蛋白提取及WB步骤
WB实验步骤详解
WB实验步骤详解Western blotting（简称WB）是一种常用的蛋白质检测技术，通过将蛋白质分离、转移和检测，可以用来确定特定蛋白质的存在和表达水平。
本文将详细介绍WB实验的步骤，以帮助读者了解该技术的操作流程。
1. 细胞培养和蛋白提取。
首先，需要培养细胞并收集细胞样本。
将细胞样本离心，去除培养基，然后用PBS洗涤细胞。
接下来，加入细胞裂解液并振荡离心，收集上清液，即为蛋白提取物。
2. 蛋白质浓度测定。
使用BCA或Bradford方法测定蛋白提取物的浓度，以确保后续实验中使用的蛋白质量一致。
3. SDS-PAGE凝胶电泳。
将蛋白提取物加入蛋白负载缓冲液，然后加入SDS-PAGE凝胶槽中。
进行电泳分离蛋白质，根据蛋白质大小和电荷不同，蛋白质会在凝胶中形成不同的条带。
4. 蛋白质转印。
将SDS-PAGE凝胶中的蛋白质转移到膜上，通常使用半湿式或全湿式转印。
将蛋白质从凝胶转移到膜上，使得蛋白质可以与抗体结合。
5. 阻塞。
将膜放入含有蛋白质的溶液中，如5%脱脂奶粉或蛋白质阻塞缓冲液中，阻塞非特异性结合位点。
6. 一抗孵育。
加入第一抗体，孵育过夜。
第一抗体与目标蛋白结合，形成抗原-抗体复合物。
7. 洗涤。
用TBST或PBS洗膜，去除未结合的抗体。
8. 二抗孵育。
加入HRP标记的二抗，孵育1小时。
二抗与第一抗体结合，形成复合物。
9. 洗涤。
用TBST或PBS洗膜，去除未结合的二抗。
10. 显色。
加入ECL显色液，使得膜上的蛋白质产生发光反应。
将膜放入暗室中，用X光片曝光，然后用显影液显影。
11. 图像获取和分析。
将X光片放入X光片扫描仪中，获取蛋白质条带的图像。
使用图像分析软件，如ImageJ，分析蛋白质的相对表达水平。
以上就是WB实验的详细步骤，每一步都至关重要，需要严格按照操作规程进行。
希望本文能够帮助读者更好地理解WB实验的操作流程，并在实验中取得准确、可靠的结果。
WB实验的基本原理及操作流程
WB实验的基本原理及操作流程WB实验（Western Blotting）是一种用于检测和分离蛋白质的实验方法，广泛应用于生物医学和生物化学领域。
它通过将复杂的蛋白质混合物按照分子大小分离，并使用特异性抗体来探测目标蛋白质。
本文将介绍WB实验的基本原理及操作流程。
一、基本原理WB实验主要基于蛋白质的电泳分离和免疫染色原理。
具体步骤如下：1.样品制备：首先，需要从细胞或组织中提取蛋白质，并经过适当的处理，如裂解细胞、破碎细胞膜等，以获取纯净的蛋白质样品。
2. SDS-电泳：将样品加入聚丙烯酰胺凝胶（Polyacrylamide Gel），随后进行电泳。
这一步骤会根据蛋白质的分子大小进行分离。
3.转膜：将分离的蛋白质从凝胶转移到聚乙烯2.2-羟基苯基酮（PVDF）或硝酸纤维素膜上，这样可以更容易进行免疫染色。
4.封闭：将转膜后的膜进行封闭，通常使用牛血清白蛋白（BSA）或脱脂奶粉等阻断非特异性结合位点。
5.抗体反应：加入目标蛋白质特异性的抗体，使其与特定抗原位点结合。
6.洗涤：将膜洗涤以去除非特异性的抗体。
7.免疫染色：加入酶标记的辅助抗体，它与目标抗体结合，并携带可检测信号物质（如酶或荧光染料）。
8.显色：加入合适的底物，使酶标记的辅助抗体产生可视化的颜色或荧光信号。
9.分析：通过成像设备（如X射线胶片或荧光成像系统）观察和记录目标蛋白质的表达。
二、操作流程下面是一份WB实验的基本操作流程，具体步骤可能因实验目的和实验条件而有所变化。
1.样品制备：a.收集细胞或组织样品，并使用适当的缓冲液裂解细胞膜。
b.添加蛋白质提取试剂，并彻底裂解细胞。
c.离心裂解后的细胞，收集上清液，其中含有目标蛋白质。
2.SDS-电泳：a.准备好聚丙烯酰胺凝胶，通常使用8%至12%的分辨胶。
b.加载待测样品和分子量标记蛋白质到凝胶中。
c.进行电泳，常用条件为100V持续电解，直到样品顶到凝胶底部。
3.转膜：a.准备合适大小的PVDF或硝酸纤维素膜，并剪成和凝胶一样大小。
WB实验步骤
WB实验步骤WB实验是一种分离和检测蛋白质的常用实验技术。
以下是WB实验的详细步骤，共分为六个主要步骤。
步骤一：蛋白质提取1.1收集实验所需样本，例如细胞或组织。
如果是细胞样本，可以通过细胞培养离心将细胞沉淀下来。
如果是组织样本，可以通过切割及别的方法收集组织样本。
1.2加入合适的蛋白质提取缓冲液，如RIPA缓冲液，同时加入蛋白酶抑制剂和磷酸酯酶抑制剂，以保护蛋白质的完整性。
1.3震荡或旋转混合样本，使细胞或组织彻底裂解。
1.4将样本在低温下离心，以去除细胞残渣和细胞核等。
1.5收集上清液，其中含有溶解的蛋白质。
步骤二：蛋白质浓度测定2.1 使用BCA蛋白质定量试剂盒或Bradford蛋白质定量试剂盒等试剂，根据试剂盒说明书，测定蛋白质的浓度。
2.2根据蛋白质的浓度调整提取的蛋白质样本的浓度，以保证后续实验的准确性。
步骤三：SDS-电泳3.1准备一定比例的分离凝胶和浓缩凝胶。
通常使用8%-12%的聚丙烯酰胺凝胶。
3.2预运行凝胶，将上清液和蛋白质样本与蛋白负载缓冲液混合，使其达到相同的体积分数，并加入还原剂和SDS。
3.3将混合样品加载到凝胶孔中，根据需要分别加载蛋白质标准，以便确定蛋白质样品的分子量。
3.4设置合适的电泳电压，使蛋白质在凝胶中进行电泳，直至蛋白质通过凝胶前进行分离。
3.5 可以通过染料（如Coomassie blue G-250染色）或银染等方法，可视化分离的蛋白质带。
