几丁质酶（Chitinase）试剂盒说明书
-分子育种 (3)
基因工程与油菜育种李彦龙（河西学院农业与生物技术学院甘肃张掖 734000）摘要：转基因油菜的农艺性状明显优于普通油菜，表现在抗病虫性、抗逆性等优良特性上。
反式烯脂酰-CoA 还原酶(trans-2，3-enoyl-CoA reductase， ECR)是催化超长链脂肪酸(VLCFAs)合成的脂肪酰-CoA 延长酶之一。
根据已报道拟南芥ECR 基因设计引物，采用RACE (rapid amplification of cDNA ends)方法从甘蓝型油菜中克隆ECR 的全长cDNA 序列和对应的基因组序列，命名BnECR 。
根据编码区预测BnECR 前体蛋白为一个310 个氨基酸残基的多肽链，包含ECR 蛋白的重要功能位点K144、R145 及一NAD(P)H 结合基序G225SGGYQIPR/HG234。
BnECR 在高芥酸材料种子发育中后期的表达量显著高于低芥酸种子，表明BnECR 可能参与甘蓝型油菜芥酸的合成。
BnECR 克隆到酿酒酵母的穿梭表达载体中，分别转化野生型酵母By4743 和突变体菌株YDL015c，添加半乳糖诱导表达。
关键词：油菜，选育，克隆，芥酸1转基因油菜后代的农艺性状表现及其抗虫性研究油菜作为重要的食用油来源及工业原料，其发展和生产一直受到人们的重视，2006年，我国油菜种植面积已达到666.7万hm2。
但是由于国内油菜籽产量与食用油消耗量差口较大，1999/2000年度我国油菜籽进口量一度创下385.5万t的历史最高纪录，2003/2004年度油菜籽进口量也维持在41.8万t左右。
因此，扩大油菜种植面积，提高油菜单产已成为我国油菜生产的当务之急。
目前，影响油菜生产的因素除通过政策调整提高农民种植油菜的积极性外，病虫害对油菜生产发展的制约也不容忽视。
特别是虫害，常年的虫害发生面积都很大，全球每年因虫害对农业生产所造成的损失仍高达20%～30%[1]。
在我国油菜菜粉蝶[Artogeia(pieris)rapae(Linnaeus)]的发生面积就占油菜播种面积的20%以上。
黏质沙雷氏菌胞外几丁质酶的纯化及特性
黏质沙雷氏菌胞外几丁质酶的纯化及特性施腾鑫;黄秀菁;刘嘉;贺淹才【摘要】黏质沙雷氏菌几丁质酶发酵上清液经硫酸铵沉淀、透析、DEAE一琼脂糖凝胶阴离子交换层析和苯基-琼脂糖凝胶疏水层析，得到电泳纯的几丁质酶和几丁质结合蛋白CBP21。
该几丁质酶和CBP21分子质量分别约为58ku和21ku，CBP21对该几丁质酶水解几丁质增效明显。
几丁质酶反应最适温度为50~C，最适pH约为6．5～7．0。
该酶在55℃以下、pH4．5～8．0范围内稳定。
酶的Km值为0．22mg／mL，k为1．26Ixmol／（min·mg）。
金属离子K＋、Sn2＋,Mn2＋对酶有一定激活作用，而Pb2＋、Hg2＋和Cu2＋则强烈抑制其活性。
该几丁质酶的糖基含量约为3．3％。
EDTA和2-ME可分别提高酶活力65％和105％。
H2O2强烈抑制酶活力，提示其活性中心可能存在硫氢基。
%An extracellular chitinase and a chitin-binding protein （CBP21） were isolated from the culture of Serratia marcescens and purified to electrophoretic homogeneity by ordinal procedures containing ammonium sulfate precipitation, DEAE-Sepharose and Phenyl-Sepharose chromatography. Their relative molecular masses were estimated to be respectively about 58kD and 21kD by SDS-PAGE. CBP21 had great synergistic effect with the chitinase on chitin hydrolysis. The optimum temperature and pH for the enzyme activity were 50℃ and 6.5 respectively. The enzyme activity was stable under 55℃ and in the pH range of 4.5 - 8.0. Michaelis constants of the enzyme were Km 0.22 mg/ mL and Vm 1.26 ixmol/（min·mg） respectively. The activity was enhanced by K＋, Sn2＋and Mn2＋ and was strong- ly inhibited by Pb2＋ , Hg2＋ and Cu2＋. EDTAand 2-mercaptoethanol （2-ME） enhanced the activity by 65% and 105% respectively. H2O2 strongly inhibited chitinase activity, which indicated that hydrosulfide group was the possi- ble essential residue for enzyme activity.