抗体检测技术培训课件
合集下载
相关主题
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
1. 使抗原或抗体结合到某种固相载体表面，并保持其 免疫活性
2. 使抗原或抗体与某种酶连接成酶标抗原或抗体，这 种酶标抗原或抗体既保留其免疫活性，又保留酶的 活性
3. 按一定步骤进行抗原抗体反应
4. 加底物显色，根据颜色反应的深浅进行定性或定量 分析
抗体检测技术
8
方法类型
ELISA既可测抗原又可测抗体，根据试 剂来源、标本性状以及检测的具体条件， 可设计出不同类型的检测方法：
AP可溶性底物及呈色：
对硝基苯磷酸酯(P-NPP)：黄色(405nm) 4-甲基伞基磷酸酯(4-MuP)： 荧光
AP不可溶性底物及呈色：
NBT和BCIP混合液：紫色 坚固红和萘酚ASMX混合液：红色
ß-半乳糖苷酶：
4-甲基伞基-ß-半乳糖苷：荧光抗体检测技术
17
（三）设备：酶标比色仪简称酶标仪
抗体检测技术
3
沉淀反应
1、絮状沉淀反应 2、环状沉淀反应 3、双向扩散 4、单向免疫扩散
抗体检测技术
4
双向扩散法的操作：生理盐水配制1%-5%的 琼脂，取4mL倒在显微镜用的载玻片上，凝 固后打孔，中心孔滴入抗原，外周孔滴入 抗体用于测定抗体效价，中心孔滴入抗体 ，外周孔滴入抗原，用于检测抗原的存在 和定性抗原。
抗体检测技术
19
抗体检测技术
20
用途
Dr Dennis E Bidwell and Alister Voller created
the ELISA test to detect various kind of
diseases, such as malaria, Chagas disease, and
1.直接法 2.间接法 3.双抗体夹心法 4.双夹心间接法
抗体检测技术
9
直接法： 此法用于未知抗原的检测，将未知待测抗原吸附于固相载体，加入已知酶标针对特定抗原的 抗体。 间接法： 此法用于未知抗体的检测，将已知抗原吸附于固相载体，加入待检标本（含相应抗体）与之 结合，洗涤后，加入酶标抗球蛋白抗体（酶标抗抗体）和底物进行测定。 双抗体夹心法 此法常用于测定抗原，将已知抗体吸附于固相载体，加入待检标本（含相应抗原）与之结合， 洗涤后，加入酶标抗体和底物进行测定。 双夹心间接法 此法常用于测定抗体，将已知抗原（捕获抗体的抗原）吸附于固相载体，加入待检标本（含 相应抗体）与之结合，洗涤后，加入特异性抗抗体，洗涤，再加入抗抗体特异性的酶标抗体 和底物进行测定。
2. 常用酶：HRP、AP、ß-半乳糖苷酶等
3. 底物：
HRP可溶性底物及呈色：
邻苯二胺(OPD)：橙红(492nm)；四甲基联苯胺(TMB)：蓝色(450nm)
5-氨基水杨酸(5-ASA)：棕色(550nm) 鲁咪诺+H2O2：荧光
HRP不可溶性底物及呈色：
DAB：棕黄色 α-萘酚：红色 3-氧基-9-乙基卡唑：红色 4-氯-1-萘酚： 灰蓝色
抗体检测技术
13
一、试剂及仪器准备
（一） 免疫吸附剂 1.固相载体
⑴ 要求：① 吸附力强 ② 能保持Ag或Ab活性 ③ 不参与化学反应
抗体检测技术
14
⑵ 载体性能比较 要求：载体材料+、- 结果差别大 检测方法：10uLeabharlann Baidu/L IgG包被,加酶标抗IgG，显
色后，测20孔的OD，要求CV<10%
⑶ 常用载体： 材料：聚苯乙烯、聚乙烯、聚丙烯 等 形状：小试管、小珠、微量反应板
抗体检测技术
5
抗原抗体为单一体系时，抗原浓度不同，沉 淀弧的特征不同：
抗原抗体为多体系时，出现的沉淀弧
有多条，彼此互不干抗体检扰测技术。
6
酶联免疫吸附测定实验 (ELISA)
Enzyme linked immunosorbent assay
抗体检测技术
7
实验原理
ELISA利用了免疫反应的高度特异性和酶促反应的 高度敏感性检测抗原或抗体
抗体检测技术
10
抗体检测技术
11
抗体检测技术
12
A sandwich ELISA. (1) Plate is coated with a capture antibody; (2) sample is added, and any antigen present binds to capture antibody; (3) detecting antibody is added, and binds to antigen; (4) enzymelinked secondary antibody is added, and binds to detecting antibody; (5) substrate is added, and is converted by enzyme to detectable form.