步骤四：蛋白质转移4.1准备一块聚偏氟乙烯（PVDF）或硝酸纤维膜（NC）作为蛋白质的转移载体，并根据凝胶大小和所需的转移时间切割。
4.2将预运行的蛋白质凝胶和转移载体置于转移装置中，确保凝胶和载体之间没有气泡。
4.3加入冷却的转移缓冲液，确保完全润湿载体，并移除空气泡。
4.4设置合适的转移电流和时间，以将蛋白质从凝胶中转移到膜上。
4.5转移结束后，将膜从转移装置中取出，并立即进行后续处理。
步骤五：免疫检测5.1将膜与阻塞缓冲液溶液处理，以防止非特异性结合。
wb蛋白提取步骤
wb蛋白提取步骤WB蛋白提取步骤引言：WB蛋白提取是一种常用的实验技术，用于研究蛋白质的表达及其相互作用。
本文将详细介绍WB蛋白提取的步骤，包括细胞裂解、蛋白质提取、浓缩和检测等关键步骤。
一、细胞裂解细胞裂解是WB蛋白提取的第一步，旨在破坏细胞膜、细胞核膜以及其他细胞组分，释放出目标蛋白质。
常用的细胞裂解方法有机械法、化学法和生物学方法等。
其中，最常用的方法是使用细胞裂解缓冲液，通过冷冻-解冻或超声波等方式破坏细胞结构。
二、蛋白质提取蛋白质提取是WB蛋白提取的关键步骤之一。
在细胞裂解后，目标蛋白质以及其他细胞组分被释放到裂解液中。
为了提取目标蛋白质，需要将裂解液进行离心，分离出上清液。
上清液中含有目标蛋白质，可以用于后续的蛋白质浓缩和检测。
三、蛋白质浓缩蛋白质浓缩是WB蛋白提取的重要步骤之一，旨在提高目标蛋白质的浓度，便于后续的蛋白质检测。
常用的蛋白质浓缩方法有醋酸沉淀法、酒精沉淀法和尿素沉淀法等。
在浓缩过程中需要注意控制温度和pH值，以避免蛋白质的降解和聚集。
四、蛋白质检测蛋白质检测是WB蛋白提取的最后一步，用于确定提取的蛋白质是否含有目标蛋白以及其相对丰度。
常用的蛋白质检测方法有SDS-PAGE和免疫印迹等。
其中，SDS-PAGE是一种分离蛋白质的电泳方法，可以根据蛋白质的分子量将其分离成不同的条带；免疫印迹则是通过特异性抗体与目标蛋白质结合，然后使用酶标记的二抗进行检测。
总结：WB蛋白提取是一种重要的实验技术，用于研究蛋白质的表达及其相互作用。
其步骤包括细胞裂解、蛋白质提取、蛋白质浓缩和蛋白质检测等。
通过合理选择和操作这些步骤，可以获得高质量的蛋白提取物，为后续的蛋白质研究提供可靠的基础。
参考文献：[1] Bustin SA, Benes V, Garson JA, et al. The MIQE guidelines: minimum information for publication of quantitative real-time PCR experiments. Clin Chem. 2009;55(4):611-622.[2] Towbin H, Staehelin T, Gordon J. Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: procedure and some applications. Proc Natl Acad Sci U S A.1979;76(9):4350-4354.[3] Sambrook J, Fritsch EF, Maniatis T. Molecular cloning: a laboratory manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989.。
WB实验原理
WB实验原理WB实验（Western Blot）是一种常用的生物化学实验技术，用于检测和识别蛋白质。
本文将介绍WB实验的基本原理和步骤，以及其在科研和临床应用中的重要性。
一、WB实验的原理WB实验是通过将复杂的混合物中的蛋白质分离、电泳、转移和检测，来研究特定蛋白质的存在与表达水平。
其原理主要包括以下几个步骤：1. 蛋白质提取与电泳分离：首先，需要从细胞或组织中提取目标蛋白质。
常用的方法包括细胞裂解、超声破碎等。
然后，将提取得到的蛋白质样品进行电泳分离，通常使用聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）。
2. 转移：将分离后的蛋白质通过电泳转移到聚乙烯膜（PVDF）或硝酸纤维素膜上，这样可以使蛋白质固定在膜上，方便后续的检测。
3. 阻断与抗体探针：在转移的蛋白质膜上进行阻断处理，防止非特异性结合和减少背景信号。
然后，通过与目标蛋白质有特异性结合的一抗探针进行孵育，使其与目标蛋白质特异性结合。
4. 二抗与信号发生物：加入与一抗来源物种不同的二抗，二抗具有与一抗结合的能力。
通常，二抗会标记着某种信号发生物，如辣根过氧化物酶（HRP）或碱性磷酸酶（AP），这些信号发生物能够发出具体的发光信号。
5. 显示与分析：通过染色剂与特定的底物反应，使目标蛋白质发出可见的光信号，然后使用成像系统记录光信号。
最后，使用分析软件定量分析蛋白质带的强度。
二、WB实验的步骤根据上述的原理，WB实验的具体步骤如下：1. 细胞裂解：将待检测的细胞或组织进行细胞裂解，使用细胞裂解液溶解细胞膜，并释放目标蛋白质。
2. SDS-PAGE电泳：将提取的蛋白质样品注入电泳胶槽中，通过应用电场，根据蛋白质的大小和电荷分离蛋白质。
3. 蛋白质转移：将分离的蛋白质转移到膜上，通常使用温和的电压和适当的时间进行转移。
4. 阻断与孵育：在转移的膜上进行阻断处理，再用一抗孵育膜，使其与目标蛋白质结合。
5. 二抗与信号发生物：加入与一抗来源物种不同的二抗，再加入信号发生物，使目标蛋白质产生光信号。
WB实验基本步骤
