式对转化率起决定作用，一般是用高电压，短时间处理；
（2）电击法中使用的电场强度、波形及处理时间对转化率也有重要影响，在一般情况下增加场强，延长脉冲持续时间能提高转化率，但也要考虑原生质体的存活率；
（3）PEG存在时对转化率有促进作用；
（4）原生质体所处的介质成分同样有重要作用，原生质体应悬浮在便于进行电击的具有特定电阻的盐溶液中，一般采用电击缓冲液；
（5）pH值、Ca离子浓度等都对转化率有影响，另外还要注意植物的种类。

5、优缺点：
优点：操作简便，DNA转化效率高，特别适于瞬时表达的研究。

缺点：会造成原生质的损伤，使植板率降低，且仪器也较昂贵。

6、应用前景：
近年来，人们已可以通过电击法直接在带壁的植物组织和细胞上打孔，然后将外源基因直接导入植物细胞，使用该技术可以不制备原生质体，提高了植物细胞的存活率，而且简便易行，现已在水稻上获得转基因植株。

四、花粉管通道法：
1、综述：
在授粉后向子房注射含目的基因的DNA溶液，利用植物在开花、受精过程中形成的花粉管通道，将外源DNA导入受精卵细胞，并进一步地被整合到受体细胞的基因组中，随着受精卵的发育而成为带转基因的新个体。

该方法于80年代初期由我国学者周光宇提出，我国目前推广面积最大的转基因抗虫棉就是用花粉管通道法培育出来的。

该法的最大优点是不依赖组织培养人工再生植株，技术简单，不需要装备精良的实验室，常规育种工作者易于掌握。

2基本原理：
花粉管通道法的主要原理是授粉后使外源DNA能沿着花粉管渗入，经过珠心通道进入胚囊，转化尚不具备正常细胞壁的卵、合子或早期胚胎细胞。

这一技术原理可以应用于任何开花植物。

3、步骤：
（1）外源DNA制备：
a、从植物提取DNA：取供体植物的幼叶、幼穗等为试材，提取总DNA，然后进
行纯化和酶切，之后制备DNA导入液；
b、从细菌中提取质粒DNA：已构建的中介载体一般克隆在大肠杆菌中，因此可
以直接从大肠杆菌中提取质粒DNA，并酶切后制备DNA导入液；
c、从农杆菌中提取已重组构建的Ti质粒，并酶切后制备DNA导入液；
（2）分析受体植物受精过程及时间，确定导入外源DNA的时间及方法。

（3）外源DNA导入受体植物：
方法一：柱头涂抹法未授粉前，先用DNA导入液涂抹柱头，然后人工授粉，迅速套袋。

方法二：花粉粒吸入法提前去雄套袋隔离，花粉粒首先用DNA导入液处理，使外源DNA吸入花粉粒，然后对受体植物进行人工授粉套袋。

（4）后代材料处理：
经外源DNA处理获得的种子与供体、受体植物的子代点播在同一试验田，进
行田间试验。

4、影响因素：
（1）受体植物的受精过程及时间规律是花粉管导入的关键因素，要精确掌握，才能达到外源DNA导入的目的。

（2）DNA导入液的浓度、pH值等均影响转化率。

（3）DNA的分子结构及其片段大小对转化率也有重要影响。

环状分子难以转化，大片段DNA转化率低，片段太小不能保证完整基因存在，因此要使用适宜的DNA
片段。

5、优缺点：
优点：（1）利用整体植株的卵细胞、受精卵或早期胚细胞转化DNA，无需细胞、原生
质体等组织培养和诱导再生植株等一整套人工培养过程。

(2)方法简便，可以大田、盆栽或温室中进行。

（3）单胚珠和多胚珠的单双子叶植物均可应用。

（4）缩短了育种时间。

（5）可以任意选择品种进行外源DNA的导入，达到目的性状基因的转移。

可以保留受体的优良性状，无需顾虑体细胞变异的问题。

缺点：
（1）筛选到的子代可能带入少量目的性状基因以外的DNA片段。

（2）这一技术局限于开花时间才能应用。

（3）如果是不受单基因或单片段DNA控制的多基因性状，则不能或很难通过这一技术导入植物。

6、应用前景：
该技术的建立开创了整株活体基因转化的新途径，近年来又有了很大发展，应用前景广阔。

五、农杆菌介导法：
1、综述：
农杆菌是普遍存在于土壤中的一种革兰氏阴性细菌，它能在自然条件下趋化性地感染大多数双子叶植物的受伤部位，并诱导产生冠瘿瘤或发状根。

根癌农杆菌和发根农杆菌中细胞中分别含有Ti质粒和Ri质粒，其上有一段T-DNA，农杆菌通过侵染植物伤口进入细胞后，可将T-DNA插入到植物基因组中。

因此，农杆菌是一种天然的植物遗传转化体系。

人们将目的基因插入到经过改造的T-DNA区，借助农杆菌的感染实现外源基因向植物细胞的转移与整合，然后通过细胞和组织培养技术，再生出转基因植株。

农杆菌介导法起初只被用于双子叶植物中，近年来，农杆菌介导转化在一些单子叶植物（尤其是水稻）中也得到了广泛应用。

2、基本原理：
农杆菌含有Ti质粒，是较好的基因克隆载体。

农杆菌附着到植物细胞后，留在细胞间隙中。

T-DNA首先在细菌中被加工，剪切、复制，然后转入植物细胞。

3、步骤：
（1）把含目的基因的外源DNA插入到Ti质粒的T-DNA区，构成重组的质粒分子；（2）将重组型质粒转化给大肠杆菌细胞；
（3）通过细菌的结合作用，含外源DNA的重组型质粒从大肠杆菌转移到农杆菌，并与其固有的Ti质粒发生同源重组，外源DNA转移到固有的Ti质粒上；
（4）将农杆菌直接接种在植物的伤口部位或通过植物原生质体共培养方法转化植物细胞；（5）培养转化的细胞或组织再生出转基因植株。

4、影响因素：
（1）植株基因型、年龄是否合适；
（2）质粒中virG拷贝数的多少也会造成影响；
（3）农杆菌进入植株的方式。

5、优缺点：
优点：
（1）该转化系统利用了天然的转化载体系统，成功率高，效果好；
（2）在所有的转化系统中，农杆菌Ti质粒转化系统是机理研究的最清楚的，方法最成熟，应用最广泛；
（3）Ti质粒的T-DNA区可以容纳相当大的DNA片段插入；
（4）整合进植物基因中的T-DNA及插入其间的外源基因不仅能在植物细胞中表达，而且可根据人们的需要连接不同的启动子，使外源基因能够在再生植株的各个
组织器官中特异性表达；
（5）农杆菌Ti质粒转化系统转化的外源基因以单拷贝为多，遗传稳定性好，转基因植株能较好地为育种提供中间选育材料。

缺点：
该技术主要应用于双子叶植物，应用范围较窄。

6、应用前景：
目前利用农杆菌Ti质粒转化系统已获得许多转基因植物。

1983-1994年由农杆菌转化成功地植物达116种，在植物抗病、抗虫、抗除草剂和改良植物果实品质等方面都已获得不少转基因植物，有的已应用于生产，为提高作物产量、抗逆能力、优质高产良种选育提供了一条诱人的全新途径，显示了潜在的美好前景。