环境样品前处理-第6章衍生化

（三）羰基化合物的衍生试剂:
肼类 DNs-HCEOC-H
氨基类 氨基甲基芘
（四）羧酸类化合物的衍生试剂:
(4-溴甲基-7-甲氧基香豆素) 溴甲基类 BrMMC
哌嗪基类 DBD-Pz
7-N-哌嗪-4-二甲氨基苯并呋喃
（四）羧酸类化合物的衍生试剂:
重氮甲烷基类 ADAM 9-蒽重氮甲烷
• 与带有紫外吸收基团的衍生试剂在一定条 件下发生反应，反应产物带有发色基团而能 被紫外吸收检测器检测。
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（1）紫外衍生化反应
（1）苯甲酰化反应
苯甲酰氯 + 胺、醇、酚→苯甲酸酯类衍生 物（２００～３６０ｎｍ ）
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（1）紫外衍生化反应
P139-140 : （2）苯甲磺酰化反应 （3）DNFB与醇、胺、氨基酸反应 （4）PITC与氨基酸反应 （5）有机酸酯化反应 （6）羰基与DNPA或PNBA反应 更多反应：P137-138表6-2
• 手性衍生化分离通常基于以下原因：
⑴不宜直接拆分，如游离胺类在手性固定 相上往往呈颇弱的色谱性质，生成中性化合物 则获得显著改善．
⑵添加某些基团，以增加色谱系统的对映 异构选择性． ⑶提高紫外或荧光检测的效果．
6.3 衍生化技术在环境分析中的应用
• P144
作业
1.画出柱后衍生流程示意图。 2.用表格形式总结气相色谱柱前衍生化的 方法原理和化学反应式
荧光衍生试剂的基本构成
取代基
荧光团（试剂分子母体）
反应基团
胆磺酰肼 DNS-H
常用的荧光衍生试剂
荧光衍生化试剂亦称荧光探针
P140表6-3
1.丹磺酰氯（1-二甲氨基萘-5-磺酰氯）
2.丹酰肼（1-二甲氨基萘-5-磺酰肼）
荧光衍生化试剂的分类：
（一） 胺的衍生试剂 （二） 醇、酚的衍生试剂 （三） 羰基化合物的衍生试剂 （四）羧酸类化合物的衍生试剂
环境样品前处理
第6章 衍生化技术
6.1 衍生化目的与条件
定义：借助化学反应将待测组份接上某种 特定基团，从而改善其检测灵敏度和分离 效果的方法。 作用：把难于分析的物质转化为易于分析 的物质，通过对反应产物的检测间接分析 目标化合物。 过程：化学反应→定量转化→适于分析。
6.1 衍生化目的与条件
RCOOR' +H2O
•适合空间位阻较大的化合物。
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3. 酰化衍生化方法
在-OH、-SH、-NH等含有活泼氢的化合物上引 入酰基→转化为弱极性的酯、硫酯或酰胺→改善 挥发性和稳定性，含有卤离子的羰基基团可增强 ECD响应。 • 优点： 1. 保护不稳定基团； 2. 提高糖类，氨基酸等物质的挥发性和热稳性； 3. 有助于混合物分离； 4. 使用ECD检测，分析物检测下限可降低很多。
② 反应条件与色谱条件适应；
③ 反应产物可检测；
6.2 衍生化方法
6.2.1气相色谱柱前衍生化
（1）硅烷化衍生化方法 （2）酯化衍生化方法 方法
（3）卤化衍生化方法
（4）酰化衍生化方法
1. 硅烷化衍生化方法
质子性化合物如醇、酚、酸、胺等与 硅 烷化试剂反应，形成挥发性的硅烷衍生物
R3Si—X + H—R`
硫酸、盐酸-加热 三氟化硼BF3-室温
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② 重氮甲烷法
•非水介质中CH2N2与有机酸反应，生成有机酸甲酯
RCOOH + CH2N2
RCOOCH3 + N2
•重氮甲烷不稳定，有爆炸性，有毒！！
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③ 三氟乙酸酐法
•醇或酚与有机酸反应，生成酯：
三氟乙酸酐
RCOOH + R'OH
其它类
9-(2-羟乙基)-吖啶酮 HEA 4-氨甲基-6，7-二甲基香豆素 (ADMC)
（3）电化学衍生化反应