WB实验基本步骤WB实验是一种用于检测和分离目标蛋白质的常用技术，它结合了SDS-和免疫学技术。
以下是WB实验的基本步骤：1.样品制备：首先，需要从细胞，组织或培养物中提取目标蛋白质。
提取方法根据样品的性质而异，可以利用细胞裂解和离心来获取细胞和组织提取物，或者将培养物离心并用PBS洗涤来获取培养物提取物。
提取的样品通常需要加入蛋白酶抑制剂和磷酸盐缓冲液以保持目标蛋白质的完整性。
2. 蛋白质浓度测定：使用BCA、 Lowry或Bradford等标准浓度测定方法，测量目标蛋白质在样品中的浓度。
这是为了确保在加载样品到SDS-胶上时，每个样品都包含相等的蛋白质量。
3. SDS-电泳：将样品加入含有SDS和还原剂的Laemmli试剂，然后通过堆积凝胶（通常是12%）和分离凝胶（通常是4-20%梯度凝胶）分离蛋白质。
SDS在SDS-中提供负电荷，使蛋白质带有均等的负电荷，并且还原剂将蛋白质中的二硫键还原为单硫键，使其线性化。
加载的样品和分子量标尺（如预制的蛋白质标尺）通过电流进行电泳，直到达到所需的分离程度。
4.蛋白转移：将胶上的蛋白质转移到聚丙烯酰胺(PVDF)或硝酸纤维素（NC）膜或其他适用于蛋白质转移的膜上。
通常使用半湿式转移方法，其中将凝胶的胶异型架和转移膜浸泡在转移缓冲液中，并将电流应用于构成电泳腔的两侧。
电流通过凝胶和蛋白质，使蛋白质转移到膜上。
5. 蛋白质定位：使用染色方法（如Ponceau S染色或Coomassie蓝染色）将膜上的蛋白质定位。
这个步骤是为了检查蛋白转移的效果以及加载的标尺和样品之间的分离效果。
染色后，可以测量标尺和目标蛋白质的迁移距离，以及标尺和样品之间的大小分离。
6.阻塞膜：将转移膜浸泡在阻塞缓冲液中，通常是在蛋白质标识位点不与抗体结合的蛋白质（如牛血清白蛋白（BSA）或脱脂奶粉）中。
阻塞的目的是防止未结合的抗体与非特异性蛋白质位点结合。
7.一抗孵育：将目标蛋白质的特异性抗体孵育于阻塞转移膜的缓冲液中。
蛋白提取及Western blot 原理及步骤
蛋白质提取原理：使用机械法破坏细胞膜，将细胞内的蛋白质释放到溶液中，然后通过离心或过滤的方法去除细胞碎片、细胞核和细胞碎片等杂质，以得到较为纯净的蛋白质上清液→通过加入盐或有机溶剂等物质，使蛋白质发生沉淀，然后通过离心将沉淀的蛋白质分离出来→通过柱层析、电泳、凝胶过滤等方法进一步纯化蛋白质，去除其他蛋白质、核酸、小分子物质等杂质，使目标蛋白质得到更高纯度。
方法：组织液氮冷冻，研磨成粉末状→加入适量蛋白提取液，冰上放置20 min→4℃，12000 rpm离心10 min→吸上清，在通风橱加入5×Loading Buffer，99 ℃加热10 min，冰上冷却用于Western bolt 或-20℃保存。
5×Loading Buffer配方：①Tris-HCl (250 mM)：Tris-HCl 是一种缓冲盐，用于维持溶液的酸碱平衡，常用于蛋白质提取过程中调节pH 值的作用；②SDS (10%)：SDS （十二烷基硫酸钠）是一种离子型表面活性剂，具有溶解蛋白质和破坏细胞膜的作用，常用于蛋白质提取和电泳分析中；③BPB (0.5%)：BPB（溴酚蓝）是一种染色剂，常用于帮助观察蛋白质电泳分析结果，以检测样品前进方向和监测蛋白质迁移速度；④甘油(50%)：甘油是一种保护剂，可以增加蛋白质提取液的粘度和稳定性，有利于蛋白质的溶解和保存；⑤β-巯基乙醇(5%)：β-巯基乙醇（巯基乙醇）是一种还原剂，可以断裂蛋白质之间的二硫键，有助于蛋白质的还原和解聚。
Western bolt原理及步骤原理：Western Blot是一种常用的蛋白质检测技术，它能够检测复杂蛋白混合物中的某个蛋白的存在，还可以确定其大致分子量，检测其表达水平变化等。
WB以组织或细胞中的蛋白质为研究对象，经过SDS-PAGE分离蛋白质样品，转移到固相载体（例如硝酸纤维素薄膜）上，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。
WB实验步骤详解
WB实验步骤详解WB实验（Western Blotting）是一种用于检测和鉴定蛋白质的实验技术。
在WB实验中，通常将目标蛋白质从混合蛋白样本中分离出来，然后通过电泳将其分离在聚丙烯酰胺凝胶上，并利用蛋白质转印技术将蛋白质迁移到膜上。
最后，使用特异性抗体进行免疫染色来检测目标蛋白质。
下面是WB实验的详细步骤：1.提取蛋白质：首先，从细胞、组织样本中提取蛋白质。
这个步骤可以使用不同的方法，例如细胞裂解、组织切碎和离心等。
提取的蛋白质可以用于整个WB实验的下一步。
2.蛋白质电泳分离：将提取的蛋白质样本与样品缓冲液混合，然后加载到聚丙烯酰胺凝胶上。
通常使用的凝胶是SDS-（聚丙烯酰胺凝胶电泳），该凝胶根据蛋白质的分子量将其分离开来。
样品加载完毕后，通电进行电泳分离。
较小的蛋白质会迁移到凝胶的上部，较大的蛋白质会停留在凝胶的下部。
3.转印：将电泳分离后的蛋白质转移到膜上。
通常使用的膜是聚偏氟乙烯（PVDF）或硝酸纤维素膜。
在转印之前，通常将凝胶浸泡在转移缓冲液中以增强转印效果。
然后，将凝胶与膜、滤纸层堆叠在一起，将其放置在转印装置中，施加电流进行蛋白质转印。
4.阻断：将转印完成的膜孔洞中的非特异性结合位点进行阻断。
阻断是为了防止以后的抗原-抗体反应受到非特异性结合的干扰。
最常用的阻断剂是1%-5%的非脂牛奶粉或5%-10%的牛血清蛋白。
5.抗体孵育：使用特异性的抗体来检测目标蛋白质。
首先将抗体稀释在主抗体稀释液中，然后将其加到阻断后的膜上进行孵育。