【期刊名称】《食品与发酵工业》【年(卷),期】2012(038)007【总页数】6页(P114-119)【关键词】黏质沙雷氏菌;几丁质酶;纯化;特性【作者】施腾鑫;黄秀菁;刘嘉;贺淹才【作者单位】福建福大百特科技发展有限公司酶高效表达国家工程实验室,福建福州350000;福建福大百特科技发展有限公司酶高效表达国家工程实验室,福建福州350000;华侨大学工业生物技术研究所,福建泉州362021;华侨大学工业生物技术研究所,福建泉州362021【正文语种】中文【中图分类】Q554.9几丁质(又称甲壳素)是N-乙酰-D-葡萄糖胺以2-1，4糖苷键连接起来的直链多聚物，是自然界中含量仅次于纤维素的可再生资源[1］。
亚洲玉米螟几丁质酶的晶体结构与抑制剂设计
亚洲玉米螟几丁质酶的晶体结构与抑制剂设计糖基水解酶18家族(GH18)几丁质酶(chitinase, EC3.2.1.14)随机催化水解几丁质(chitin)和壳糊精(chitodextrins)的β-1,4糖苷键。
该酶广泛分布于细菌、真菌、昆虫、植物和哺乳动物等生物体内,在营养、病原菌入侵、节肢动物蜕皮、免疫和防御等生理过程中发挥着重要作用。
解析并获得GH18几丁质酶的结构和功能的关系对于疾病控制、植物保护和药物设计均具有重要意义。
与其他物种相比,昆虫是GH18几丁质酶含量最丰富的生物体,包含8个分支。
其中group Ⅰ几丁质酶负责昆虫蜕皮时旧表皮的几丁质降解,对于昆虫的生长发育至关重要。
目前尚无昆虫几丁质酶结构与功能的报导。
本论文以农业害虫亚洲玉米螟的group Ⅰ几丁质酶OfChtI为研究对象,主要获得以下结论：1) OfChtl具有独特的结构特征重组表达的全长OfChtl不稳定,我们因此重组表达并结晶催化域(OfChtI-CAD)并解析得到分辨率为1.7A的OfChtI-CAD晶体结构(PDB登录号3w4r)。
晶体结构分析表明OfChtI-CAD包含核心域和几丁质插入域。
核心域为典型的(β/α)8折叠桶结构,催化残基指纹序列144DxDxE148位于β4和α4之间的loop上,而几丁质插入域形成活性裂缝的一面墙。
OfChtI-CAD 拥有长且两端开放的底物结合裂缝,依次排列9个可能结合底物糖基的芳香族氨基酸残基。
其不同于所有已知结构的几丁质酶的特征是：在底物结合裂缝的末端,有四个芳香族氨基酸(Phe159、Phe194、Trp240和Tyr290)形成一个疏水平面。
单点突变体F159A、F194A、W241A、Y290A、双突变体F194A/W241A、F159A/Y290A和四点突变体F159A/F194A/W241AA/Y290A结合几丁质的能力均较野生型(OfChtI-CAD低。
其中四点突变结合能力最低,仅为野生型的40%。
几丁质酶在农作物免疫防御中的应用研究进展
Food Science And Technology And Economy粮食科技与经济2023 年4月第48卷 第2期Apr. 2023Vol.48, No.4随着世界人口的日益增长，粮食的需求量随之上升，导致农作物在全球的种植面积需求越来越大，而农作物病虫害的发生是造成农作物产量和质量降低的最主要因素，每年因病虫害造成粮食（农作物）减产20％～40％，直接损失超过2 000亿美元[1]。
目前在病虫害防治方面，主要还是依靠化学防治的方式和手段[2]，然而过度依赖化学防治方式会造成环境生态污染。
为了生态环境的可持续发展，降低化学试剂对土壤环境的影响，生物技术在农业建设过程中的应用逐渐被重视。
将生物技术应用于农业病虫害防治中，能够有效减少传统的化学农药防治方法给环境带来的负面影响，推动绿色农业的可持续发展[3]，而几丁质酶在农作物生物防治方面具有巨大的潜在应用价值。
几丁质酶（Chitinase, EC 3.2.1.14）是水解几丁质的酶，能够催化几丁质的β-1,4-糖苷键，将其降解成N -乙酰葡糖胺（N -actyl glucosamine, NAG ），并能由各种微生物，包括病毒、细菌和真菌，以及昆虫、高等植物和动物合成[4]。
几丁质由β-1,4-糖苷键将N -乙酰-D -氨基葡萄糖（Be -ta -1,4-linked Repeating N-acetylaminoglucose Units, GlcNAc ）分子连接而成，以结构多糖的形式存在于真菌细胞壁、节肢动物的外骨骼、甲壳纲动物的外壳以及寄生线虫的外壳中，但尚未在植物体内鉴定出几丁质的存在[5]。
几丁质酶能够通过降解真菌性病毒细胞壁中的几丁质和破坏昆虫及线虫的消化膜等方式达到抗病虫害的效果，且不会对植物体产生伤害。
同时，几丁质酶也是植物防御系统中重要的防卫因子，可以增强植物的防御系统，在抵御病原真菌以及病虫害中发挥着重要作用[6]。
1293462556几丁质酶
几丁质酶(chitinase)是以几丁质(chitin)为作用底物的水解酶。
几丁质又称甲壳素或甲壳质,存在于节肢动物、线虫和软体动物的体壁、真菌细胞壁(除卵菌)和一些藻类等生物的细胞壁中。
在昆虫中,几丁质是围食膜及体壁的主要组成成分之一,通过几丁质酶对其有规律地降解以保证昆虫正常生长发育。
