产前诊断中的基因检测

产前诊断中的基因检测

四川省妇幼保健院生殖中心；四川省计划生育科研所遗传室李运星

以简炼的方式介绍产前诊断基因水平诊断的技术方法，并加以常见的病例给予说明，值得基层的产前诊断与优生优育工作者一阅。

基因检测在产前诊断中是十分重要，且正在不断发展与完善，其实质是在DNA水平或RNA水平对某一基因进行分析，从而对特定的疾病进行诊断。基因诊断始于1978年，美国科学家首先将限制性片段长度多态性（RFLP）用于基因诊断，从而揭开了基因诊断的序幕，基因诊断不仅可以明确指定个体是否患病，存在基因缺陷并揭示基因状态，而且可以对表型正常的携带者、对某种疾病的易感者作出诊断和预测。分子遗传检测技术大致可分为酶谱分析法、聚合酶链反应（PCR）、探针杂交分析法、DNA测序等方法。实际上，临床上多将这几种技术联合应用于基因检测。

一、限制性片段长度多态性（restriction fragment length polymorphism, RFLP）

人群中不同个体基因的核苷酸序列存在差异，称为DNA多态性。DNA顺序上发生变化而出现或丢失某一限制性内切酶位点，使酶为RFLP。任何一个基因内切大片段的缺失、插入以及基因重排，即使不影响到限制性内切酶位点的丢失或获得，也很可能引起限制酶片段的大小和数量发生变化，因而这类基因突变可以通过限制性内切酶DNA或结合基因探针的杂交方法将突变找出。

例如

1.镰形红细胞贫血症的基因诊断：

已知镰形红细胞贫血症的突变基因是编码β珠蛋白链的第6位密码子由GAG变为GTG，可用限制性内切酶MstⅡ进行检测。因为这一突变使正常存在的MstⅡ切点消失，这就使正常情况下存在的1.1kb及0.2kb条带变成患者（纯合子）的1.3kb条带。

2.血友病A的诊断

血友病A是一种X连锁隐性遗传病。用VⅢ因子基因的cDNA片段作为探针对待检者DNA酶切片段进行杂交，就可检出VⅢ因子基因部分缺失的男性患者和女性携带者。下图

家系Ⅲ-1患有严重的血友病A，经VⅢ因子治疗后产生VⅢ因子抑制物。用两种不同的内切酶和探针组合对家

系成员作RFLP分析。应用Bcl I/探针B（VⅢ因子基因）VⅢ因子基因部分缺失所致血友病A的基因诊断探针A是VⅢ因子基因1.7kb Kpn I cDNA 片段，包括1～12外显子。

探针B是VⅢ因子基因4.7kb EcoR I cDNA 片段，包括14～25和部分26外显子。A、B、C、D代表X染色体。

患者无Bcl/探针1.2和4.4bk,但有Sst I/探针A14.5kb、4.7kb EcoR IcDNA片段，包括14～25和部分26外

显子，患者不见1.2kb和4.4kb。应用Sst I/探针A（因子基因1.7kb Kpn IcDNA片段，包括1～12外显子），患

者和他的母亲（必然杂合子）出现异常的14.5kb。这一实验结果表明，VⅢ因子基因3’端部分缺失后，其5’端残

留部分可由Sst I/探针A检出。杂合子兼有Bcl I/探针B检出的1.2kb和4.4kb与Sst I/探针检出的14.5kb。

二、PCR技术在遗传病基因诊断中的应用特点

1983年Kary Mullis 发明了PCR技术。这项生命科学发展史上具划时代意义的技术一出现，首先就被分子遗传学携带者检查和产前诊断，例如镰形红细胞贫血病（Sicle Cell Anemia）、地中海贫血（Thalassemia）、DMD/BMD（我国1987年启动的国家高技术发展计划（863），对遗传病的基因诊断及相关新技术的研究结予了支持，及时拥有国大批科研成果。当时已完成了十多种遗传病的三十多例高危胎儿的产前基因诊断。

视频：PCR原理 (让我们用动画了解)

PCR技术被称为试管里的基因克隆术，靶基因片段以2n的指数形式迅速增加（n代表循环数）。30个热循环后，靶DNA拷贝数就扩增上百万倍之多！而这仅仅需要约2～3个小时。PCR反应结束后，运用琼脂糖凝胶电泳或聚丙烯胶电泳（PAGE, polyacrylamide gelelectrophoresis）进行PCR产物的分离分析，经溴乙啶（EB）染色或银染，即能观察到特定长度的DNA区带图谱。根据图谱即可作出基因诊断，也可对PCR产物进一步酶切，克隆或直接测序。值得指出的是，PCR并不仅仅是一个简单的DNA扩增反应，而是一项可以作出千变万化的改造，从而衍生出许许多多反应，运用于各种不同的研究和基因检测之中。

导致我国α地中海贫血的则是由于位于第16号染色体上的α珠蛋白基因族的三种大片段的缺失所致（分别缺失20Kb, 3.7Kb, 4.2kb），另有2种点突变只占很少一部分。在缺失断点两侧设计三个引物，可直接检出缺失并区分杂合子与纯合子。对于另外两种非缺失型α珠蛋白基因点突变，就得采用PCR技术结合检测点突变的技术，如SSCP（单链构象多态性），DGGE（变性梯度凝胶电泳），dHPLC (变性高效液相层析)，3，- 碱基特异的PCR，ASO或DNA测序等技术。由于a- 地贫基因诊断试剂盒不久即将问世。该试剂盒是含有7个引物的多重PCR体系，每份DNA标本只须做单管PCR，产物用琼脂糖凝胶电泳分离。根据电泳图谱即可作出分子遗传学诊断，详见下表。

甲型血友病（HA）是常见的一种X-连锁隐性遗传病，由于X染色体上的凝血Ⅷ因子基因（FⅧ）缺陷所致。但FⅧ长达186Kb，由26个外显子，25个内含子组成，已报道的突变类型有二百多种点突变，五十余种小缺失，十几种插入，八十多种大的缺失，及很长的基因倒位（Inversion）等等。利用一种长距离PCR技术，可直接为40%以上的重型HA患者作出诊断，也可直接作携带者检查及产前诊断。对于不是倒位的HA家系，则采用间接基因诊断方法，包括PCR/Bell酶切片段长度多态性（RFLP），PCR/VNTR（重处长串联数目可变多态性）及PCR/（CA）n二核苷序列重复数目多态性技术进行家系成员基因连锁分析，检出携带者，并进行产前诊断，不需花费巨大工作量去查清其具体突变是什么。但此类间接诊断技术有局限性，例如必须得有先证者的DNA样品，携带者必须是某多态性的杂合子才能进行产前诊断，每一种间接诊断技术的可诊断率约在70%~75%左右。联合运用二种甚至三种间接诊断技术，以保证对所有家系都能进行携带者检出和产前诊断。

唐氏综合征，是染色体数目异常（21-三体）引起的智力低下的先天性疾病，在我国新生儿中发病率高达1/750。运用PCR扩增21号染色体上6个STR（短串联重复序列）位点，以及PAGE技术可产前诊断该病。

从以上例子可以看出，运用PCR技术进行基因诊断有几个特点：

（1）它要检测的是人类基因组中特定的靶基因片段，其PCR的模板是人的基因组DNA，能得出明确诊断结果；

（2）涉及到的技术方法种类多，不但要查出靶基因，而且要求查出具体突变基因。能像检测病毒、细菌的