通常在4℃下过夜孵育，使抗体与目标蛋白质结合。
选择合适的抗体对于获得准确的结果非常重要。
6.辅助抗体孵育：将特异性抗体之外的次级抗体添加到膜上，用于识别已结合的主抗体。
这些次级抗体通常与酶（如辣根过氧化物酶）或荧光染料标记进行共轭，以便于标记的抗体的检测。
次级抗体与主抗体结合形成复合物。
7.检测：使用特定的检测方法来显示已结合的抗体。
这些方法可以使用酶标法（如辣根过氧化物酶反应和色素显色）或荧光技术（如荧光染料）。
wb蛋白提取步骤
wb蛋白提取步骤WB蛋白提取步骤引言：WB蛋白提取是一种常用的蛋白质分离和检测方法，广泛应用于生物学研究领域。
本文将介绍WB蛋白提取的步骤，包括细胞裂解、蛋白质浓缩、电泳分离和膜转移等过程。
一、细胞裂解细胞裂解是WB蛋白提取的第一步，主要目的是将细胞膜破坏，释放蛋白质。
细胞裂解的方法有多种，常用的有机械破碎法和化学裂解法。
其中，机械破碎法适用于坚硬的细胞壁，如细菌和酵母菌；而化学裂解法适用于无细胞壁的动物和植物细胞。
二、蛋白质浓缩蛋白质浓缩是为了提高样品中蛋白质的浓度，使其更易于检测。
常用的蛋白质浓缩方法有盐析法、醇沉淀法和凝胶过滤法等。
其中，盐析法是利用蛋白质与盐溶液中的离子相互作用，使蛋白质从溶液中沉淀出来；醇沉淀法则是利用醇与蛋白质的亲和性，使蛋白质在醇溶液中沉淀；凝胶过滤法则是利用蛋白质分子在凝胶中的大小和电荷差异，通过筛选作用将蛋白质从其他物质中分离出来。
三、电泳分离电泳分离是WB蛋白提取的关键步骤，通过电场作用使蛋白质在凝胶上进行分离。
常用的电泳方法有聚丙烯酰胺凝胶电泳和SDS-PAGE电泳。
聚丙烯酰胺凝胶电泳适用于分离较小的蛋白质，其原理是根据蛋白质的分子大小和电荷差异进行分离；而SDS-PAGE电泳则是利用SDS（十二烷基硫酸钠）使蛋白质带负电荷，并根据蛋白质的分子大小进行分离。
四、膜转移膜转移是将电泳分离后的蛋白质转移到膜上，以便进行进一步的检测。
常用的膜转移方法有湿式转移和半干式转移。
湿式转移是将凝胶和膜浸泡在缓冲液中，通过电场使蛋白质从凝胶转移到膜上；而半干式转移则是将凝胶和膜通过滤纸或海绵进行转移，速度更快。
五、膜检测膜检测是WB蛋白提取的最后一步，通过特定的抗体与目标蛋白质结合，并利用染色剂使蛋白质在膜上可见。
常用的膜检测方法有荧光标记法和酶标记法。
荧光标记法是利用荧光标记的抗体与目标蛋白质结合，通过荧光显微镜观察；酶标记法则是利用酶标记的抗体与目标蛋白质结合，通过酶的催化作用产生可见的色素反应。
wb细胞蛋白提取步骤
wb细胞蛋白提取步骤一、背景介绍WB（Western Blot）是一种常用的蛋白质分析方法，通过将蛋白质样品经电泳分离后转移到膜上，再与特异性抗体反应并检测，从而确定目标蛋白的存在与表达水平。
而WB细胞蛋白提取是WB实验的前提，本文将介绍WB细胞蛋白提取的步骤。
二、实验器材准备1. 细胞培养器：细胞培养器是培养细胞的必备设备，可提供适宜的温度、湿度和CO2浓度等环境条件。
2. 细胞离心管：用于离心细胞，分离细胞上清液和细胞沉淀。
3. 细胞裂解液：细胞裂解液是提取细胞蛋白的重要试剂，可选择RIPA缓冲液等。
4. 低温冰箱：用于保存试剂和细胞裂解液等在实验过程中需要低温保存的物品。
5. 离心机：用于离心细胞、沉淀蛋白等。
三、细胞样品准备1. 细胞培养：将需要研究的细胞株在无菌条件下培养至对数生长期。
2. 细胞收集：用PBS等缓冲液洗涤细胞，使细胞悬浮液中不含有培养基或其他杂质。
3. 细胞裂解：将细胞悬浮液加入细胞裂解液中，用震荡器或超声波仪器进行细胞裂解。
四、细胞蛋白提取1. 细胞裂解：将细胞裂解液和细胞悬浮液混合，通过震荡器或超声波仪器进行细胞裂解，破坏细胞膜释放细胞内的蛋白质。
2. 离心：将细胞裂解液离心，分离出细胞碎片和细胞膜等残留物，得到上清液。
3. 蛋白含量测定：使用BCA或Bradford方法等，测定提取的蛋白液中的蛋白质浓度，以便后续实验的样品配比。
4. 储存：将提取的蛋白液分装成适量的小管，存放在低温冰箱中保存，避免蛋白质降解和污染。
五、质检和实验准备1. SDS-PAGE凝胶制备：根据需要分离的蛋白质大小，选择合适的凝胶浓度，制备SDS-PAGE凝胶。
2. SDS-PAGE电泳：将提取的蛋白液按照浓度进行加载，进行电泳分离。
3. 转膜：将电泳分离后的蛋白质转移到PVDF或nitrocellulose膜上，使蛋白质固定在膜上。
4. 阻断：将转膜后的膜放入蛋白质阻断液中，阻断膜上未结合的部分空位。
wb实验基本步骤.doc
wb实验基本步骤.doc
WB实验是一种常见的实验方法，主要用于检测特定蛋白质在样本中的含量和分子量，通常用于生物化学、免疫学和分子生物学等领域的研究。
以下是WB实验的基本步骤：
1、制备蛋白提取液：首先需要将要检测的细胞、组织等样本分别加入不同的缓冲液中进行细胞破碎和蛋白提取，以获得纯度较高的蛋白提取液。
2、电泳：将提取的蛋白质样品通过电泳进行分离，通常会使用SDS-PAGE凝胶进行分离。
将不同分子量的蛋白质分别移动到凝胶上的不同位置，以便之后的检测。
3、转移：将凝胶上的蛋白质转移到聚乙烯膜或硝酸纤维素膜上，通常使用电泳转移法，将蛋白质从凝胶中转移至聚乙烯膜或硝酸纤维素膜上，以便后续的抗体检测。
4、阻断：用牛血清白蛋白或者干奶粉等物质对转移膜进行阻断，避免后续的抗体与非目标蛋白质结合。
将药液涂抹在膜上，使其涂满，然后放在室温或冰箱中进行阻断。
5、抗体反应：将目标蛋白质的抗体与转移膜中的蛋白质结合，用于识别其中的目标蛋白质。