如果编码该酶的基因在不适当的时候表达或该表达时未表达,都会对昆虫造成伤害。
由于植物中不含几丁质,因此在植物害虫防治中,昆虫几丁质是几丁质酶的一个极具吸引力的作用靶标。
一、昆虫几丁质酶生物化学与生理作用昆虫几丁质酶存在于中肠、蜕皮腺及某些昆虫的毒腺中,是一种糖蛋白,可以水解昆虫体壁和中肠中的几丁质,酶切位点通常随机发生在链中间的任何一个部位,其最终产物是可溶低分子量的GlcNAC寡聚物。
昆虫蜕皮时约有90%的几丁质被降解,几丁质酶和几丁质之间的作用是一种动态过程,包括经过几丁质结合区(CBD)的吸附过程、水解过程、解吸附作用及活性催化区在作用底物表面的配置过程。
昆虫几丁质酶除能降解几丁质外,还担负许多重要生理功能,如昆虫肠道组织中的几丁质酶具有分解肠内和围食膜的几丁质和消化作用。
昆虫几丁质酶分泌到肠道中,以无活性酶原形式存在,在需要时被胰蛋白酶激活而降解围食膜。
蜕皮腺中的几丁质酶可以调节昆虫在生长发育中周期性蜕皮并合成新表皮。
毒腺中的几丁质酶有助于毒腺物质在取食对象的组织中扩散渗透。
二、昆虫几丁质酶分子特征1993年,编码昆虫几丁质酶的cDNA序列首次从烟草天蛾Manduca sexta中克隆出来。
目前已克隆得到烟草天蛾、家蚕Bombyx mori和美国白蛾Hyphantria cunea等十几种昆虫的几丁质酶cDNA序列。
这些克隆的基因主要集中在鳞翅目昆虫中,双翅目、鞘翅目和膜翅目仅有少数几丁质酶基因被克隆的报道。
昆虫几丁质酶分子量在40~85kDa之间,比植物几丁质酶(25~40kDa)和细菌几丁质酶(20~60kDa)大。
从土壤里筛选产纤维素酶细菌的步骤
从土壤中分离产几丁质酶的真菌作者：王春学号:11101680摘要：几丁质是自然界中储量仅次于纤维素的生物多聚体,它广泛存在于真菌、硅藻、节肢动物和原生动物等生物体中,是绝大多数真菌细胞壁的结构物质,同时还是昆虫中肠围食膜的主要成分[1].几丁质酶(Chitinase,EC3.4.1.14)[2]可催化水解几丁质的β21,4糖苷键生成N2乙酰2D2氨基葡萄糖(NAG),它在植物病虫害,尤其是对真菌病的防治方面,以及在几丁质废物的转化和利用等方面都具有重要作用,其研究受到人们的广泛重视.通过几丁质作为碳源,从土壤中筛选产几丁质酶菌株.1 材料与方法1.1 培养基1.1.1 平板培养基 (1)细菌几丁质培养基(分离用):蛋白胨10g,K2HPO40.7g,MgSO40.5g,KH2PO40.3g,胶体几丁质5.0g,琼脂15～20g,蒸馏水1L,pH值为7.2.(2)纯几丁质培养基:胶体几丁质 5.0g,KNO31.0g,NaCl0.5g,K2HPO40.5g,MgSO40.5g,FeSO40.01g,琼脂20g,蒸馏水1L,pH值为7.2.1.1.2 摇瓶培养基 (1)种子培养基(LB培养基):蛋白胨10g,酵母膏5g,NaCl10g,蒸馏水1L,pH值为7.0.(2)发酵培养基:用细菌几丁质培养基(分离用),但不加琼脂1.2 菌株的分离1.2.1 菌株初步分离从生产几丁质的工厂排污沟附近土壤采集土样,经过烘干及风化干燥,置于60目分样筛过筛,备用.称取1g土样放入加有9mL无菌水的离心管,分别稀释制成10-1,10-2,10-3,10-4,10-5,10-6不同稀释倍数的土壤溶液.从10-3,10-4,10-5,10-6不同稀度倍数的4管土壤稀释液中各吸取0.1mL,接种在纯几丁质培养基和细菌几丁质培养基的平板上,用涂布棒涂布均匀,在30℃下培养72h.1.2.2 菌种的二次筛选从第1次稀释涂布的平板中挑取可以产生透明圈的菌落,再一次通过稀释涂布的方法,将其接种于纯几丁质平板和细菌几丁质平板上,培养72h,以取得纯菌落平板.从第2次筛选的纯菌平板上选取水解圈直径与菌落直径比最大的菌种,将其接种于50mL的LB种子培养基上,12h后以2%的接种量接于100mL的细菌几丁质发酵培养基中,在30℃下进行扩大培养.1.3 菌种的鉴定1.3.1 细菌染色体DNA提取从新培养产几个质酶活性高的革兰氏阴性细菌平板上,挑取一环菌落至加有500μLTE缓冲液的1.5mL微量离心管中,混匀后沸水浴1.5min,迅速低温离心(12000r・min-1)10min,取上层清液分装后,置4℃下保存备用.1.3.2 16SrDNA引物根据16SrDNA的结构,应用B2/B3做引物,该引物扩增片段包含V8和V9两个高变区,扩增产物大小为1050bp(basepair,碱基对)左右.这两个引物序列为B2:5’2ACGGGCGGTGTGTAC23’;B3:5’2CCTACGGGAGGCAGCAG23’.1.3.3 聚合酶链反应(PCR)检测 PCR反应体系为20μL,二次蒸馏水12.6μL,10倍扩增缓冲液2.0μL,25mmol・L-1Mg2+1.6μL,各2.5mmol・L-1的脱氧核苷三磷酸(dNTP)0.4μL,20μmol・L-1引物各1.0μL,DNA模板1.0μL,5GU・L-1Taq酶0.4μL.PCR循环:94℃预变性5min,94℃变性60s,50℃退火60s,72℃延伸90s,循环30次,并在72℃后延伸15min.1.3.4 扩增产物的电泳分析用1倍的TAE缓冲液配制质量分数为1%琼脂糖凝胶.