不可忽视的转膜和封闭 WesternBlot专题_经验篇
western blot经验
根据自己的实验体会，总结做好WB的一些心得，与大家分享，不当之处欢迎批评指正。
叙述的思路就是围绕着实验的每个步骤展开，这样可能更具体些。
1．配胶: 该部分较为重要的是配制凝胶时要充分混匀，此外应保证试剂的新鲜。
常出现的问题有：A.凝胶出现花纹：此时应检查原料中过硫酸铵（AP）粉末是否受潮B.凝胶聚合时间较长：聚合时间由AP以及TEMED决定，通常在30min左右，AP不新鲜会导致聚合变慢：此外还需注意环境的温度也很重要，气温较低时胶是会凝得慢一些，必要时可适当增加AP以及TEMED的量，但通常不会超过1h，若超过1h甚至更长仍未聚合，应检查配制的操作有无错误。
2．处理蛋白样品：该部分蛋白样品本身很关键，若蛋白提取过程存在问题或蛋白发生降解则很难进行好之后的实验，也就很难做出好的结果了；除此之外loading buffer的作用也不容忽视，切莫使用不新鲜的上样缓冲液，同时在处理时将样品与loading buffer混合均匀也应注意。
3．电泳:首先在跑积层胶时应尽可能使样品压齐，若上样量较大（如细胞蛋白通常上样在20-30甚至40ul）,可适当减小电压跑20-30min，待压齐后方可开始分离。
4．转膜:该环节电流的大小，转膜的时间决定是否能成功将蛋白转上，而具体的参数应取决于所要蛋白的分子量大小，应反复摸索，本人在实验中得出的经验为：10KDa:200mA 1h; 60KDa 70V,2h；90KDa 70V,4h；200KDa 70V,6h. 此外还有如下几个细节问题需要注意：A.膜的选择：PVDF还是NC,0.22μm还是0.45μmB.转膜液中甲醇的量：通常在10%-20%，蛋白分子量较大时可适当减少，蛋白分子量小时应适当增加，建议先从15%开始。
5．封闭:该步骤一般不易出现问题，常见的有室温2-3h，或者4度封闭过夜，但仍需强调一点的是有些抗体的使用需配套使用特殊的封闭液。
6．一抗孵育:通常购买到一种新抗体后，还是建议先按说明书推荐的浓度比例在室温孵育2-3h, 若该抗体效价较好，应该显带很漂亮，尤其是在抗体刚买时间不长，然而事情往往不能尽如人意，我们在遇到一个不好的抗体时该怎么办？可通过延长孵育时间（如：4度过夜孵育甚至室温过夜孵育），增大抗体浓度，如果你想尽了一切可能结果仍然很不理想，建议还是换抗体吧，不要再浪费时间与精力了。
Western-Blot-原理和操作方法(全)要点
Western Blot 原理和操作方法（全）工作原理蛋白质的电泳分离是重要的生物化学分离纯化技术之一,电泳是指带电粒子在电场作用下,向着与其电荷相反的电极移动的现象.根据所采用的支持物不同,有琼脂糖凝胶电泳,淀粉凝胶电泳,聚丙烯酰胺凝胶电泳等.其中,聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)由于无电渗作用,样品用量少(1-100μg),分辨率高,可检出10-9-10-12mol的样品,凝胶机械强度大,重复性好以及可以通过调节单体浓度或单体与交联剂的比例而得到孔径不同的凝胶等优点而受到广泛的应用.SDS-PAGE是最常用的定性分析蛋白质的电泳方式,特别是用于蛋白质纯度检测和测定蛋白质分子量.PAGE能有效的分离蛋白质,主要依据其分子量和电荷的差异,而SDS-PAGE(SDS变性不连续聚丙烯酰胺凝胶电泳)的分离原理则仅根据蛋白质的分子量的差异,因为SDS-PAGE的样品处理液是在要跑电泳的样品中假如含有SDS和巯基乙醇(2-ME)或二巯基赤藓醇(DTT),其可以断开半胱氨酸残基之间的二硫键,破坏蛋白质的四级结构,SDS是一种阴离子表面活性剂即去污剂,它可以断开分子内和分子间的氢键,破坏蛋白质分子的二级及三级结构,并与蛋白质的疏水部分相结合,破坏其折叠结构,电泳样品假如样品缓冲液后,要在沸水中煮3-5分钟使SDS 与蛋白质充分结合形成SDS-蛋白质复合物,SDS-蛋白质复合物在强还原剂巯基乙醇存在时,蛋白质分子内的二硫键被打开而不被氧化,蛋白质也完全变性和解聚,并形成榛状结构,稳定的存在于均一的溶液中,SDS与蛋白质结合后使SDS-蛋白质复合物上带有大量的负电荷,平均每两个氨基酸残基结合一个SDS分子,这时各种蛋白质分子本身的电荷完全被SDS掩盖,远远超过其原来所带的电荷,从而使蛋白质原来所带的电荷可以忽略不计,消除了不同分子之间原有的电荷差别,其电泳迁移率主要取决于亚基分子质量的大小,这样分离出的谱带也为蛋白质的亚基.样品处理液中通常加入溴酚蓝染料, 溴酚蓝指示剂是一个较小的分子,可以自由通过凝胶孔径,所以它显示着电泳的前沿位置,当指示剂到达凝胶底部时,即可停止电泳.另外样品处理液中也可加入适量的甘油或蔗糖以增大溶液密度,使加样时样品溶液可以沉入样品加样槽底部.重要参数①聚丙烯酰胺凝胶(PAG)制备原则:由于孔径的大小取决于单体和双体丙烯酰胺在凝胶中的总浓度(T)以及双体占总浓度的百分含量即交联度(C)决定的,因而制胶之前必须首先知道这两个参数.一般可以由下述公式计算:T%=(a+b)/m*100%; 和C%=a/(a+b)*100%其中: a=双体(bis)的重量;b=单体(arc)的重量;m=溶液的体积(ml)②当分析一个未知样品时,常常先用7.5%的标准凝胶制成4-10的梯度凝胶进行试验,以便选择理想的胶浓度.如果蛋白质的分子量已知,可参考下表选择所需凝胶浓度:蛋白质分子量范围(Da) 适宜的凝胶浓度(%)<10420-301×104-4×10415-204×104-1×10510-151×105-5×1055-10>5×1052-5蛋白分子量 (kDa)凝胶浓度 (%)4-40 20 12-45 15 10-70 12.5 15-100 10 25-2008③分离胶（5ml 体积）:5%的积层胶的配置：蛋白质的样品制备：蛋白质的样品制备是Western Blotting 的第一步，样品制备是关键步骤，要求尽可能的获得所有蛋白质，应注意以下问题：1：在合适的盐浓度下，应保持蛋白质的最大溶解性和可重复性。