将稀释好的抗体液滴到转移膜上，可以进行全膜反应或局部反应，稍作震荡和轻轻摇晃。
6、显色：将荧光素和遥光素添加到转移膜上，用于显示蛋白质的分布位置和含量。
将荧光素和遥光素稀释好涂在膜上，等待5~10分钟后进行观察。
7、数据分析：通过使用图像分析软件对转移膜蛋白质条带进行测量，得到蛋白质的含量和分子量等数据。
尽可能准确地确定目标蛋白质的含量和分子量等信息。
WB实验步骤详解
WB实验步骤详解WB实验是一种常用的生化实验方法，用于检测和分析蛋白质的表达水平和相互作用。
下面将详细介绍WB实验的步骤。
1.细胞裂解首先，将感兴趣的细胞收集并放入细胞裂解缓冲液中，通过机械剪切或超声波处理使细胞完全破裂，并释放细胞内的蛋白质。
常用的细胞裂解缓冲液包括RIPA缓冲液或NP-40缓冲液。
2.蛋白质提取将裂解后的细胞溶液离心，将上清液转移到新的离心管中。
通过离心去除细胞碎片等固体物质。
上清液中含有溶解的蛋白质，可以用于后续的分析。
3.电泳分离制备SDS-凝胶，将蛋白质样品加入凝胶孔中。
电泳分离过程中，蛋白质会按照其分子量大小在凝胶中移动。
较小的蛋白质移动较快，较大的蛋白质移动较慢。
4.转膜将分离后的蛋白质从凝胶上转移到聚合物膜上，一般使用半湿式或干转膜法。
湿式转膜使用蛋白质转移缓冲液进行转膜，在电场作用下将蛋白质从凝胶中转移到膜上。
干转膜则是将分离后的凝胶与膜一同放在压力箱中，在应用压力的同时进行转膜。
5.封闭在转膜后的聚合物膜上加入封闭缓冲液，使膜表面被封闭，防止非特异性结合。
6.第一次抗体孵育将感兴趣的蛋白质的抗体加入孵育缓冲液中，并将聚合物膜放入缓冲液中孵育。
第一次抗体与目标蛋白质特异性结合。
7.洗脱孵育后，使用洗涤缓冲液洗去未结合的一次抗体。
8.第二次抗体孵育将与目标蛋白质结合的一次抗体加入孵育缓冲液中，并将聚合物膜放入缓冲液中进行孵育。
第二次抗体能够识别一次抗体，并与之特异性结合。
9.洗脱孵育后，使用洗涤缓冲液洗去未结合的第二次抗体。
10.显色将显色试剂加入滤膜中，使蛋白质与试剂反应发生染色反应。
常用的显色试剂有染色剂DAB（二氨基联苯酚）或ECL（增强型化学发光）试剂。
11.影像获取使用实验室常用的成像设备，如X光片胶片、化学发光成像设备或荧光成像设备，将染色后的滤膜拍摄下来或记录下来。
可以通过影像获取软件进行蛋白质带的密度分析。
12.数据分析使用数据分析软件，对得到的数据进行定量分析和比较。
蛋白提取及WB步骤
Western blot 实验1）蛋白裂解液的配制:Urea（7 M）4.2 g，Thiourea（2 M）1.52 g，CHAPS（4% W/V）0.4 g，DTT （1% W/V）0.1 g，ddH2O加至10 ml，1 ml/管分装-20℃保存备用；1 ml分装的裂解液中用前加入Cocktail（1% V/V）10 μl，混匀后于冰上放置备用。
我们用的是国产的碧云天的全蛋白提取试剂盒2）蛋白样品制备（1）取组织，称重，按照W:V = 1:6的比例加入蛋白裂解液；（2）用匀浆器对组织进行匀浆，匀成糊状。
（3）4 ℃，冰上放置30min，每10 min振荡一次；（4）4 ℃，12000 g 离心30 min，吸上清，分装置于-70 ℃待用。
3）蛋白浓度测定（Bradford法）试剂配制：考马斯亮蓝染色液：考马斯亮蓝G250 0.05 g，95%乙醇25 ml，H3PO4 50 ml，ddH2O加至500 ml，过滤后储存于4 ℃。
牛血清白蛋白（BSA）：1 mg/ml步骤：按下列体系配置溶液，混匀后，静置5 min后，测OD值（波长595 nm），将OD值输入Excel进行数据处理，计算出相关系数，当相关系数>0.99才具有可信度。
取待测标本，正确设置reference，取适量标本，进行浓度测定。
管号BSA（1 mg/ml）0.9% NaCl/0.1 M PBS 考染液0 0 200 μl 1 ml1 5 195 μl 1 ml2 10 190 μl 1 ml3 15 185 μl 1 ml4 20 180 μl 1 ml5 25 175 μl 1 ml我们用的是国产碧云天的BCA蛋白浓度测定试剂盒。
4）聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）（1）凝胶制备：30.8%丙烯酰胺：丙烯酰胺30 g，甲叉双丙烯酰胺0.8 g，ddH2O加至100 ml，置于通风橱内搅拌直至丙烯酰胺完全溶解，用0.45 μm微孔滤膜过滤后4 ℃保存于棕色瓶中备用。
wb实验的原理和步骤
wb实验的原理和步骤WB实验的原理和步骤。
一、实验原理。
WB实验，即Western Blot实验，是一种常用于检测蛋白质的实验方法。
它通过电泳将蛋白质分离开来，然后用特定的抗体结合目标蛋白，最后通过化学发光或染色等方法来检测目标蛋白的存在与表达水平。
在WB实验中，主要包括蛋白质电泳分离、转膜、抗体结合和检测等步骤。
下面将详细介绍WB实验的步骤及操作要点。
二、实验步骤。
1. 蛋白质电泳分离。
首先，将待测样品加入SDS-PAGE凝胶槽中，进行蛋白质电泳分离。
电泳结束后，将蛋白质转移到聚丙烯酰胺凝胶膜上。
2. 蛋白质转膜。
将电泳分离后的蛋白质转移到聚丙烯酰胺凝胶膜上，通常采用湿法转膜或半干法转膜。
转膜后，将膜进行封闭处理，以防止非特异性结合。
3. 抗体结合。
将待测蛋白质与特异性一抗进行孵育结合，然后进行洗脱，接着与辣根过氧化物酶标记的二抗结合。