• 样品与某些试剂反应，生成具有电化学活 性的衍生物，以便在电化学检测器上有较 高的响应。 • 环境介质对电化学反应有很大影响，如离
子强度、pH值和溶剂组成等 。
常用的电化学衍生化试剂 ：
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HPLC化学衍生化分类
在线化学衍生化 ★是否与HPLC系统联机 离线化学衍生化 柱前衍生化 ★发生衍生化发应的先后
柱后衍生化
6.2.2 液相色谱柱前衍生化
1. 紫外衍生化反应
2．荧光衍生化反应 3．电化学衍生化反应
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优点： （1）对用作流动相的溶剂体系没有限制； （2）反应条件，反应速率不受限制； （3）通过选择合适的试剂以及萃取方法，可以 消除许多干扰； （4）过量溶剂、试剂容易除去；
（1）带硝基的芳香化wk.baidu.com物：P141表6-4
（2）芳氨基、酚羟基等 •上述试剂与羟基、氨基、羧基、羰基化 合物反应生成具有电化学活性的衍生物。
6.2.3 柱后衍生过程
• 将样品先注入色谱柱，按选定的色谱条件 使样品组分得以分离； • 当各个组分从色谱柱流出后，分别与衍生 化试剂相遇，在一定的反应条件下，生成具 有某种检测特性的衍生化产物
2. 固定化酶
• 酶一旦被固定，其稳定性增加。 • 利用酶反应的专一性完成的衍生化反应，可以 改变底物的化学特性，提高色谱分析的灵敏度 和选择性。P144图 6-3
• 制备衍生物的反应罐瓶
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• 其它衍生化方法：手性衍生化
用手性试剂与外消旋体反应，在分子
内导入另一手性中心，柱前衍生反应生成一 对非对映异构体，两者间无镜相关系，物理 化学性质不同，可用常规的色谱分离条件进 行分离。
实验课
• • • • 时间：5.22，5.29，6.5下午2：20 集合地点：西门-互助巷口 学习地点：礼让街23号 单位：青海出入境检验检疫局，五楼
4. 为结构鉴定提供依据
6.1.2 衍生化的条件
1. 柱前衍生化反应需满足的条件： ① 反应迅速、定量、重复、条件不苛刻、易操作；
② 选择性高、具有专一性；
③ 反应产物只有一种，无干扰；
④ 衍生化试剂易得、通用性好。
6.1.2 衍生化的条件
2. 柱后衍生化反应需满足的条件： ① 反应迅速、定量、重复；
结 构 特 点
1、福多司坦结构式:
HOCH2CH2CH2SCH2CHCOOH NH2
3、结构特点：
•为半胱氨酸衍生物； • 没有强的紫外吸收， • 没有荧光； • 分子量小，极性大。
羧基
伯氨基 2、半胱氨酸结构式：
HSCH2CHCOOH NH2
参考氨基酸的测定方法，选择合适的衍生化试剂
衍生化后测定：
• 酶的催化反应具有高度的专一性 • 酶试剂通常在反应中是不消失的，可重复使用
• 酶的固定化可分为化学和物理两种方法，化学 法是指在酶和载体之间生成共价键，并保留其 生物活性，而物理方法仅是吸附在固体表面。
2. 固定化酶
•对载体的要求：对酶应有较高的亲和力和较大的容量、易 再生。一般大孔径、大表面积的载体容量大，而容量越大 ，固定化酶的活性越高，寿命越长。 •硅球、玻璃微球、氧化铝、聚丙烯酰胺、葡聚糖凝胶、琼 脂糖凝胶和纤维素等都可以作为载体。如纤维素或葡聚糖 凝胶与溴化氰反应，然后用酶处理 ：
（5）转变成合适的衍生物，可使分离度改进。
缺点:
（1）操作过程繁琐，容易影响定量准确性。 （2）当一个复杂组分样品经过衍生化反应 后，有可能产生多种衍生化产物给色 谱分离带来困难。
（1）紫外衍生化反应
• 液相色谱法中，紫外吸收检测器是最常见 的一种高灵敏度检测器 • 很多化合物在紫外可见光谱区无吸收
记 录 仪
衍生化试剂泵
•柱后反应器
1. 毛细管式 2. 空气分割式 3. 填充柱式
P143图6-2
1. 固相化学反应剂
6.2.4 固相化学衍生化法