Western Blot原理、显色分类及操作步骤
Western Blot原理、显色分类及操作步骤(2008-08-14 23:07:59)标签：western blot显色教育一、原理与Southern或Northern杂交方法类似，但Western Blot采用的是聚丙烯酰胺凝胶电泳，被检测物是蛋白质，“探针”是抗体，“显色”用标记的二抗。
经过PAGE分离的蛋白质样品，转移到固相载体（例如硝酸纤维素薄膜）上，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。
以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原，与对应的抗体起免疫反应，再与酶或同位素标记的第二抗体起反应，经过底物显色或放射自显影以检测电泳分离的特异性目的基因表达的蛋白成分。
该技术也广泛应用于检测蛋白水平的表达。
既可以定性，又可以半定量的Western是初步鉴定蛋白质最方便也是最通用的方法。
western显色的方法主要有以下几种：i. 放射自显影ii. 底物化学发光ECLiii. 底物荧光ECFiv. 底物DAB呈色现常用的有底物化学发光ECL和底物DAB呈色，体同水平和实验条件的是用第一种方法，目前发表文章通常是用底物化学发光ECL。
只要买现成的试剂盒就行，操作也比较简单，原理如下（二抗用HRP标记）：反应底物为过氧化物+鲁米诺，如遇到HRP，即发光，可使胶片曝光，就可洗出条带。
二、操作步骤：(一) 配胶1、注意一定要将玻璃板洗净，最后用ddH2O冲洗，将与胶接触的一面向下倾斜置于干净的纸巾晾干。
分离胶及浓缩胶均可事先配好（除AP及TEMED外），过滤后作为储存液避光存放于4℃，可至少存放1个月，临用前取出室温平衡（否则凝胶过程产生的热量会使低温时溶解于储存液中的气体析出而导致气泡，有条件者可真空抽吸3分钟），加入10%AP（0.7~0.8:100, 分离胶浓度越高AP浓度越低，15%的分离胶可用到0.5:100）及TEMED（分离胶用0.4:1000, 15%的可用到0.3:1000，浓缩胶用0.8：1000）即可，如室温较低可升高10%AP及TEMED浓度到《分子克隆》建议浓度。
(完整版)[原创] Western blot转膜整个过程
![(完整版)[原创] Western blot转膜整个过程](https://img.taocdn.com/s3/m/10f1108a31b765ce040814d6.png)
转膜(Trarsmembran)1 转膜的定义将电泳后分离的蛋白质从凝胶中转移到固相载体（例如NC膜）上，通常有两种方法：毛细管印迹法和电泳印迹法.常用的电泳转移方法有湿转和半干转。
两者的原理完全相同,只是用于固定胶/膜叠层和施加电场的机械装置不同.前者操作容易，转移效率高;而后者适用于大胶的蛋白转移，所用缓冲液少.2 转移膜的选择杂交膜的选择是决定Western blot成败的重要环节。
应根据杂交方案、被转移蛋白的特性以及分子大小等因素，选择合适材质、孔径和规格的杂交膜。
用于Western blot的膜主要有两种:硝酸纤维素膜（NC) 和PVDF膜。
NC膜是蛋白印迹实验的标准固相支持物，在低离子转移缓冲液的环境下，大多数带负电荷的蛋白质会与膜发生疏水作用而高亲和力的结合在一起，但在非离子型的去污剂作用下，结合的蛋白还可以被洗脱下来。
根据被转移的蛋白分子量大小，选择不同孔径的NC膜。
因为随着膜孔径的不断减小,膜对低分子量蛋白的结合就越牢固。
通常用0.45 μm和0。
2 μm两种规格的NC膜。
大于20 kD的蛋白可用0.45 μm的膜，小于20 kD的蛋白就要用0。
2 μm的膜了,如用0.45 μm的膜就会发生“Blowthrough”的现象。
PVDF膜灵敏度、分辨率和蛋白亲和力比常规的膜要高，非常适合于低分子量蛋白的检测。
但PVDF膜在使用之前必需用纯甲醇浸泡饱和1-5秒钟。
最常用于Western Blot的转移膜主要是硝酸纤维素(Nitrocellulose, NC）膜和聚偏二氟乙烯(Polyvinylidene Fluoride, PVDF)膜，此外也有用尼龙膜、DEAE纤维素膜做蛋白印迹。
尼龙膜和NC膜的特点相似，主要用于核酸杂交。
硝酸纤维素(nitrocellulose, NC）膜:NC与蛋白质靠疏水作用结合，无需预先活化,对蛋白质的活性影响小;非特异性本底显色浅；价格低廉，使用方便.但结合在NC上的小分子蛋白质在洗涤时易丢失； NC韧性较差，易损坏。
western blot实验技术要点
分离蛋白范围 >150KD
100-150KD 60-100KD 20-60KD
<20KD
两个目的蛋白分子量相差较小，可以适当降低胶浓度
03 Part Three 蛋白转印与封闭
转印技术要点
膜与滤纸要干净、保持湿润
A
发热问题 F
E
转印时间控制
凝胶不能扭曲
B
C 正负极方向问题
D
气泡问题
封闭
封闭目的 封闭试剂 封闭条件
02 Part Two SDS-PAGE电泳
基本原理
低
高
电
电
压
压
A 浓缩
B 分离
低浓度胶
高浓度胶
A
电荷 量
B
分子 量
电泳技术要点
蛋白分子量
选择合适浓 度的分离胶
样品混匀 浓缩胶足够 目的带之间分开
上样要求 浓缩与分离
试剂的纯度 缓冲液 气泡
影响电泳的 因素
胶浓度的选择
凝胶浓度 6% 8% 10% 12% 15%
03
膜的保存
TBST浸泡、4℃ 可保存1-3天
常见问题与原因分析
背景不干净
A
杂带太多 F
B 条带不均一
条带不完整 E
C 条带模糊不清
D
条带歪斜
T 谢谢观看 HANK YOU!