最后再次进行洗脱，以去除非特异性结合。
4. 检测。
通过化学发光或染色等方法来检测目标蛋白的存在与表达水平。
化学发光法是常用的检测方法之一，它通过特定底物的化学反应产生发光信号，用于检测目标蛋白的存在与表达水平。
三、实验操作要点。
1. 实验前的准备工作要做到充分，包括准备好所需试剂、仪器设备的检查和调试等。
2. 在操作过程中要严格遵守操作规程，保证实验的准确性和可靠性。
3. 注意实验中各步骤的时间控制，避免步骤之间的等待时间过长或过短。
4. 蛋白质转膜时要注意膜的完整性和均匀性，避免出现膜上蛋白质分布不均匀的情况。
5. 在抗体结合和检测过程中，要注意洗脱的次数和时间，严格控制非特异性结合的发生。
6. 实验结束后，要及时清洗和维护仪器设备，妥善保存实验结果和数据。
通过以上步骤和操作要点的介绍，相信大家对WB实验的原理和操作有了更清晰的认识。
在进行实验操作时，一定要认真细致，严格按照操作规程进行，确保实验结果的准确性和可靠性。
希望本文对大家有所帮助，谢谢阅读！。
wb细胞蛋白提取步骤
wb细胞蛋白提取步骤WB细胞蛋白提取步骤引言：WB（Western Blot）是一种常用的蛋白质分析技术，通过该技术可以检测特定蛋白质的存在与表达水平。
而WB细胞蛋白提取是进行WB实验的关键步骤之一，本文将详细介绍WB细胞蛋白提取的步骤。
步骤一：细胞收集需要从培养皿中收集目标细胞。
将细胞培养液倒入50 mL离心管中，离心5分钟（1000 rpm），将上清液去除，留下沉淀的细胞。
步骤二：洗涤细胞将细胞沉淀用无菌PBS洗涤3次，每次洗涤后离心5分钟（1000 rpm），去除上清液。
步骤三：细胞裂解将洗涤后的细胞沉淀加入适量的细胞裂解液（如RIPA缓冲液），并加入蛋白酶抑制剂。
用移液管反复吸取和排放细胞裂解液，使细胞完全裂解。
将细胞裂解液放置在冰上浸泡20分钟，促使细胞内蛋白质释放。
步骤四：离心细胞裂解液将细胞裂解液离心10分钟（12000 rpm），将上清液转移到新的离心管中，以避免沉淀物对后续实验的干扰。
步骤五：测定蛋白浓度采用BCA方法或其他合适的蛋白浓度测定方法，测定细胞裂解液中的蛋白质浓度。
步骤六：蛋白样品制备将细胞裂解液中的蛋白质与蛋白加载缓冲液按照一定比例混合，加入适量的蛋白酶抑制剂，并进行煮沸处理。
煮沸处理的目的是使蛋白质变性，并使其在WB实验中得到更好的分离和检测。
步骤七：SDS-PAGE电泳将蛋白样品加载到SDS-PAGE凝胶中，进行电泳分离。
可以根据需要选择合适的凝胶浓度和电泳条件，以获得最佳的蛋白分离效果。
步骤八：蛋白转膜将电泳分离后的蛋白转移到聚合物膜（如PVDF膜）或硝酸纤维素膜上，可以使用湿法或半湿法转膜方法。
转膜后，可以用荧光素或染色剂对膜进行染色，以观察蛋白质的迁移情况。
步骤九：膜孔堵塞为了防止非特异性结合，需要对转膜后的膜进行堵塞处理。
一般使用5%的脱脂奶粉或3%的BSA等溶液进行堵塞，在室温下搅拌1小时或过夜。
步骤十：一抗孵育将膜与一抗溶液孵育，一抗可以是特异性抗体，用于检测目标蛋白的存在。
wb蛋白提取步骤
wb蛋白提取步骤WB蛋白提取步骤一、引言WB（Western Blot）蛋白提取是一种常用的蛋白质分析方法，通过将样品中的蛋白质分离、定量和检测，可以研究蛋白质的表达水平、功能和相互作用等。
本文将介绍WB蛋白提取的步骤及操作要点。
二、样品准备1. 收集样品：根据研究目的，选择合适的样品进行提取。
样品可以是细胞、组织、血清、培养基等。
2. 样品处理：对于细胞和组织样品，可先用PBS缓冲液洗涤去除残留的培养基或组织液。
对于血清样品，可离心去除悬浮的细胞或血小板。
三、蛋白提取1. 细胞裂解：将细胞沉淀离心后，加入细胞裂解液，使细胞膜破裂释放蛋白质。
可以选择不同的细胞裂解液，如RIPA缓冲液、NP-40缓冲液等。
2. 组织裂解：将组织样品切碎后，加入组织裂解液，将组织细胞破碎并释放蛋白质。
组织裂解液可以选择RIPA缓冲液、Tris-HCl缓冲液等。
3. 蛋白质提取：将裂解液离心，收集上清液，即为蛋白提取物。
可以通过BCA方法或Lowry方法等测定蛋白质的浓度。
四、蛋白质分离与检测1. SDS-PAGE凝胶电泳：将蛋白样品加热变性，然后加载到凝胶孔中，施加电场使蛋白质在凝胶中进行分离。
常用的凝胶浓度为8%~15%。
2. 转膜：将凝胶中的蛋白质转移到膜上，常用的转膜方法有湿式转膜和半干式转膜。
常用的膜材料有PVDF膜和NC膜。
3. 阻断与孵育：将转膜后的膜放入阻断液中进行孵育，阻断非特异性结合位点，避免假阳性结果的产生。
4. 一抗和二抗孵育：将目标蛋白特异性抗体（一抗）孵育于膜上，然后孵育与一抗结合的二抗，二抗中带有标记物，例如辣根过氧化物酶（HRP）等。
5. 显色与成像：使用化学发光法或染色法，使膜上特定蛋白质形成显色带，然后使用成像系统进行成像和分析。
五、结果分析通过观察显色带的位置和强度，可以初步判断蛋白质的表达水平。
根据需要可以进行定量分析，使用专业软件测量带的强度，并与内参蛋白进行比较分析。
六、注意事项1. 样品保存：样品提取后应及时保存，避免蛋白质降解。
wb组织蛋白提取方法
wb组织蛋白提取方法WB组织蛋白提取方法引言：WB（Western Blotting）是一种常用的蛋白质检测方法，通过将待检测的蛋白质进行电泳分离，然后转移到膜上，再用特异性抗体进行检测。
WB组织蛋白提取是进行WB实验的重要前提，正确的提取方法能够保证蛋白质的完整性和浓度，从而获得准确可靠的实验结果。
