鲑精DNA配制

鲑精DNA配置

溶解DNA pH要调到8左右。要用DNase free的水。室温就可以。不要过度震荡和抽吸。以防DNA链断裂。最后加入终浓度为1 mM EDTA。

1 把鲑鱼精子DNA（Sigma,Ⅲ,盐钠）溶解于水配制成10mg/ml的浓度，必要时于室温磁力搅拌2～4h助溶。把溶液中NaCl的浓度调至0.1mol/L，并用酚和酚/氯仿各抽提一次，回收水相。合DNA溶液快速通17号皮下注射针头12次，以剪切DNA。加入2倍体积用冰预冷的乙醇沉淀DNA。离心回收DNA并重溶于水，配制成10mg/ml的浓度，测定溶液的OD260值并计算出精确的DNA 浓度，然后煮沸10min，分装成小份保存于-20℃。使用前置沸水浴中加热5min，然后迅速在冰浴中骤冷。预杂交液中应含有100μg/ml经变性并被打断的鲑鱼精子DNA

2

（1）在50ml灭菌聚乙烯管中加入1g鲑精DNA，加入15ml DEPC水使其浸泡5min至2h；

（2）加入2.5ml 2mol/L HCl，室温放置，DNA形成白色沉淀，充分振摇至沉淀物相互缠绕在一起，用吸头尖端使之形成一球团状（2～3min）；

（3）加入5.0ml 2mol/L的NaOH。摇动小管使DNA悬浮、溶解，将小管置50℃15min助溶；

（4）用DEPC水将混合物稀释至175ml（总体积），充分混合，注意确保管内已无颗粒状；

（5）加入20ml/l 1mol/L的Tris-HCl缓冲液（pH7.4）；

（6）用2mol/L的HCl滴定至DNA溶解pH为7.0～7.5；

（7）用无菌微孔滤膜过滤液体，去除颗粒。260nm测定溶液的OD值，方法是：取20μl DNA液混合于980μl水中，混匀后测定，吸收值乘以50即为DNA浓度（μg/ml）；

（8）制备好的DNA液储于-20℃备用，用前取出冻融后煮沸