低温、快速操作
解
避免反复冻融
03
蛋白处理至关重要
保证浓度足够高
01
调
（细胞、裂解液的量）
浓
02
浓度测量要准
（混匀、稀释、复孔）
度
浓度调一致
03
最佳上样量经验总结
1.5mm玻璃板、10孔梳子，上样量：15-25μl 1.0mm玻璃板、10孔梳子，上样量：10-20μl 上样尽可能不超出每孔总体积的一半 内参10ug左右，即可清晰显出
WesternBlot实验经验分享，你都知道吗？
WesternBlot实验经验分享，你都知道吗？Western blot真的是让人头疼的实验，辛苦付出和完美结果不成正比的实验，是整个研究生阶段最磨练我个人忍耐力的实验，要掌握整体操作并不难，但是需要注意的细节却很多，而且，三分靠努力，七分靠运气，当你把能做的都做了的时候，能修改的条件都修改了，结果仍然是空白条带，what can I do for you?今天，小编给大家简单整理一下，自己在跑小分子蛋白和大分子蛋白时，摸索出来的经验和条件，欢迎大家积极讨论分享。
一、小分子蛋白小编当时在跑S100A4，分子量12kDa。
首先，要注意的一点就是，小分子蛋白很容易在提取的过程中降解，所以整个操作过程一定要保证在冰上低温快速充分的研磨提取，具体的裂解组织的步骤我就不说了，不过说到组织，小编想提一句，组织提蛋白有一点需要注意，就是这个蛋白在组织中的表达丰度、以及蛋白定位。
胞浆或者核内的蛋白提取方式会有不同，细胞核内的蛋白可能需要特殊的裂解液，一是通过阅读文献，清楚相同的蛋白和组织，别人的跑出来的情况如何；二是可以通过在The Human Protein Atlas网站（不懂看这个（工具篇）S5E50：航母级神器——蛋白组学结果大收录！）上查询。
1、电泳条件：a) 小分子的蛋白电泳建议选择15%分离胶，5%浓缩胶。
正常配胶时，一个迷你垂直电泳仪的配制，5ml分离胶，2ml浓缩胶，跑正常分子量的蛋白是没有问题的。
但是跑小分子蛋白，浓缩胶的长度要再长一些，最起码要保证三分之一浓缩胶，三分之二的分离胶，浓缩胶多，可以保证不同分子量的蛋白充分压缩到同一起跑线。
b) 电泳时间：浓缩胶80V，300mA 50min,分离胶120V，300mA1h10min，分离胶时间不建议太长，只要把marker跑开，能够区分开内参和小分子蛋白就好了。
我的习惯是电泳的全程也会把机器放到冰水混合物中，防止温度过高，蛋白弥散。
c) 蛋白上样量：正常分子量蛋白30ug足够，可以建议小分子量蛋白先用二倍的量60ug试一下看看。
Western_Blot专题
Western Blot
SDS：
阴离子去污剂 变性剂 氨基酸侧链与SDS充分结合形成带负电荷的蛋白质-SDS胶束。 蛋白质-SDS胶束所带的负电荷大大超过了蛋白质分子原有的电 荷量，消除了不 同分子之间原有的电荷差异。 与强还原剂一起使蛋白分子氢键、疏水键打开，使蛋白质分子线 性化。
Western Blot
Western Blot
PAGE：聚丙烯酰胺凝胶
聚丙烯酰胺凝胶(polyacrylamide gel)是由单体丙烯酰 胺(acrylamide，简称Acr)和交联剂(crosslinker)
与Lowery法相比，BCA蛋白测定方法操作更简单，试剂及其形成的颜色复合物稳定性更好，几乎没有干扰 物质的影响，灵敏度高（微量检测可达到0.5μg/ml），应用更加灵活。与Bradford法相比，BCA法的显著优 点是不受去垢剂的影响。BCA法与Lowry法都容易受到蛋白质之间以及去污剂的干扰。Bradford 法敏感度最高， 且与一系列干Lowry，BCA 反应的还原剂（如DTT，巯基乙醇）相容。但是对于去污剂依然是敏感的，其最主 要的缺点是不同的标准品会导致同一样品的结果差异较大，无可比性。
维真生物-WesternBlot实验方法及注意事项
维真生物-WesternBlot实验方法及注意事项WesternBlot实验方法及注意事项实验原理：WesternBlot印迹方法，又称为免疫印记，是将获得的蛋白质样品通过SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，对不同分子量的蛋白质进行分离，并通过转移电泳将凝胶上分离到的蛋白质转印至固相支持物（NC膜或PVDF膜）上，用抗靶蛋白的非标记抗体（一抗）与转印后膜上的靶蛋白进行特异性结合，再与经辣根过氧化物酶标记（偶联）的二抗结合，最后用ECL超敏发光液试剂检测。
如果转印膜上含有靶蛋白，经X光片曝光、显影后，则会在X-光片上出现特异性蛋白条带。
实验材料：分离胶及积层胶溶液、水饱和异丁醇、1×Tris?Cl/SDS,pH8.8 、蛋白质分子量标准混合物、1×SDS电泳缓冲液、电泳装置及夹子、玻璃板、灌胶支架、缓冲液槽等附件、0.75mm封边垫片、0.75mm样品梳子、50μl微量加样器、恒流电源常用试剂：1）30%丙烯酰胺/0.8% N,N’-亚甲丙烯酰胺将30克丙烯酰胺和0.8克N,N’-亚甲丙烯酰胺溶于总体积为60ml 水中，加热至37℃溶解之，补加水至终体积为100ml。
0.45μm 微孔滤膜过滤除菌，查证该溶液pH应不大于7.0，置棕色瓶中保存。
小心：丙烯酰胺具有很强的神经毒性并可通过皮肤吸收，其作用具有累积性。
称量丙烯酰胺和N,N’-亚甲丙烯酰胺时应戴手套和面具。
可认为聚丙烯酰胺无毒，但也应谨慎操作，因为它还可能含有少量未聚合材料。
2）4×Tris?Cl/SDS,pH8.8,在300mlH2O中溶解91g Tris碱(1.5mol/L)，用1mol/L调节pH 至8.8,补加H2O至体积500ml。
用0.45μm滤膜过滤溶液，再加入2g SDS[0.4%(w/v)]，于4℃可保存1月。
3）4×Tris?Cl/SDS,pH6.8,在40mlH2O中溶解6.05g Tris碱(0.5mol/L)，用1mol/L调节pH 至6.8,补加H2O至体积100ml。
不可忽视的转膜和封闭WesternBlot专题(经验篇).