一、准备工作1. 材料准备：组织样本、液氮、无菌离心管、摇床、离心机、清洗液（PBS）、RIPA裂解液、丙酮、蛋白酶抑制剂等。
2. 工具准备：离心管架、离心管盒、离心管架盖、冰桶、温度计等。
二、组织样本的采集和处理1. 组织样本的采集：将所需的组织样本取出并迅速置于液氮中，确保样本冷冻速度快，避免蛋白质降解。
2. 组织样本的处理：将组织样本放入无菌离心管中，加入适量的PBS缓冲液，用摇床低速摇动几分钟使组织均匀悬浮。
三、组织样本的裂解和离心1. 组织样本的裂解：将PBS悬浮液倒入离心管中，加入适量的RIPA裂解液和蛋白酶抑制剂，充分混合后放置冰上浸泡30分钟至1小时，使细胞完全裂解释放蛋白质。
2. 组织样本的离心：将裂解液离心10分钟，离心速度为12000rpm，将上清液转移到新的离心管中，避免沉淀物的污染。
四、蛋白质的沉淀和洗涤1. 蛋白质的沉淀：向上清液中加入4倍体积的丙酮，充分混合后放置-20℃冰箱中沉淀过夜，使蛋白质充分沉淀。
2. 蛋白质的洗涤：将离心管取出，离心10分钟，离心速度为12000rpm，将上清液倒掉，加入无菌PBS缓冲液洗涤2次，以去除丙酮等残留物。
五、蛋白质的溶解和浓度的测定1. 蛋白质的溶解：向离心管中加入适量的RIPA裂解液，用摇床低速摇动几分钟使蛋白质充分溶解。
2. 蛋白质浓度的测定：使用BCA或Lowry方法等蛋白质浓度检测试剂盒，按照说明书进行操作，得到蛋白质的浓度。
六、蛋白质的保存和使用1. 蛋白质的保存：将提取的蛋白质分装至无菌离心管中，分别存放于-80℃冰箱中或液氮中，避免蛋白质降解。
WB实验步骤详细总结
蛋白提取(所有操作在冰上进行）1.裂解1)配裂解液：PMSF=100：1，（裂解液和PMSF在-20℃保存,提前一天4℃解冻)取2ml裂解液，加20μl PMSF混匀2)称取30mg组织，切碎放入标记好的AP管中,加入600μl上述1中液体(加入液体与组织比例为20:1)，冰上静置10min2.匀浆先用超纯水润洗一下匀浆机的钢头,(同时进行几组匀浆时,组间也要润洗钢头）在匀浆机（在生化室）上每次匀浆10s,两次(间隔5s）,冰上静置30min3.离心(在基础4楼416室)1)自带1ml枪以及蓝枪头和黄枪头，三个1.5的离心管（①,②两个标记，③加少量超纯水，③号是为了离心平衡，对称放置）2)将离心机预冷至4℃为止，以1200×10r/min离心15min3)用移液枪将上层清液取出放入①②号管中4.变性（上样缓冲液：样品=4：1）将样品转移至2~3个0.5mlAP管中加上样缓冲液，100℃变性10min仪器屏幕：5.保存变性结束后，打开AP管盖放一下气，然后4℃保存，点样是取出即可用WB实验步骤1.清洗玻璃板：清洗玻璃板后风干，将玻璃板对齐后放入夹中卡紧，操作时要使两玻璃对齐，以免漏胶。
2.配制分离胶1)准备：1ml枪（蓝色枪头)，200μl枪（黄色枪头）10μl（白色枪头）2)10％分离胶的配置:（用50ml烧杯。
1。
0mm板配1。
5块胶，1.5mm板配2块板）3.灌胶沿玻璃板右上角缓慢匀速加入分离胶（用1ml移液枪，不要将移液管内液体完全打出防止气泡）保持液面平稳上升至上方绿色线为止4.水封立即用1ml超纯水进行水封(利用重力把胶压平），如有气泡则用针头吸出防止影响电泳效果，等待20-30min5.浓缩胶的配制（5％)6. 电泳（电泳液最多使用两次）1)安装电泳装置低板对内，上方夹住，往两板中加入电泳液至黑线并观察是否漏液，缓慢拔掉梳子（注意两手平衡拔出防止拔歪)2) 点样(不易时间过长,防止样品条带扩散）3)连接电泳仪电泳池与电泳盖连接：黑对黑，红对红电永池的两个电极插入电极盖孔内,打开开关恒压电泳 先调电压至70mV ，跑约20min 。
蛋白质印迹(Western blotting)实验操作步骤
蛋白质印迹/Western blotting实验操作步骤一、总蛋白的提取单层贴壁细胞总蛋白的提取：1)吸除培养液2)每皿细胞加4℃预冷的 PBS。
平放轻轻摇动 1min 洗涤细胞，然后弃去洗液。
重复上操作两次，共洗细胞三次以洗去培养液。
将PBS弃净后把培养瓶置于冰上。
（PBS会降低细胞裂解液的效价和总蛋白的浓度）3)加裂解液于冰上裂解 30 min，为使细胞充分裂解，培养瓶要经常来回摇动（可放置在4℃摇床裂解）。
4)裂解完后，用干净的刮棒将细胞刮于培养瓶的一侧（动作要快），然后用枪将细胞碎片和裂解液移至 1.5mL 离心管中。
（整个操作尽量在冰上进行）5)在EP管中将细胞震碎（10s/次，3次）6)于4℃下 12000rpm 离心 20-30 min。
（离心机提前预冷至4℃）7)将离心后的上清分装转移倒 1.5mL 的离心管中放于－20℃保存。
二、BCA法测蛋白浓度1)将BCA protein assay每孔 A液200μL,B液4μL混合，96孔板每孔加入22.5μLdd水，2.5μL蛋白提取液，200μLA+B混合液2)在烘箱中37℃，90r，孵育30min3)使用酶标仪测出吸光度后，使用公式y=0.9154x-0.118计算出蛋白浓度（浓度需要×10）4)将蛋白配成等浓度等体积（使用配置好的裂解液配），按照4：1加入5X loading buffer然后煮5min（100℃），放入-20℃保存三、SDS-PAGE电泳板子1.5mm，梳子1.5mm1）清洗玻璃板：一只手扣紧玻璃板，另一只手蘸点洗衣粉轻轻擦洗。
两面都擦洗过后用自来水冲洗2）验漏：玻璃板对齐后放入夹中卡紧，然后垂直卡在架子上，加满水验漏3）灌胶：验漏结束后用纸吸干水分，按方法配制下层胶（4mL+4mL+80μLAP),灌胶时，可用 1mL 枪吸取胶沿玻璃放出，待胶面升到绿带中间线高度时即可。