取PCR 扩增产物10μL,加2μL溴酚蓝指示剂,混匀后加样,于100V下电泳1.5h,紫外灯下观察电泳结果.1.3.5 序列测定与分析将观察到的PCR产物切胶,用胶回收试剂盒回收后,连接到pMD182T上,送北京奥科生物公司进行测序.然后,将测序结果通过GeneBank进行BLAST序列比对,得出结果参考文献[1] BROGLIEKE.Chitinaseandplantprotection[J].RevPlantPathol,1993,2:4112421.[2] 李力,黄胜元,关雄.产几丁质酶的苏云金杆菌菌株筛选及酶合成条件研究[J].中国病毒学,2000,15(51):94297.[3] CHANGYu2cheng,YANGChiyea,LIChin,etal.IdentificationofBacillussp,Escherichiacoli,Salmonellasp,StaphylococcusspandVibriospwith16SribosomalDNA2basedoligonucleotidearrayhybridization[J].Internation2 alJournalofFoodMicrobiology,2006,107:1312137.[4] 张龙翔,张庭芳,李令媛.生化实验技术[M].北京:高教出版社,1997:1112116.[5] MOOREER,KRUGERAS,HAUBENL,etal.16SrRNAgenesequenceanalysesandinter2andintragenericre2lationshipsofXanthomonasspeciesandStenotrophomonasmaltophilia[J].FEMSMicrobiolLett,1997,151(2):1452 153.[6] MIYAJIT,OTTAY,SHIBATAT,etal.PurificationandcharacterizationofextracellularalkalineserineproteasefromStenotrophomonasmaltophiliastrainS21[J].LettApplMicrobiol,2005,41(3):2532257.[7] MADHA VAPNK,BAIJUTV,SANDHYAC,etal.ProcessoptimizationforantifungalchitinaseproductionbyTrichodermaharzianum[J].ProcessBiochem,2004,39:158321590.[8] NAWANINN,KAPADNISBP.Optimizationofchitinaseproductionusingstatisticsbasedexperimentaldesigns[J].ProcessBiochem,2005,40:6512660。
一种简便易行的几丁质酶纯化法
一种简便易行的几丁质酶纯化法张新军;岳海梅;张伏军;范丽卿【摘要】传统的纯化微生物产几丁质酶的方法步骤繁琐、不易控制、得率较低。
经过实验探索得出一种较简单、快速、并可批量处理的几丁质酶纯化法。
将含有几丁质酶的发酵上清液与胶体几丁质混合后离心，几丁质酶随胶体几丁质沉降而与其他成分分离，用蒸馏水洗涤沉淀，再用蒸馏水重悬，放入30℃恒温箱温育72h，胶体几丁质被完全水解，从而得到纯几丁质酶。
此纯化方法条件温和，可保证纯化后的酶保持其生物活性。
SDS—PAGE检测及比色法对其纯度检测表明几丁质酶纯化回收率达到88．53％。
%Traditional purification of chitinase from the fermentation supernatant had some weaknesses such as complicated steps, difficult in controlling and low recovery ratio. Then we took experimental exploration and find a simple,fast and convenient method in the process of chitinase purification. This method may also be used in Batch processing. Detailed method is： fermentation supernatant which containing chitinase was first mixed with colloidal chitin, after centrifugation, the chitinase and the colloidal chitin precipitated and separated with other components in the supernatant. Then the precipitated was washed by distilled water for several times, the precipitate was then resuspended in distilled water and then sterilized at 30 ℃ for 