不可忽视的转膜和封闭:WesternBlot专题(经验篇)生物通技术专题：既可以定性，又可以半定量的Western是初步鉴定蛋白质最方便也是最通用的方法。
Western印迹要想做的好，当然每个步骤都不能马虎，看看这张图，从电泳，转膜，封闭，一抗，二抗到最后的检测，就像“发现号”升空的120万个步骤那样一个也不能少。
如果忽视了其中的一步，结果做不出来，也是令人非常头痛的。
“工欲善其事，必先利其器”，要想有好的实验结果，好仪器是相当重要的，因此让我们先来看看什么样的仪器能让我们无后顾之忧，顺利痛快的一步到位。
Western 印迹的仪器主要就是电泳系统和电转移系统了，最好的品牌当然是Bio-Rad和Amersham（GE Healthcare）的Hoefer系列了，现在国内出品的物美价廉的电泳系列产品，也是不错的选择，几乎每个实验室都需要至少一套Mini Cell吧？如果还没有你该怎么挑选呢。
一、Bio-Rad经典Mini系列Bio-Rad Laboratories由David Schwartz 先生和妻子化学家Alice Schwartz于1957 年创建，总部位于加州Hercules，下设三大部门——生命科学部，临床诊断部和工业材料部，其中生命科学部成功跻身世界排名前五名。
在2004年，Bio-Rad还低价收购了因侵犯知识产权限于困境的MJ Research，使得伯乐在PCR领域的市场份额骤然扩大。
Bio-Rad生命科学部产品包括蛋白组研究产品、层析仪与填料、蛋白质和核酸电泳产品等，不过最为普通实验室熟悉的莫过于蛋白电泳Mini系列和层析仪。
只要是提到SDS-PAGE，Bio-Rad绝对是每个实验室首先考虑的品牌，经典就是经典呀。
Mini-PROTEAN3电泳系统与MiniTrans-Blot转移系统这一套Mini系列可谓是Bio-Rad最多人熟悉和称道的产品了。
自上个世纪50年代Raymond利用聚丙烯酰胺凝胶的分子筛性质来延缓蛋白质的迁移率从而达到分离蛋白的目的以来，经过这么多年来的发展，SDS-PAGE电泳技术已经基本成熟了。
westernblot转膜常见现象及处理方法
westernblot转膜常见现象及处理方法western blot转膜常见现象及处理方法1，转膜不充分/过转对于非小分子量尤其是大分子量（>100kd）蛋白而言，一般不会出现过转情况，转膜不充分是主要原因，增加转膜力度无非是加大电压/电流，延长时间。
但对于小分子蛋白（<30kd就要注意了，<15kd 尤其要当心）很可能出现过转，丽春红染膜或观察marker有没有穿膜可以确认，没有丽春红也可以考染转膜后的胶，如果是一片空白，则要小心了，可适当降低转膜力度。
对于低分子量一般转膜液不要加SDS以防过转，《抗体技术实验指南》提供的针对中低分子量的湿转缓与高分子量的相比也是不含SDS的。
2，封闭时间不足这一点似乎多数人都不重视，所以有时候会有些意外。
我一般室温2~4h，但4度过夜确实是最好的。
另外在平皿中摇似乎比封口膜更容易掌握并获得较好的效果，对新手似乎更好。
3，抗体与封闭液有交叉。
实际上牛奶对于多数抗体来说还是很好的，但所有二抗也都写着：与牛奶可能有交叉反应。
BSA蛋白单一，可降低因牛奶其他成分引起的背景。
单用TBST也可以，此法虽然减少了交叉，但单就封闭能力而言却也因此而降低。
4，抗原-抗体浓度过高一般10min*3次就足够了，如果不放心可按自己意志加强时间、次数、洗脱液用量。
5，暴光时间过长降低曝光时间，以牺牲敏感度为代价其最低标准是使目的条带能够正常显影，对一切原因有效，但效果局限。
6，抗原-抗体浓度过高降低抗体浓度或蛋白上样量，以牺牲敏感度为代价其最低标准是使目的条带能够正常显影，仅对膜上蛋白和一抗引起的有效。
7，转膜不良（如有气泡在胶-膜之间) 主要是气泡在胶-膜之间引起的绝缘区使蛋白无法通过而不能到达膜上，这一步在操作时尤其要小心，我自己犯过，也看到其他人犯过。
我的办法是把胶铺到膜上，先使其一边接触膜的一边，这样就会在胶和膜交界的地方形成一个水相前缘，然后慢慢落下凝胶，这样这个水相前缘就会逐渐推进直至胶膜重合，如是则不会有气泡产生。
Western_blot的原理、操作及注意事项
Western blot的原理、操作及注意事项原理：通过电泳区分不同的组分，并转移至固相支持物，通过特异性试剂（抗体）作为探针，对靶物质进行检测，蛋白质的Western印迹技术结合了凝胶电泳的高分辨率和固相免疫测定的特异敏感等多种特点，可检测到低至1～5ng（最低可到10－100pg）中等大小的靶蛋白。
一、抗原的选择和制备A：样品的制备1 组织：组织的处理方法：组织洗涤后加入3倍体积预冷的PBS，0℃研磨，加入5×STOP buffer，180W，6mins，0℃超声波破碎，5000rpm，5mins 离心，取上清。
加入β-ME(9.5ml加入0.5ml)，溴酚蓝（9.5ml加入0.5ml）煮沸10min，分装后于-20℃保存，用时取出，直接溶解上样。
2 细胞：细胞的处理方法：离心收集细胞或者直接往细胞培养瓶内加入5×STOP buffer，收集，180W，6mins，0℃超声波破碎，5000rpm，5mins 离心，取上清。
加入β-ME(9.5ml加入0.5ml)，溴酚蓝（9.5ml加入0.5ml）煮沸10min，分装后于-20℃保存，用时取出，直接溶解上样。
3 分泌蛋白的提取（特例）：直接收集分泌液，加入β-ME、溴酚蓝制样。
B：蛋白的定量方法及影响蛋白定量原因1.双缩脲法：双缩脲法是第一个用比色法测定蛋白质浓度的方法。
在需要快速，但不很准确的测定中，常用此法。
硫铵不干扰显色，这对蛋白质提纯的早期阶段是非常有利的。
双缩脲法的原理是Cu2+与蛋白质的肽键，以及酪氨酸残基络合，形成紫蓝色络合物，此物在540nm波长处有最大吸收。
双缩脲法常用于0.5g/L～10g/L 含量的蛋白质溶液测定。
干扰物有硫醇，以及具有肽性质缓冲液，如Tris、Good 缓冲液等。
可用沉淀法除去干扰物，即用等体积10%冷的三氯醋酸沉淀蛋白质，然后弃去上清液，再用已知体积的1m NaOH溶解沉淀的蛋白质进行定量测定。
五年western blot 实验经验总结