然后胶上加1 mL水，液封后的胶凝的更快。
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Western blot 实验
1）蛋白裂解液的配制:
Urea（7 M）4.2 g，Thiourea（2 M）1.52 g，CHAPS（4% W/V）0.4 g，DTT （1% W/V）0.1 g，ddH2O加至10 ml，1 ml/管分装-20℃保存备用；1 ml分装的裂解液中用前加入Cocktail（1% V/V）10 μl，混匀后于冰上放置备用。
我们用的是国产的碧云天的全蛋白提取试剂盒
2）蛋白样品制备
（1）取组织，称重，按照W:V = 1:6的比例加入蛋白裂解液；
（2）用匀浆器对组织进行匀浆，匀成糊状。
（3）4 ℃，冰上放置30min，每10 min振荡一次；
（4）4 ℃，12000 g 离心30 min，吸上清，分装置于-70 ℃待用。
3）蛋白浓度测定（Bradford法）
试剂配制：
考马斯亮蓝染色液：考马斯亮蓝G250 0.05 g，95%乙醇25 ml，H3PO4 50 ml，ddH2O加至500 ml，过滤后储存于4 ℃。
牛血清白蛋白（BSA）：1 mg/ml
步骤：按下列体系配置溶液，混匀后，静置5 min后，测OD值（波长595 nm），将OD值输入Excel进行数据处理，计算出相关系数，当相关系数>0.99才具有可信度。
取待测标本，正确设置reference，取适量标本，进行浓度测定。
管号BSA（1 mg/ml）0.9% NaCl/0.1 M PBS 考染液
0 0 200 μl 1 ml
1 5 195 μl 1 ml
2 10 190 μl 1 ml
3 15 185 μl 1 ml
4 20 180 μl 1 ml
5 25 175 μl 1 ml
我们用的是国产碧云天的BCA蛋白浓度测定试剂盒。
4）聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）
（1）凝胶制备：
30.8%丙烯酰胺：丙烯酰胺30 g，甲叉双丙烯酰胺0.8 g，ddH2O加至100 ml，
置于通风橱内搅拌直至丙烯酰胺完全溶解，用0.45 μm微孔滤膜过滤后4 ℃保存于棕色瓶中备用。
1.5M Tris（pH8.8）：Tris 18.17 g，HCl调至pH8.8，ddH2O至100 ml；
经验配制：配制1.5 M Tris（pH8.8）500 ml时直接加入10 M HCl（即HCl 原液）15 ml，不用再调pH。
0.5M Tris（pH6.8）：Tris 6.057 g，ddH2O加至100 ml，HCl调至pH 6.8。
10%SDS：SDS 1 g，ddH2O加至10 ml。
10%过硫酸铵：过硫酸铵0.1 g，ddH2O加至1 ml。
电泳缓冲液：Tris 3.02 g，甘氨酸14.4 g，SDS 1 g，ddH2O加至1000 ml。
转膜缓冲液：Tris（15.6 mM）1.93 g，甘氨酸（120 mM）9 g，ddH2O至1000 ml。
凝胶制备：
成分12%分离胶（5 ml）5%浓缩胶（4 ml）
30.8%丙烯酰胺 2.0 ml 0.67 ml
1.5M Tris（pH8.8） 1.3 ml --
0.5M Tris（pH6.8）-- 0.5 ml
10%过硫酸铵0.05 ml 0.04 ml
10%SDS 0.05 ml 0.04 ml
TEMED 0.002 ml 0.004 ml
H2O 1.6 ml 2.7 ml
步骤：将电泳槽装置安装好，根据需要量配置分离胶，灌注，用饱和正丁醇封液面，室温30 min~60 min待胶凝固后，去除正丁醇，配制浓缩胶，灌注，将加样梳放入，室温30 min~60 min待胶凝固后即可上样电泳；
（2）上样：将蛋白质标本中加入2×Loading Buffer [0.2%（g/v）bromophenol blue, 4%（g/v）SDS, 20% glycerol，200 mM 2-mercaptoethanol（DTT）, 100 mM Tris（pH 6.8）]，煮沸5 min~10 min，12000 rpm离心后加样；
（3）电泳：浓缩胶10 mA恒流电泳至交界处，分离胶20 mA恒流电泳至溴酚蓝到达凝胶下缘，可根据蛋白分子量的大小确定电泳的位置；
我们是bioworld的机子，一般可以电泳用恒压80V跑到底。
5）Western blot分析
（1）半干转膜仪转膜（具体和实验室机子有关）：剪与凝胶大小一致的PVDF 膜一张（膜用之前的处理：甲醇浸泡min,ddH2O浸泡5min，然后和滤纸一起泡到转缓里），滤纸12张，浸泡于转膜缓冲液中至少20 min，先将滤纸逐层置于转膜仪上，用下胶尺逐层赶尽气泡，加上PVDF膜，赶尽膜与滤纸间的气泡，将聚丙烯酰胺凝胶放在PVDF膜上，赶尽凝胶与尼膜之间的气泡，逐层加上滤纸，要尽量排放整齐；按照0.8 mA/cm2~1 mA/cm2的功率恒流转膜2 h~2.5 h。
注意正负极。
我们一般用的是250ma转两个小时。
（2）将PVDF膜放入含5%脱脂奶粉的TBS中封闭2 h；
（3）加入5%脱脂奶粉稀释的一抗，4 ℃过夜；
（4）次日用TBS洗3次，每次10 min；
（5）加入HRP结合的二抗，37 ℃，1 h；
（6）TBS洗4次，每次10 min；
（7）显影：这个是根据各个实验室的设备。