（1）还原型固相反应剂
2. 固定化酶
6.2.4 固相化学衍生化法
• 酶是一种具有特殊三度空间构象的蛋白质，能 够催化某一底物进行特异性化学反应，生成特 定的反应产物。
反应过程：
O H H O
+
HOCH2CH2CH2SCH2CHCOOH NH2
OHCH2CH2SH PH 10.4
SCH2CH2OH N CHCOOH CH2SCH2CH2CH2OH
衍生化产物的激发 波长为338 nm，发 射波长为450 nm
荧光衍生试剂
• 常用的荧光衍生化试剂（亦称荧光探针 ）有：
•分类：柱前衍生化和柱后衍生化。 •流程：
1. 柱前衍生化：衍生化反应→定量生成→色谱分析。
2. 柱后衍生化：色谱柱分离→衍生化反应→检测。
• 机理
分离-衍生产物
柱前衍生化
衍 生 化
检测-衍生产物 分离-待测物本体 检测-衍生产物
柱后衍生化
6.1.1衍生化的目的
• 提高目标物可检测性：
1. LC:提高检测灵敏度与选择性 2. GC:改善色谱分离，通过增强目标物挥 发性或者改善目标物极性 3. 提高理化稳定性
（一）胺的衍生试剂：
邻苯二甲醛 OPA
4-氯-7-硝基-2,1,3-苯并恶二唑 NBD-Cl
荧光素异硫氰酸酯FITC
FMOC芴代甲氧基酰氯
6-氨喹啉基琥珀酰亚胺碳酸酯AQC
（二） 醇、酚的衍生试剂:
羰基氯类： FMOC, CEOC 磺酰氯类: DNs-Cl
卤代三嗪类: EDTN
1-乙氧基-4-(二氯-三嗪)萘（EDTN）
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（2）荧光衍生化反应
•定义：用含有芳香环或杂环的大基团取代被测
化合物分子中的一个或几个原子，以此将荧光物
标记入分子，此时被测分子的结构基本不变
•特点：高选择性、高灵敏度
•荧光检测器灵敏度比紫外检测器的灵敏度高10
到1000倍
（2）荧光衍生化反应
例：福多司坦血药浓度测定方法的建立
• 进入检测器测定。
•
要求：
试剂、反应产物的溶解度，以及它们与流
动相可能发生的副反应；
（1）对流动相的选择更严格，必须考虑衍生化
（2）在高效液相色谱中采用高流速，因此 反应速率必须很快（小于30s）； （3）检测器对衍生化试剂不能有响应。
•柱后衍生流程图
泵
进 样 阀
色 谱 柱
检 衍生化反应器 测 器
•P135表6-1
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R3Si—R` + H—X
2. 酯化衍生化方法
大多数 有机酸 挥发性、热稳定性差。在 GC分析之前衍生为相应的酯。 ① 甲醇法
酯化 反应
② 重氮甲烷法 ③ 三氟乙酸酐法
① 甲醇法
甲醇法：有机酸与甲醇在催化剂的存在下加 热，可以发生酯化反应，生成有机酸甲酯
催化剂 RCOOH + CH3OH △ 催化剂 RCOOCH3 + H2O
氟乙酸酐）咪唑（MBTFA）、1-(三氟乙酰)咪唑 （TFAI） • 样品：药物等大分子 • 介质：非水
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4. 卤化衍生化方法
• 引入卤素→ECD检测器→改善挥发性和稳定性。
（1）卤素法：加成或取代
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4. 卤化衍生化方法
（2）卤化氢法：加成或置换 （3）NBS法：烯丙位取代 •P137
•
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3. 酰化衍生化方法
（1）乙酰化法：提高挥发性 • 试剂：乙酸酐（AA）
• 样品：糖类
• 介质：多为非水
• 催化剂：吡啶等碱性化合物
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3. 酰化衍生化方法
（2）多氟酰化法：引入卤素！ • 试剂：三氟乙酸酐（TFA）、五氟丙酸酐
（PFP）、七氟丁酸酐（HFB）、N-甲基双（三