72h. After the colloidal chitin was completely hydrolyzed, chitin enzyme was purified and abstracted. This method requires simple, mild purification conditions, ensuring the purified enzyme maintain its biological activity. SDS - PAGE and colorimetry detectingmethods indicated that the recovery rate of chitinase using this method can reach 88.53%.【期刊名称】《食品与发酵工业》【年(卷),期】2011(037)005【总页数】5页(P83-87)【关键词】几丁质酶;胶体几丁质;亲和吸附;离心;纯化【作者】张新军;岳海梅;张伏军;范丽卿【作者单位】西藏农牧学院高原生态研究所,西藏林芝860000;西藏农牧学院植物科学技术学院,西藏林芝860000;金思特科技有限公司,江苏南京210014;西藏农牧学院高原生态研究所,西藏林芝860000【正文语种】中文【中图分类】TS几丁质酶(Chitinase，EC3.2.1.14)是降解几丁质的水解酶，能够催化几丁质水解生成N-乙酰葡糖胺［1］，广泛存在于自然界中，微生物、动物和植物都能产生［2－4］。
几丁质酶的活性测定
几丁质酶活性的测定⑴几丁质酶几丁质是绝大多数真菌细胞壁的主要成份，而在植物中却不存在。
但高等植物普遍存在着几丁质酶，并可通过几丁质酶催化几丁质的水解，使植物具有抵御真菌侵染的能力（Shibuya and Minami, 2001）。
在正常情况下，高等植物的几丁质酶表达水平很低，而当植物体遭受到病原真菌、细菌和病毒侵染，机械创伤或乙烯处理时，其表达活性显著增强。
特别是在β-1,3-葡聚糖酶的协同作用下，可明显抑制真菌的生长（Sela-Buurlage et al., 1993）。
几丁质酶是植物体中与防御有关的一种次生水解酶，是植物广谱防御机制的一个成分（V an Loon and Van Strien, 1999），它能催化真菌细胞壁的重要成分——几丁质的水解，从而抑制真菌的生长增殖，提高植物的抗真菌能力。
而植物体中尚未发现几丁质酶作用的底物，所以，几丁质酶在植物体中诱导与积累，对于增强植物的抗病能力有重要作用。
几丁质酶主要水解几丁质多聚体β-1,4键，产生N-乙酰葡聚糖胺寡聚体，水解可以是外切作用也可以是内切作用。
⑵试剂的配制①胶状几丁质的制备称取粉末状几丁质（甲壳素，sigma）5.0 g，缓慢加入200 mL （≤4℃）预冷的浓HCl中，在磁力搅拌器上剧烈搅拌，待几丁质粉末均匀分散后，在水浴中轻度搅拌并缓慢加热至37 ℃混合物的粘度迅速增加，几分钟后粘度开始下降，混合物逐渐变得清亮。
当几丁质基本上溶解完毕时，用玻璃棉过滤，将滤液倒入2000 mL预冷（≤4℃）的蒸馏水中，搅拌，几分钟后几丁质沉淀，溶液变得混浊，30分钟后停止搅拌，将悬液置于冰箱(≤4℃)沉淀过夜。
倒掉上清，剩余部分用双层中性滤纸抽滤，沉淀用蒸馏水洗涤数次，待pH达到5以上时，加数滴1 N NaOH使溶液呈中性。
将上述中性沉淀物加到200 mL的蒸馏水中，剧烈搅拌重新悬浮，即为胶体几丁质溶液。
取该溶液5 mL, 105℃烘箱干燥至衡重，测定溶液几丁质的含量（胶体几丁质溶液的几丁质含量为: mg/mL），并将胶体几丁质溶液浓度稀释为1%。
几丁质酶-蛋白质化学
2
200
210
220 230 (nm)
240
250
260
PSC-EDTA、PSC以及 PSC-EDTA-Ca的CD光谱
六、PSC与Ca2+相互作用
结果与分析(PSC)
三级结构
UV Spectroscopy 0.002
0.004 0.002 0.000 -0.002 -0.004 0.006
a
0.000
天然含钙几丁质酶（PSC）的纯 化及表征
赵 广 华
钙营养缺乏
• 全球健康问题
• 中国人均膳食营养素中钙摄入量不及推荐供 给量标准（RDA）的 50%
原因 ?
钙的日常摄入量不足 钙的吸收利用率低 不良生活饮食习惯
溶解性差 食品组分干扰 吸收途径单一
补钙制剂现状
含钙量高，价格低廉 水溶性差，易受干扰
酶学性质
(M )
15mM
6
10mM
4-MU Concentration
200
4 2 0 0
7mM 5mM 4mM
a b c
Activity(fluorescence unit)
400
S Ca2+对于酶活的表征不是 E
E+S
150
5
10
Time (min)
15
20
1/v (s/M)
必需的，且对酶的催化活性 不会产生明显的影响。
几丁质酶的结构与分类
已从植物的根、茎、叶、果实以及种子中纯化得到多种 几丁质酶，并研究其结构与功能的关系。
——Collinge, D. B. et al. Plant chitinases. Plant J 1993, 3 (1), 31-40. ——Rao, D. H., Gowda L. R.. J. Agric. Food Chem. 2008, 56, 2175–2182.