1.抗体的选择对于国内的大多数实验室来讲，做western blot实验选择抗体是个头疼的问题。
原因很简单，买进口抗体捉襟见肘，买国产抗体得需要大无畏的勇气，对于我所在的兰州地区的实验者而言，感触尤深。
在这五年的western blot实验历程里，我先后用过进口抗体，进口抗体国内分装包装，国产抗体，质量良莠不齐。
进口抗体一般不会出现闪失：abcam品种全，质量过硬，但价高（3400元/100微升），而且说是100微升，但至多能吸出来90微升；Sigma的价最贵；比较有性价比的是CST的抗体，现在好像是2200元/100微升，我前后用过二十几种，1:1000的稀释比下，还没有失过手，100微升通常能完成所有的免疫组化和western blot实验，还有一个优点是通常量比100微升多出来10微升，唯一的不足是CST的品种实在不多。
Santa的多克隆抗体质量可以，但是选用Santa的单抗还是有风险，估计这也是业界共识了吧。
进口抗体国内分装包装我也用过不少，呵呵，毕竟是穷人（420元/100微升），大概好抗体的比例约为50%，如果能做出来，也存在一个问题，就是抗体大多只能用一次。
我曾经把Santa的原装抗体和分装抗体做过比对（抗体品种，货号等完全一致），在都能做出来的前提下，原装抗体能重复使用的次数要多出许多。
具体原因我已经揣测了好几年，不敢说出来，我一直在想是不是冬天西瓜切成牙和整个卖，也会有所不同。
揣测归揣测，假如只为了发论文毕业走人，可以考虑选用进口分装的多克隆抗体。
国产抗体比较知名的就几家，但质量确实不敢恭维。
western blot能做出来的确实不多，而且杂带多，背景不干净。
我们周边的实验室大多买国产抗体做免疫组化，怎么说呢，应付硕士论文够了。
我也帮别人自制过抗体，再用抗原亲和纯化。
效价非常不错，夸张的时候1：10000都能做出条带，唯一的麻烦是兔子太骚（骚臭），不知道这是不是“兔女郎”名号的来由。
Western-blot技术方法、原理及步骤
Western-blot技术⽅法、原理及步骤Western-blot技术原理：Western Blot技术是通过聚丙烯酰胺凝胶电泳后，经PAGE分离的蛋⽩质样品，转移到固相载体（例如硝酸纤维素薄膜）上，固相载体以⾮共价键形式吸附蛋⽩质，且能保持电泳分离的多肽类型及其⽣物学活性不变。
以固相载体上的蛋⽩质或多肽作为抗原，与对应的抗体起免疫反应，再与酶或同位素标记的第⼆抗体起反应，经过底物显⾊或放射⾃显影以检测电泳分离的特异性⽬的基因表达的蛋⽩成分。
该技术也⼴泛应⽤于检测蛋⽩⽔平的表达。
实验步骤：Western，也称Western blot、Western blotting、Western印迹，是⽤抗体检测蛋⽩的重要⽅法之⼀。
Western可以参考如下步骤进⾏操作。
1. 收集蛋⽩样品(Protein sample preparation)：使⽤适当的裂解液，裂解贴壁细胞、悬浮细胞或组织样品。
对于某些特定的亚细胞组份蛋⽩，例如细胞核蛋⽩、细胞浆蛋⽩、线粒体蛋⽩等，可以参考相关⽂献提取这些亚细胞组份蛋⽩，也可以使⽤试剂盒进⾏抽提。
亚细胞组分分离⽅法：（参考）制备组织匀浆（根据组织类型选择不同的匀浆⽅法，进⾏优化）离⼼时间亚细胞组分1,000g X 10 min pellets nuclei（细胞核）heavy mitochondria（线⽴体）plasma membrane sheets（浆膜）3,000g X 10 min heavy mitochondria（线⽴体）plasma membrane fragments（浆膜）6,000g X 10 min Mitochondria（线⽴体）Lysosomes（溶酶体）Peroxisomes（过氧化物酶体）intact Golgi（完整⾼尔基体）10,000g X 10 min Mitochondria（线⽴体）Lysosomes（溶酶体）Peroxisomes（过氧化物酶体）intact Golgi membranes（完整⾼尔基体膜）20,000g X 10 min Lysosomes（溶酶体）Peroxisomes（过氧化物酶体）Golgi membranes（⾼尔基体膜）large dense vesicles（⼤⾼密度囊泡）100,000g X 10 min all vesicles from ER（来⾃内质望⽹的囊泡）plasma membrane（浆膜）Golgi（⾼尔基体）Endosomes（内含体）注：以上⽅法仅做为参考，需根据实验条件进⾏优化。
western blotting原理及步骤
western blotting原理及步骤
Western blotting，也称为蛋白质印迹，是一种用于检测样品中特异性蛋白质的存在、细胞中特异蛋白质的半定量分析以及蛋白质分子的相互作用研究等的技术。
其原理基于抗原-抗体的特异性结合反应，通过将样品中的蛋白质进行电泳分离，然后转移到固相载体上，再与特异性抗体进行孵育，最后通过显色反应检测目标蛋白质的存在和位置。
Western blotting的步骤一般包括以下几步：
1. 样品制备：从细胞或组织中提取蛋白质样品，并进行浓度测定和保存。
2. 电泳分离：将样品中的蛋白质进行电泳分离，根据其分子量和电荷的不同，将蛋白质分开。
3. 转膜：将电泳分离后的蛋白质转移到固相载体上，常用的载体有硝酸纤维素膜、PVDF膜等。
4. 封闭：用特定的封闭液将膜封闭，以减少非特异性结合。
5. 孵育：将特异性抗体与膜孵育，使抗体与目标蛋白质结合。
6. 洗膜：用洗涤液将未结合的抗体洗去，减少背景干扰。
7. 显色：加入显色液，使抗体-抗原结合部位显色，从而检测到目标蛋白质的存在和位置。
8. 数据分析：对显色结果进行定量和定性分析，以获得目标蛋白质的表达情况和相互作用信息。
Western blotting具有较高的灵敏度和特异性，可以检测低浓度的蛋白质，并且可以半定量分析蛋白质的表达水平。
同时，Western blotting也可以用于研究蛋白质分子的相互作用。
然而，由于其步骤繁琐且易受干扰，Western blotting 的操作需要严格的质量控制和技术培训。
1。
我的western-blot实验经验总结
我的western-blot实验经验总结
