蛋白提取及WB步骤

Western blot 实验

1）蛋白裂解液的配制:

Urea（7 M）4.2 g，Thiourea（2 M）1.52 g，CHAPS（4% W/V）0.4 g，DTT （1% W/V）0.1 g，ddH2O加至10 ml，1 ml/管分装-20℃保存备用；1 ml分装的裂解液中用前加入Cocktail（1% V/V）10 μl，混匀后于冰上放置备用。

我们用的是国产的碧云天的全蛋白提取试剂盒

2）蛋白样品制备

（1）取组织，称重，按照W:V = 1:6的比例加入蛋白裂解液；

（2）用匀浆器对组织进行匀浆，匀成糊状。

（3）4 ℃，冰上放置30min，每10 min振荡一次；

（4）4 ℃，12000 g 离心30 min，吸上清，分装置于-70 ℃待用。

3）蛋白浓度测定（Bradford法）

试剂配制：

考马斯亮蓝染色液：考马斯亮蓝G250 0.05 g，95%乙醇25 ml，H3PO4 50 ml，ddH2O加至500 ml，过滤后储存于4 ℃。

牛血清白蛋白（BSA）：1 mg/ml

步骤：按下列体系配置溶液，混匀后，静置5 min后，测OD值（波长595 nm），将OD值输入Excel进行数据处理，计算出相关系数，当相关系数>0.99才具有可信度。取待测标本，正确设置reference，取适量标本，进行浓度测定。

管号BSA（1 mg/ml）0.9% NaCl/0.1 M PBS 考染液

0 0 200 μl 1 ml

1 5 195 μl 1 ml

2 10 190 μl 1 ml

3 15 185 μl 1 ml

4 20 180 μl 1 ml

5 25 175 μl 1 ml

我们用的是国产碧云天的BCA蛋白浓度测定试剂盒。

4）聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）

（1）凝胶制备：

30.8%丙烯酰胺：丙烯酰胺30 g，甲叉双丙烯酰胺0.8 g，ddH2O加至100 ml，

置于通风橱内搅拌直至丙烯酰胺完全溶解，用0.45 μm微孔滤膜过滤后4 ℃保存于棕色瓶中备用。

1.5M Tris（pH8.8）：Tris 18.17 g，HCl调至pH8.8，ddH2O至100 ml；

经验配制：配制1.5 M Tris（pH8.8）500 ml时直接加入10 M HCl（即HCl 原液）15 ml，不用再调pH。

0.5M Tris（pH6.8）：Tris 6.057 g，ddH2O加至100 ml，HCl调至pH 6.8。

10%SDS：SDS 1 g，ddH2O加至10 ml。

10%过硫酸铵：过硫酸铵0.1 g，ddH2O加至1 ml。

电泳缓冲液：Tris 3.02 g，甘氨酸14.4 g，SDS 1 g，ddH2O加至1000 ml。

转膜缓冲液：Tris（15.6 mM）1.93 g，甘氨酸（120 mM）9 g，ddH2O至1000 ml。

凝胶制备：

成分12%分离胶（5 ml）5%浓缩胶（4 ml）

30.8%丙烯酰胺 2.0 ml 0.67 ml

1.5M Tris（pH8.8） 1.3 ml --

0.5M Tris（pH6.8）-- 0.5 ml

10%过硫酸铵0.05 ml 0.04 ml

10%SDS 0.05 ml 0.04 ml

TEMED 0.002 ml 0.004 ml

H2O 1.6 ml 2.7 ml

步骤：将电泳槽装置安装好，根据需要量配置分离胶，灌注，用饱和正丁醇封液面，室温30 min~60 min待胶凝固后，去除正丁醇，配制浓缩胶，灌注，将加样梳放入，室温30 min~60 min待胶凝固后即可上样电泳；

（2）上样：将蛋白质标本中加入2×Loading Buffer [0.2%（g/v）bromophenol blue, 4%（g/v）SDS, 20% glycerol，200 mM 2-mercaptoethanol（DTT）, 100 mM Tris（pH 6.8）]，煮沸5 min~10 min，12000 rpm离心后加样；

（3）电泳：浓缩胶10 mA恒流电泳至交界处，分离胶20 mA恒流电泳至溴酚蓝到达凝胶下缘，可根据蛋白分子量的大小确定电泳的位置；

我们是bioworld的机子，一般可以电泳用恒压80V跑到底。

5）Western blot分析

（1）半干转膜仪转膜（具体和实验室机子有关）：剪与凝胶大小一致的PVDF 膜一张（膜用之前的处理：甲醇浸泡min,ddH2O浸泡5min，然后和滤纸一起泡到转缓里），滤纸12张，浸泡于转膜缓冲液中至少20 min，先将滤纸逐层置于转膜仪上，用下胶尺逐层赶尽气泡，加上PVDF膜，赶尽膜与滤纸间的气泡，将聚丙烯酰胺凝胶放在PVDF膜上，赶尽凝胶与尼膜之间的气泡，逐层加上滤纸，要尽量排放整齐；按照0.8 mA/cm2~1 mA/cm2的功率恒流转膜2 h~2.5 h。注意正负极。

我们一般用的是250ma转两个小时。

（2）将PVDF膜放入含5%脱脂奶粉的TBS中封闭2 h；

（3）加入5%脱脂奶粉稀释的一抗，4 ℃过夜；

（4）次日用TBS洗3次，每次10 min；

（5）加入HRP结合的二抗，37 ℃，1 h；

（6）TBS洗4次，每次10 min；

（7）显影：这个是根据各个实验室的设备。