几丁质酶检测
迪信泰检测平台
几丁质酶检测
几丁质酶（Chitinase）是能够催化几丁质中β-1,4糖苷键水解为N-乙酚寡糖和
葡萄糖的酶系，主要存在于甲壳类动物的外壳与软体动物的器官、真菌类的细胞壁、以及受侵染的高等植物中，具有降解真菌细胞壁抵御真菌侵染的作用，同时其降解产物氨基糖寡糖素在调节动植物细胞代谢中起着重要作用。
迪信泰检测平台采用生化法，可高效、精准的检测几丁质酶的活性变化。
此外，我们还提供其他糖代谢类检测服务，以满足您的不同需求。
生化法测定几丁质酶样本要求：
1. 请确保样本量大于0.2g或者0.2mL。
周期：2~3周。
项目结束后迪信泰检测平台将会提供详细中英文双语技术报告，报告包括：
1. 实验步骤（中英文）。
2. 相关参数（中英文）。
3. 图片。
4. 原始数据。
5. 几丁质酶活性信息。
迪信泰检测平台可根据需求定制其他物质测定方案，具体可免费咨询技术支持。
几丁质酶(Chitinase)试剂盒使用说明
几丁质酶（Chitinase）试剂盒使用说明微量法货号：BC0825规格：100T/48S产品内容：提取液：液体105mL×1瓶，4℃保存。
试剂一：液体10mL×1瓶，4℃保存。
试剂二：液体5mL×1瓶，4℃保存。
试剂三：液体5mL×1瓶，4℃保存。
试剂四：液体10mL×1瓶，4℃避光保存。
产品说明：几丁质酶要存在于虾、蟹、昆虫等甲壳类动物的外壳与软体动物的器官(例如乌贼的软骨)，以及真菌类的细胞壁中。
而几丁质酶(EC3.2.1.14)可催化几丁质水解，具有抵御真菌侵染的作用，成为抗真菌病害的研究热点。
几丁质酶水解几丁质产生N-乙酰氨基葡萄糖，进一步与对二甲氨基苯甲醛产生红色化合物，在585nm处有特征吸收峰，吸收值增加速率反映了几丁质酶的活性。
自备实验用品及仪器天平、水浴锅、离心机、可见分光光度计/酶标仪、微量石英比色皿/96孔板、蒸馏水。
操作步骤：一、粗酶液提取1.组织：按照组织质量（g）：提取液体积(mL)为1：5~10的比例（建议称取约0.1g组织，加入1mL提取液）进行冰浴匀浆，然后10000g，4℃离心20min，取上清，置冰上待测。
2.真菌：按照细胞数量（104个）：提取液体积（mL）为500~1000：1的比例（建议500万细胞加入1mL提取液），冰浴超声波破碎细胞（功率300w，超声3s，间隔7s，总时间3min）；然后10000g，4℃，离心20min，取上清置于冰上待检。
3.培养液：直接测定。
二、测定操作表对照管测定管粗酶液（mL）8080提取液（mL）12040试剂一（mL）80混匀，37℃水浴1h，5000rpm，4℃，离心10min，取上清。
试剂二（mL）4040混匀，沸水浴7min试剂三（mL）4040试剂四（mL）8080混匀，37℃，15min，于微量石英比色皿/96孔板，对照管调零，测定A585。
三、计算公式a.用微量石英比色皿测定的计算公式如下标准曲线：y=2.3575x-0.0143，R2=0.9989计算公式：1、按照样本重量计算酶活性定义：37℃条件下，每克组织每小时分解几丁质产生1mg N-乙酰氨基葡萄糖的酶量为一个酶活性单位。
细胞壁水解酶
细胞壁水解酶
细胞壁水解酶是一类能够水解细胞壁的酶，细胞壁是植物、真菌、细菌等生物的细胞外层的一个重要组成部分。
细胞壁具有结构支持和保护细胞的功能，同时也参与了细胞与环境的相互作用。
水解细胞壁的酶在生物学和生物技术领域都具有重要的应用价值。
以下是一些常见的细胞壁水解酶：
1.纤维素酶（Cellulase）：
来源：通常来自细菌、真菌和原生生物，如木霉。
功能：主要水解植物细胞壁中的纤维素，将纤维素分解成葡萄糖等单糖，释放能量。
2.果胶酶（Pectinase）：
来源：多数来自真菌和细菌。
功能：用于水解植物细胞壁中的果胶，促进果实软化，提高果汁产量，还可用于植物材料的处理。
3.壁蛋白酶（Hemicellulase）：
来源：真菌、细菌等。
功能：作用于植物细胞壁的半纤维素，如木聚糖、果胶等，从而松解细胞壁结构。
4.几丁质酶（Chitinase）：
来源：通常来自细菌、真菌和一些植物。
功能：用于水解几丁质，几丁质是在真菌和一些动物的外骨骼中发现的多糖，其结构类似于壳聚糖。
5.β-葡聚糖酶（β-Glucanase）：
来源：真菌、细菌等。
功能：主要水解植物细胞壁中的β-葡聚糖，促使细胞壁的降解。
这些酶在农业、食品加工、纺织业等领域具有广泛的应用，例如在果汁生产中用于提高果汁产量，或在纤维素乙醇生产中用于纤维素的降解。
同时，研究和利用这些酶也对生物质转化和可持续能源的开发具有重要意义。
带壳动物甲壳素外骨骼形成的分子机制探究
带壳动物甲壳素外骨骼形成的分子机制探究带壳动物是一类外骨骼动物，其结构特征是具有硬度和耐久性的壳。
作为带壳动物的关键组成部分，甲壳素的形成机制备受关注。
本文旨在探讨带壳动物甲壳素外骨骼形成的分子机制。
1. 甲壳素形成的基础甲壳素是带壳动物壳的主要成分，是一种多糖类物质，与几丁质密切相关。
几丁质是带壳动物外骨骼中的另一种主要成分，其通过一系列酶催化反应被转化成甲壳素。
甲壳素的结构在不同物种之间略有差异，但总体上来说，它是一种由N-乙酰葡萄糖胺分子（GlcNAc）和2-葡萄糖胺分子（GlcN）交替排列组成的多糖。
2. 甲壳素形成的过程几丁质向甲壳素的转化过程在带壳动物身上有不同的变化方式。
尽管如此，其中一部分酶催化生产出的中间产物GlcNAc4S是在所有物种中都存在的。
成熟度较高的一些物种包括龙虾和蟹，在其壳的形成中，GlcNAc4S被还原为GlcNAc，然后被转化成甲壳素。
另一方面，尚处于相对幼稚状态的物种，例如虾，没有还原酶，因此GlcNAc4S不能被减少，其结果是甲壳素的结构会包含GlcNAc4S残基。