Western-blot实验是一种常用的免疫学分析方法，用于检测蛋白质的存在、定量和分子量。
在进行这项实验时，需要经过以下几个步骤：
1. 样品制备：首先需要从细胞或组织中提取蛋白质，并将其分离成不同的组分。
这可以通过各种方法来完成，例如细胞裂解、电泳分离等。
2. 凝胶制备：将分离的蛋白质样品加载到聚丙烯酰胺凝胶中，通过电泳分离蛋白质，使其根据分子大小以不同的速度移动。
3. 转移：将凝胶中分离的蛋白质转移到聚丙烯酰胺或聚偏氟乙烯膜上，以便进行进一步的免疫学分析。
4. 免疫学反应：使用特定的抗体识别目标蛋白质，并进行免疫学检测。
这包括将蛋白质与一种或多种特定抗体反应，再使用荧光标记或酶标记的二抗进行检测。
5. 成像和数据分析：使用特定的成像方法，例如荧光显微镜或化学发光成像，来可视化免疫学反应结果。
然后进行数据分析，例如测量蛋白质的强度、定量分析等。
在进行Western-blot实验时，需要注意一些常见问题，例如蛋白质分离不完全、
抗体不充分、背景噪音等。
为了获得准确和可重复的结果，需要仔细控制实验条件、进行质量控制和标准化操作。
Western-Blot原理、显色分类及操作步骤
Western-Blot原理(yuánlǐ)、显色分类及操作步骤Western-Blot原理、显色(xiǎn sè)分类及操作步骤Western Blot原理、显色(xiǎn sè)分类及操作步骤(2008-08-14 23:07:59) 标签：western blot显色教育一、原理与Southern或Northern杂交方法(fāngfǎ)类似，但Western Blot采用的是聚丙烯酰胺凝胶电泳，被检测物是蛋白质，“探针”是抗体，“显色”用标记的二抗。
经过PAGE分离的蛋白质样品，转移到固相载体（例如硝酸纤维素薄膜）上，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。
以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原，与对应的抗体起免疫(miǎnyì)反应，再与酶或同位素标记的第二抗体起反应，经过底物显色或放射自显影以检测电泳分离的特异性目的基因表达的蛋白成分。
该技术也广泛应用于检测蛋白水平的表达。
既可以定性，又可以半定量的Western是初步鉴定蛋白质最方便(fāngbiàn)也是最通用的方法。
western显色的方法(fāngfǎ)主要有以下几种：i. 放射自显影ii. 底物化学发光ECLiii. 底物荧光ECFiv. 底物DAB呈色现常用的有底物化学发光ECL和底物DAB呈色，体同水平和实验条件的是用第一种方法，目前发表文章通常是用底物化学发光ECL。
只要买现成的试剂盒就行，操作也比较简单，原理如下（二抗用HRP标记）：反应底物为过氧化物+鲁米诺，如遇到HRP，即发光，可使胶片曝光，就可洗出条带。
二、操作步骤：(一) 配胶1、注意(zhù yì)一定要将玻璃板洗净，最后用ddH2O冲洗，将与胶接触的一面向下倾斜置于干净的纸巾晾干。
分离胶及浓缩胶均可事先配好（除AP及TEMED外），过滤后作为储存液避光(bì ɡuānɡ)存放于4℃，可至少存放1个月，临用前取出室温平衡（否则凝胶过程产生的热量会使低温时溶解于储存液中的气体析出而导致气泡，有条件者可真空抽吸3分钟），加入10%AP（0.7~0.8:100, 分离(fēnlí)胶浓度越高AP浓度越低，15%的分离胶可用到0.5:100）及TEMED（分离胶用0.4:1000, 15%的可用到0.3:1000，浓缩胶用0.8：1000）即可，如室温较低可升高10%AP及TEMED浓度到《分子克隆》建议浓度。
western blotting封闭原理
western blotting封闭原理
Western blotting封闭原理是利用一种封闭剂或封闭缓冲液将非特异性结合位点堵住，防止非特异性背景信号的产生。
封闭剂通常是一种蛋白质，例如牛血清蛋白(Bovine Serum Albumin, BSA)或非脂肪干奶粉(Non-Fat Dry Milk)，它们可以与膜上的非特异性结合位点相互作用，从而防止非特异性背景信号产生。
这是因为这些封闭剂的结构与一些非特异结合的抗体结合结构相似，从而竞争性地结合到这些非特异性位点上。
使用封闭剂进行封闭时，需要将封闭剂加入蛋白印迹膜的洗涤缓冲液中，然后将膜浸泡在封闭液中，使封闭剂充分与非特异性结合位点发生竞争性结合，从而实现封闭效果。
通过封闭原理，可以大大减少膜上非特异性背景信号的干扰，提高Western blotting实验的灵敏度和特异性。
实验记录-Western-Blot之跑胶与转膜
Western blot之跑胶与转膜（一）跑胶：1.蛋白样品准备：取一些之前做蛋白提取定量后已知浓度的蛋白样品，将所有蛋白样品调至等浓度（我们一般加入适量的RIPA），充分混合后，将样品与5X的loading buffer按4：1比例混合，并置于沸水中煮5min使蛋白变性，冷却至室温后放冰上备用（上样总体积一般不超过15ul，加样孔的最大限度可加20ul样品）；2.将胶连同玻璃板放置于电极架上，（梳子的一面朝里）固定好放入跑胶的缸子里，倒入一些running buffer；3.小心拔出梳子，避免破坏胶孔；4.上样：每块胶选1个孔加入5ul marker，加样一定要缓慢、稳，尽量选中间孔加入蛋白样本，尽量避免产生气泡，如果每个蛋白样本上样体积差异较大，可用1Xbuffer增加体积较少的孔，避免孔重差异导致相邻两蛋白条带的长短不一，上样完成后再加入一些1X的running buffer；5.电泳：连上电极，黑----黑，红----红，先开70v试跑，待样品进入分离胶后电压改为100v，（根据你蛋白样本分离情况调整时间），或当溴酚蓝接近或刚出胶底部时候可终止电泳；(二)转膜原理：转膜的原理是利用结合SDS的蛋白抗原带负电荷，在电场作用下从凝胶中转移至膜上。
方法是制作三明治夹板（海绵垫-滤纸-膜-凝胶-滤纸-海绵垫），放转膜槽中转膜，使蛋白质在电场力的作用下，从凝胶转移到膜上，膜可以吸附蛋白质，并保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。