指测读ELISA光度计；针对固相载体形式的不同 ，各有特制的适用于板、珠和小试管的设计
性能指标：测读速度、读数的准确性、重复性、 精确度和可测范围、线性
优良的酶标仪的读数一般可精确0.001，准确性 为±1%，重复性达0.5%
操作：室温宜在15-30℃，使用前先预热仪器1530min，测读结果更稳定。测读A值时，要选用 产物的敏感吸收峰，如OPD用492nm波长。有 的酶标仪可用双波长式测读
Johne's disease. ELISA tests also are used as in
in vitro diagnostics in medical laboratories. The
抗体检测技术
➢抗体检测技术
免疫酶技术 免疫荧光技术 凝集反应 沉淀反应 补体结合试验 放射免疫测定 蛋白印迹 免疫共沉淀 亲和力测定
抗体检测技术
2
凝集反应
凝集反应是指颗粒抗原与相应抗体结合反 应出现的可见性现象。颗粒抗原如完整的 细菌、红细胞等与相应抗体相混合，在一 定条件下出现凝集。凝集反应中抗原称为 凝集原，抗体称为凝集素。
抗体检测技术
15
2. Ag或Ab：纯度高、效价高、结合力高
3. 免疫吸附剂(固相Ag或Ab)： 包被：将Ag或Ab固相化的过程 包被缓冲液 封闭：包被后在用1-5%小牛血清白蛋白再包被
，以消除非特异吸附的干扰
抗体检测技术
16
㈡ 酶结合物：
1. 要求：纯度高、催化转化率高、专一性强、性质稳
定、来源丰富、标记后稳定
2. 使抗原或抗体与某种酶连接成酶标抗原或抗体，这 种酶标抗原或抗体既保留其免疫活性，又保留酶的 活性
3. 按一定步骤进行抗原抗体反应
4. 加底物显色，根据颜色反应的深浅进行定性或定量 分析
抗体检测技术
8
方法类型
ELISA既可测抗原又可测抗体，根据试 剂来源、标本性状以及检测的具体条件， 可设计出不同类型的检测方法：
AP可溶性底物及呈色：
对硝基苯磷酸酯(P-NPP)：黄色(405nm) 4-甲基伞基磷酸酯(4-MuP)： 荧光
AP不可溶性底物及呈色：
NBT和BCIP混合液：紫色 坚固红和萘酚ASMX混合液：红色
ß-半乳糖苷酶：
4-甲基伞基-ß-半乳糖苷：荧光抗体检测技术
17
（三）设备：酶标比色仪简称酶标仪
抗体检测技术
3
沉淀反应
1、絮状沉淀反应 2、环状沉淀反应 3、双向扩散 4、单向免疫扩散
抗体检测技术
4
双向扩散法的操作：生理盐水配制1%-5%的 琼脂，取4mL倒在显微镜用的载玻片上，凝 固后打孔，中心孔滴入抗原，外周孔滴入 抗体用于测定抗体效价，中心孔滴入抗体 ，外周孔滴入抗原，用于检测抗原的存在 和定性抗原。
抗体检测技术
19
抗体检测技术
20
用途
Dr Dennis E Bidwell and Alister Voller created
the ELISA test to detect various kind of
diseases, such as malaria, Chagas disease, and
1.直接法 2.间接法 3.双抗体夹心法 4.双夹心间接法
抗体检测技术
9
直接法： 此法用于未知抗原的检测，将未知待测抗原吸附于固相载体，加入已知酶标针对特定抗原的 抗体。 间接法： 此法用于未知抗体的检测，将已知抗原吸附于固相载体，加入待检标本（含相应抗体）与之 结合，洗涤后，加入酶标抗球蛋白抗体（酶标抗抗体）和底物进行测定。 双抗体夹心法 此法常用于测定抗原，将已知抗体吸附于固相载体，加入待检标本（含相应抗原）与之结合， 洗涤后，加入酶标抗体和底物进行测定。 双夹心间接法 此法常用于测定抗体，将已知抗原（捕获抗体的抗原）吸附于固相载体，加入待检标本（含 相应抗体）与之结合，洗涤后，加入特异性抗抗体，洗涤，再加入抗抗体特异性的酶标抗体 和底物进行测定。