另外，一些微生物如Vibrio tuberculosis透过特别的合成途径，使它们能够分泌具有高GlcNAc4S水平的甲壳素，从而依赖于高质量的几丁质降解。
3. 参与甲壳素合成的重要酶类多种细胞因子和酵素在甲壳素合成过程中发挥着关键作用。
其中，甲壳素合成相关的酶类被广泛研究。
天然性几丁质结构和甲壳素的合成涉及的酶类包括：（1）壳聚糖还原酶（Chitobiase）壳聚糖还原酶的任务是将成熟的几丁质骨架分解为甲壳素和寡糖。
与虾、甲壳质和海藻中的Chitobiase不同，虎虾、螃蟹和龙虾的Chitobiase可生成长链内和脱除甲醛的寡糖，这样，这种酶类就可能参与在壳的矿化中。
（2）NymphalysinNymphalysin是一种在蝴蝶中发现的新的几丁质酶，其替代性剪切剂功能，参与虫、实验室鼠和人类体内的几丁质降解，但没有发现该酶在甲壳质中的存在。
茶树几丁质酶基因的克隆及其在干旱胁迫下的表达分析
茶树几丁质酶基因的克隆及其在干旱胁迫下的表达分析朱晨;郭玉琼;张舒婷;常笑君;赵姗姗;王仲;许长同;张梓浩;林玉玲;赖钟雄【摘要】The chitinase gene CsChi (GenBank accession number:KR078345) was cloned by the RT-PCR method combined with RACE technique from the leaves of tea plant.The full length cDNA of CsChi was 1 192 bp containing an open reading frame (ORF) of 972 bp encoding 323 amino acids.Bioinformatics predicted that the molecular mass of CsChi protein was 34.33 ku.The theoretical pI was 8.44.The atomic composition wasC1519H2 285N413O464S18 and the total number of atoms was 4 699.The protein structure analysis showed that the protein had 6 transmembrane regions,which belonging to transmembrane protein.The protein existed the outside cell and had no coiled-coil structure.The deduced protein belonged to glycoside hydrolase family 19 and had a conserved ChtBD1 domains which had a high identity with the lysozyme,and it may be a bifunctional enzyme of chitinase and lysozyme.Analysis by qPCR showed that the transcript of CsChi under different drought stresses was up-regulated higher than the control group.We speculate that CsChi gene plays an important role in adversity stresses such as drought stress.%以铁观音茶树叶片为材料,利用逆转录PCR及RACE法,克隆了茶树几丁质酶基因CsChi(GenBank登录号为KR078345).CsChi基因的cDNA全长为1 192 bp,包含972 bp的开放阅读框(ORF),编码323个氨基酸.生物信息学分析结果表明,CsChi蛋白的分子量为34.33 ku;理论等电点pI为8.44;原子组成为C1519H2285N413O464S18,总原子数为4 699;蛋白质结构分析显示该蛋白有6个蛋白的跨膜区域,属于跨膜蛋白;存在于细胞外;没有卷曲螺旋结构存在;CsChi基因编码的蛋白属于糖苷水解酶19家族,含有保守的ChtBD1结构域,与溶菌酶的保守结构域类似,可能兼具几丁质酶活性和溶菌酶活性,qPCR定量分析结果显示在不同干旱胁迫处理下茶树的CsChi基因的表达量,与对照组相比有所增加.推测CsChi基因在茶树干旱等逆境胁迫中起重要作用.【期刊名称】《热带作物学报》【年(卷),期】2017(038)005【总页数】9页(P894-902)【关键词】茶树;几丁质酶;基因克隆;表达分析【作者】朱晨;郭玉琼;张舒婷;常笑君;赵姗姗;王仲;许长同;张梓浩;林玉玲;赖钟雄【作者单位】福建农林大学园艺学院,福建福州 350002;福建农林大学园艺学院,福建福州 350002;福建农林大学园艺学院,福建福州 350002;福建农林大学园艺植物生物工程研究所,福建福州350002;福建农林大学园艺学院,福建福州 350002;福建农林大学园艺学院,福建福州 350002;福建农林大学园艺学院,福建福州 350002;福州市农业局,福建福州 350001;福建农林大学园艺学院,福建福州 350002;福建农林大学园艺植物生物工程研究所,福建福州350002;福建农林大学园艺学院,福建福州350002;福建农林大学园艺植物生物工程研究所,福建福州350002;福建农林大学园艺学院,福建福州 350002;福建农林大学园艺植物生物工程研究所,福建福州350002【正文语种】中文【中图分类】TS272doi10.3969/j.issn.1000-2561.2017.05.018茶树（Camellia sinensis）属于山茶科山茶属，是多年生、木本、常绿植物。