1、物品准备：转移缓冲液（Tris5.8g 甘氨酸2.9g SDS 0.37g 甲醇200ml V=1L）、转膜用的夹板、两块海绵垫、4-6张滤纸、一张PVDF膜。
2、剪切适合大小的膜，放在甲醇溶液中浸泡，滤纸和海绵垫提前放入transfer buffer中浸泡；3、三明治夹板：先在托盘中倒入适量transfer buffer,然后依次放入转膜夹子---海绵垫---滤纸---PVDF膜---胶---滤纸---海绵垫，三明治夹板制作过程中一定要避免产生气泡，一定要充分排出气泡，使夹板夹紧，保证对凝胶有一定压力。
Western blot 转膜及膜的选择
Western blot 转膜及膜的选择转膜： 经过PAGE电泳分离后的蛋白质样品需要经过“转膜”步骤——从PAGE 胶转移到膜上固定，才能用各种方法进行Western Blot的检测和显色，而且为了防止没有电场的情况下已经分离的蛋白条带扩散，转移要尽快进行转膜的首要是选膜。
在转移膜上显色其实就像是画家在画布上作 画一样，不光要有好的画笔和颜料，适合的画布也是相当之重要。
Western Blotting亦是如此，没有选择好合适的转移膜是无法做出漂亮的结果的。
因此，选择适合的转移膜，要让转移“膜”高一尺，帮衬而不是阻碍到我们的实 验。
Western Blot印迹常用的转移膜主要是硝酸纤维素膜（Nitrocellulose Blotting Membranes，NC）和PVDF膜（Polyvinylidene-Fluoride） ，此外也有用尼龙膜、DEAE纤维素膜做蛋白印迹。
具体哪种膜适合于哪些实验呢？选择的根据主要有：a.膜与目的蛋白分子的结合能力（也就是单位面积的膜 能结合蛋白的载量），以及膜的孔径（也就是拦截蛋白的大小）；b.不影响后续的显色检测（也就是适和用于所选的显色方法，信噪比好）；c.如果后继实验有 其他要求，比如要做蛋白测序或者质谱分析，还要根据不同目的来挑选不同的转移膜，就像国画要选择宣纸，油画要挑亚麻布或薄棉扣布一样。
转膜 是对western blot最终结果影响最大的一步，转膜质量的好坏直接决定了实验结果的好坏。
转膜的影响因素不多，主要有膜的选择、转印方法和实验操作三个方面。
首先是膜的选择问题。
膜的选择主要从实验目的和实验要求来考虑。
例如，要做分子量小于20kDa的小蛋白，0.45um的NC膜是不可取的，因为这样可能会使得蛋白因透过膜孔而造成膜结合的目的蛋白量不确定，从而影响到最终结果的可靠性。
而如果所分离的蛋白需要进行测序，则非PVDF膜不可，因为只有PVDF 膜才能经受住严酷的清洗条件。
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
1. 记得全程手套操作，一则避免手印污染影响结果，二则保护自己（未交联的丙烯酰胺、甲醛等等虽不立即致命但都 会慢慢毒害你的身体，可不要这样白白为科学献身哈）
2. 如果WB前没有可参考的资料——比如不知道是否有表达，比如抗体少还要摸条件（稀释度），可以用剪膜剩下的边 角料来先做几组点杂交摸条件，省点时间省点试剂；
更多>>
特价专栏
·2013 默克密理博现货仓再度升 级！现货抗体和试剂盒5折促销 先到 先得！ ·多肽合成 20AA以内3折优惠，如14mg脱盐仅10.20元/AA。 ·华大科技-长链非编码RNA测序服务 系列精彩活动，好礼大放送！ ·免费试用申请-罗氏cOmplete His 标签蛋白纯化树脂
/newsf/2005-9/2005916184807.htm
时间：2005年09月16日
来源：生物通
摘要： 选好了膜，就该考虑如何做转膜了。经典的转膜方法是电转
移。如何做这个“海绵—几层滤纸—胶—膜—几层滤纸—海绵” 的“三文治夹心”，在分子克隆上已经有详细的介绍。下面我们 就来谈谈一些需要注意的细节。
eBiotech
生物通快讯
电转移和半干转，以及转膜的一些细节问题
续前：选好了膜，就该考虑如何做转膜了。经典的转膜方法是电转移，这个生物通在前面的WesternBlot仪器之选 里面有提到过，因为电转移需要配套垂直电泳槽来进行。如何做这个“海绵—几层滤纸—胶—膜—几层滤纸—海 绵”的“三文治夹心”，在分子克隆上已经有详细的介绍，相信大家都很容易找到。一些细节：
相关文章： ·一教授篡改六篇miRNA研究论文数据(01-06) ·独立研究证实V3 western流程的优越性[创新技巧](10-19) ·Western Blot好助手--Syngene G:BOX系列智能荧光、化学发 光成像系统[新品推荐](10-15) ·新型ECL底物为Western带来漂亮结果[新品推荐](10-15) ·基于近红外荧光检测技术的In-Cell Western™ Assay的应用与 方法学优势[新品推荐](10-10) ·Bio-Rad推出全新western blot分析软件[新品推荐](09-14) ·Western Blot实验操作指南优化（下）(08-30) ·Western Blot实验操作指南优化（上）[实验技巧](08-29) ·Western Blot实验操作指南优化（中）(08-29) ·荧光western blot应注意些什么[心得点评](08-01)
0. 如果只做Western Blot，膜可以用丽春红S染色并在脱色前照相，对后面的免疫反应影响不大。不要用考马斯亮蓝 或者氨基黑染色膜以免影响结果。如果有预染Marker需要用针或者笔扎眼记录条带位置，以免后面会洗掉而无法判 断结果。预染Marker也有助于判断转膜的效率和情况，如果比目标分子大的Marker都已经转过去了，那就OK了。如 果有能在Western结果显色的Marker（比如生物通前面特别推荐的别出心裁 特别好用的蛋白分子量标准 谁可小看 “蛋白标准”（下） ）就更方便了。
联生Co系物py信通ri箱首gh：页t©粤版|2I权0C生0P所0备物-有20通0910首生163页物e4B9通i1|o号t今ra日de动.c态om,| 生物通商城Al|l 人Ri才gh市ts场Re|se核rv心ed刊物 | 特 价专栏 | 生物直通车 | 科研交流 | 正牌 代理商 | 中国科学人 | 新技术专栏 | 技