2. 常用酶：HRP、AP、ß-半乳糖苷酶等
3. 底物：
HRP可溶性底物及呈色：
邻苯二胺(OPD)：橙红(492nm)；四甲基联苯胺(TMB)：蓝色(450nm)
5-氨基水杨酸(5-ASA)：棕色(550nm) 鲁咪诺+H2O2：荧光
HRP不可溶性底物及呈色：
DAB：棕黄色 α-萘酚：红色 3-氧基-9-乙基卡唑：红色 4-氯-1-萘酚： 灰蓝色
抗体检测技术
13
一、试剂及仪器准备
（一） 免疫吸附剂 1.固相载体
⑴ 要求：① 吸附力强 ② 能保持Ag或Ab活性 ③ 不参与化学反应
抗体检测技术
14
⑵ 载体性能比较 要求：载体材料+、- 结果差别大 检测方法：10uLeabharlann Baidu/L IgG包被,加酶标抗IgG，显
色后，测20孔的OD，要求CV<10%
⑶ 常用载体： 材料：聚苯乙烯、聚乙烯、聚丙烯 等 形状：小试管、小珠、微量反应板
抗体检测技术
5
抗原抗体为单一体系时，抗原浓度不同，沉 淀弧的特征不同：
抗原抗体为多体系时，出现的沉淀弧
有多条，彼此互不干抗体检扰测技术。
6
酶联免疫吸附测定实验 (ELISA)
Enzyme linked immunosorbent assay
抗体检测技术
7
实验原理
ELISA利用了免疫反应的高度特异性和酶促反应的 高度敏感性检测抗原或抗体
抗体检测技术
10
抗体检测技术
11
抗体检测技术
12
A sandwich ELISA. (1) Plate is coated with a capture antibody; (2) sample is added, and any antigen present binds to capture antibody; (3) detecting antibody is added, and binds to antigen; (4) enzymelinked secondary antibody is added, and binds to detecting antibody; (5) substrate is added, and is converted by enzyme to detectable form.
指测读ELISA光度计；针对固相载体形式的不同 ，各有特制的适用于板、珠和小试管的设计
性能指标：测读速度、读数的准确性、重复性、 精确度和可测范围、线性
优良的酶标仪的读数一般可精确0.001，准确性 为±1%，重复性达0.5%
操作：室温宜在15-30℃，使用前先预热仪器1530min，测读结果更稳定。测读A值时，要选用 产物的敏感吸收峰，如OPD用492nm波长。有 的酶标仪可用双波长式测读
Johne's disease. ELISA tests also are used as in
in vitro diagnostics in medical laboratories. The
抗体检测技术
➢抗体检测技术
免疫酶技术 免疫荧光技术 凝集反应 沉淀反应 补体结合试验 放射免疫测定 蛋白印迹 免疫共沉淀 亲和力测定
抗体检测技术
2
凝集反应
凝集反应是指颗粒抗原与相应抗体结合反 应出现的可见性现象。颗粒抗原如完整的 细菌、红细胞等与相应抗体相混合，在一 定条件下出现凝集。凝集反应中抗原称为 凝集原，抗体称为凝集素。
抗体检测技术
15
2. Ag或Ab：纯度高、效价高、结合力高
3. 免疫吸附剂(固相Ag或Ab)： 包被：将Ag或Ab固相化的过程 包被缓冲液 封闭：包被后在用1-5%小牛血清白蛋白再包被
，以消除非特异吸附的干扰
抗体检测技术
16
㈡ 酶结合物：
1. 要求：纯度高、催化转化率高、专一性强、性质稳
定、来源丰富、标记后稳定