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几丁质酶（Chitinase）试剂盒说明书
货号：MS2616 规格：100管/48样几丁质酶（Chitinase）试剂盒说明书
微量法
注意：正式测定之前选择2-3个预期差异大的样本做预测定。
测定意义：
几丁质主要存在于虾、蟹、昆虫等甲壳类动物的外壳与软体动物的器官(例如乌贼的软骨)，以及真菌类的细胞壁中。
而几丁质酶(EC 3.2.1.14)可催化几丁质水解，具有抵御真菌侵染的作用，成为抗真菌病害的研究热点。
测定原理：
几丁质酶水解几丁质产生N-乙酰氨基葡萄糖，进一步与对二甲氨基苯甲醛产生红色化合物，在585nm处有特征吸收峰，吸光值增加速率反映了几丁质酶的活性。
自备实验用品及仪器：
天平、水浴锅、离心机、可见分光光度计/酶标仪、微量石英比色皿/96孔板、甲苯（土壤样品专用）和蒸馏水。
试剂组成和配制：
提取液：液体105mL×1瓶，4℃保存。
试剂一：液体5mL×1瓶，4℃保存。
试剂二：液体5mL×1瓶，4℃保存。
（若出现结晶，可80℃左右加热溶解后使用）
试剂三：液体5mL×1瓶，4℃保存。
试剂四：液体10mL×1瓶，4℃避光保存。
粗酶液提取：
1.组织：按照组织质量（g）：提取液体积(mL)为1：5~10的比例（建议称取约0.1g组织，加
入1mL提取液）进行冰浴匀浆，然后10000g，4℃离心20min，取上清，置冰上待测。
2.真菌：按照细胞数量（104个）：提取液体积（mL）为500~1000：1的比例（建议500万细
胞加入1mL提取液），冰浴超声波破碎细胞（功率300w，超声3秒，间隔7秒，总时间3min）；
然后10000g，4℃，离心20min，取上清置于冰上待测。
3.培养液：直接测定。
第1页，共3页
计算公式：
a.用微量石英比色皿测定的计算公式如下
标准曲线：y=0.3088-0.003，R2=0.9995
1、按照样本重量计算
酶活性定义：37℃条件下，每克组织每小时分解几丁质产生1mg N-乙酰氨基葡萄糖的酶量为
一个酶活性单位。
几丁质酶活性（mg/h/g鲜重）=（ΔA+0.003）÷0.3088×V反总÷(V样÷V样总×W) ÷T
=8.096×（ΔA +0.003）÷W
2、按照蛋白质浓度计算
酶活定义：37℃条件下，每毫克蛋白每小时分解几丁质产生1mgN-乙酰氨基葡萄糖的酶量为一
个酶活单位。
几丁质酶活性（mg/h mg prot）=（ΔA+0.003）÷0.3088×V反总÷(V样×Cpr) ÷T
= 8.096×（ΔA +0.003）÷Cpr
3、按细胞数量计算
酶活定义：37℃条件下，每104个细胞每小时分解几丁质产生1mgN-乙酰氨基葡萄糖的酶量为
一个酶活单位。
几丁质酶活性（mg/h /104 cell）=（ΔA+0.003）÷0.3088×V 反总÷(V样÷V样总×细胞数量)
=8.096×（ΔA +0.003）÷细胞数量
4、按液体体积计算
酶活定义：37℃条件下，每毫升培养液每小时分解几丁质产生1mg N-乙酰氨基葡萄糖的酶量
为一个酶活单位。
几丁质酶活性（mg/h /mL）=（ΔA+0.003）÷0.3088×V反总÷V样=8.096×（ΔA +0.003）
V反总：反应体系总体积，1mL；V样：反应体系中样本体积，0.4mL；V样总：加入提取液体积，1mL；W：样本质量，g；Cpr：样本蛋白浓度，mg/mL
b.用96孔板测定的计算公式如下
标准曲线：y=0.1544x-0.003，R2=0.9995
计算公式：
4、按照样本重量计算
酶活性定义：37℃条件下，每克组织每小时分解几丁质产生1mg N-乙酰氨基葡萄糖的酶量为
一个酶活性单位。
几丁质酶活性（mg/h/g鲜重）=（ΔA+0.003）÷0.1544×V反总÷(V样÷V样总×W) ÷T
=16.192×（ΔA +0.003）÷W
5、按照蛋白质浓度计算
酶活定义：37℃条件下，每毫克蛋白每小时分解几丁质产生1mgN-乙酰氨基葡萄糖的酶量为一
个酶活单位。
几丁质酶活性（mg/h mg prot）=（ΔA+0.003）÷0.3088×V反总÷(V样×Cpr) ÷T
= 16.192×（ΔA +0.003）÷Cpr
6、按细胞数量计算
酶活定义：37℃条件下，每104个细胞每小时分解几丁质产生1mgN-乙酰氨基葡萄糖的酶量为
一个酶活单位。
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几丁质酶活性（mg/h /104 cell）=（ΔA+0.003）÷0.3088×V 反总÷(V样÷V样总×细胞数量)
=16.192×（ΔA +0.003）÷细胞数量
4、按液体体积计算
酶活定义：37℃条件下，每毫升培养液每小时分解几丁质产生1mg N-乙酰氨基葡萄糖的酶量为一个酶活单位。
几丁质酶活性（mg/h /mL）=（ΔA+0.003）÷0.3088×V反总÷V样=16.192×（ΔA +0.003）V反总：反应体系总体积，1mL；V 样：反应体系中样本体积，0.4mL；V样总：加入提取液体积，1mL；W：样本质量，g；Cpr：样本蛋白浓度，mg/mL
注意事项：
1、反应结束后立即进行比色。
2、试剂四有一定的毒性，请操作时做好防护措施。
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