Anode buffer I: Anode buffer II: Cathode buffer:
300 mM Tris 30 mM Tris 25 mM Tris/HCl (pH 9,4) 40 mM 6-Aminocapronic acid
更多>>
9. 有人觉得转膜加SDS有助于大分子蛋白转膜，我个人持保留意见，因为SDS等去垢剂影响硝纤膜和蛋白的结合，反而 不好。
不可忽视的转膜和封闭:WesternBlot专题(经验篇)[心得点评] -Western-生物通
Page 1 of 3
用户名： 密 码：
登录 注册
生物通首页 今日动态 生物通商城 中国科学人 新技术专栏 技术讲座
人才市场 技术期刊
核心刊物 会展中心
仪器龙虎榜 生物通快讯
特价专栏 表观论坛
生物直通车 ÄKTAclub
2. 转印后的PVDF膜在含20%甲醇溶液中在白透射光照下不用染色也依稀可以看到透明的蛋白条带，有时这种快速的方 法可以不用染色识别条带，避免染色膜影响后继实验。
转膜后的封闭注意：
3. 转膜后，膜上其他的空白位置需要用封闭液封闭。Western的灵敏度某种程度上受限于封闭做的好不好。脱脂奶是 最常用的经济配方（实验太晚了还可以补充一下营养，哈哈），用这种封闭剂由于里面可能有痕量的生物素和碱性 磷酸酶，可能造成背景污染而不适合生物素—亲和素的检测方法（如果用了生物素标记的Marker而且结果背景较 高，分析结果也有可能是受此影响），脱脂奶也不适合碱性磷酸酶检测（AP）方法。如果采用碱性磷酸酶检测系 统，封闭剂最好用6%酪蛋白+1%聚乙烯吡咯烷酮+10mmol/L EDTA磷酸缓冲盐加热65度1小时确保碱性磷酸酶失活（可 以加0.05%叠氮化钠，新鲜最好）。经济的脱脂奶配方和AP兼容得不太好，再加上HRP的底物选择范围也更宽，现在 HRP是越来越普遍的选择。但是叠氮钠(NaN3)对辣根过氮化物酶(HRP)有灭活作用，如果用HRP检测系统则封闭液不 要加叠氮化钠为好。切记。封闭时间和封闭剂的量都要足够。封闭不完全，后面就全白忙活了。
·Axiom™ myDesign™ 定制芯片为您 提供灵活的内容和格式 欢迎免费索 取资料! ·喜庆MP Biomedicals 全中文官网 正式上线 现在注册会员更有更神多秘>礼>
会展信息
·体验Affymetrix网络在线讲座：遗 传生物标记物发现2013-01-30至2013 -01-30全国 ·浙江大学“基因组科学”研习班 （20期/总40期）2013-03-01至201303-08杭州 ·2013世界生化、分析仪器与实验室 装备中国展2013-06-25至2013-06-27 上海
2013-1-24
不可忽视的转膜和封闭:WesternBlot专题(经验篇)[心得点评] -Western-生物通
Page 2 of 3
5. 转膜前胶要在转移缓冲液里平衡一下防止胶变形，也有助于进一步去掉可能有碍转膜的杂质。还有人在这一步浸泡 帮助蛋白复性，可以直接在胶上检测蛋白活性。
6. 膜漂在水面（或者甲醇液面）让液体从下通过膜上的孔渗上来以赶走膜内空气，膜彻底浸润后颜色会变深一点，任 何白点或者斑都是没有完全浸润的标志，会影响转膜的。最后浸没入缓冲液里平衡。甲醇处理PVDF不要超过15秒。 以后的步骤中不要让膜干涸了，万一不幸发生也用同样处理。
7. 电转移缓冲液通常用Tris glycine系统，如果是转膜后有部分样品要蛋白测序，最好用CAPS缓冲液，减少甘氨酸对 测序的污染。
8. 半干电转移（Semi-Dry）用经过缓冲液饱和的滤纸代替传统转移槽，非常节约试剂，而且效果也好。由于不用 “泡”在缓冲液中，半干转不单可用均一缓冲体系，也可以做非均一转移缓冲体系（配方下面有，还可以加 20 % (v/v) 甲醇，据说有助于增加转膜效率和减少胶变形的，但据说也有可能影响抗体识别）。半干转可以在30分钟内完 成转膜（每平方厘米电流2.5—3.5mA，恒流，冷库。如果电流要求小可以延长到60—90分钟，但要防止过热。如果 有那种温度贴，可以贴上参考温度），即使205KD这么大的蛋白转膜效率也高达80%。各种大小的蛋白的转移效率都 OK。半干转可以上下层叠2块胶+膜一起转（面积还是按照单个计算），或者并排放（2块胶的面积计算），只要控 制好单位面积的电流强度和时间，防止过热就好了。 Discontinuous blotting buffer to be used:
3. 去掉积层胶后，预染的Marker可用以识别胶上下方向和膜的正反面（预染Marker如果照着说明书用量，有可能在电 泳时看不到条带，但转膜时有浓缩效应而且背景白就可以看到了。如果要电泳能看到就要参考电泳的那个用量，或 者多加1—2倍的量）；如果目标蛋白小，指示剂也可以指示方向，但是如果蛋白大，指示剂已经跑出去了，就要留 意分清胶上下方向，切个小角是常用的方法。膜上要做好标记，识别正反面和上下。剪一个小小角最方便。膜和滤 纸一起裁最好（不过滤纸上下叠多了膜不好剪，硝纤膜容易裂，用利刀+尺子+垫厚报纸划比较容易）尽量和胶一样 大小，胶用纯水冲洗一下后用电泳缓冲液平衡过再量。我自己通常剪的时候会故意长宽各比胶少1mm，保证膜和胶 不会碰到对方背后的滤纸就好。
形形色色的蛋白标签 RNA-seq工具面面观 如何降低ELISA的背景
基因组编辑的新工需3398元，Amersham ECL预制胶电泳礼包拿回家！
技术期刊
GE期刊 | 基因快讯
分享到：
生物通Western Blot技术专题
·Western Blot之PAGE胶电泳和转膜 ·[生物通技术专题]如何做原核表达 ·别出心裁 特别好用的蛋白分子量标准 ·谁可小看“蛋白标准”（下） ·谁可小看“蛋白标准”（中） ·谁可小看“蛋白标准”（上） ·WesternBlot仪器之选 ·Western Blotting前传：想成为高手吗？
术讲座
1. 有人说在中性条件下电泳有助于蛋白测序，如果要蛋白测序需要提前一天倒胶，并说预电泳6小时（有还原剂如 Glycolate）后再倒积层胶。除了要做HPLC分析应该用丽春红S而不要用考马斯亮蓝或者氨基黑染色，其他的比如测 序和或者PTH都可以选灵敏度高些的考马斯亮蓝或者氨基黑。没条件做，参考而已。