凝胶过滤层析常见问题解析
生物化学习题（含答案解析）
1变性后的蛋白质变性后的蛋白质,,其主要特点是A 、分子量降低B 、溶解度增加C 、一级结构破坏D 、不易被蛋白酶水解E 、生物学活性丧失正确答案：E答案解析：蛋白质变性的特点：生物活性丧失溶解度降低粘度增加结晶能力消失易被蛋白酶水解。
蛋白质变性：是蛋白质受物化因素（加热、乙醇、强酸、强碱、重金属离子、生物碱试剂等）的影响，改变其空间构象被破坏，导致其理化性质的改变和生物活性的丧失。
一级结构不受影响，不分蛋白质变性后可复性。
2下列蛋白质通过凝胶过滤层析柱时下列蛋白质通过凝胶过滤层析柱时,,最先被洗脱的是A 、MB(Mr:68500)B 、血清白蛋白、血清白蛋白(Mr:68500) (Mr:68500)C 、牛ν-乳球蛋白乳球蛋白(Mr:35000) (Mr:35000)D 、马肝过氧化氢酶、马肝过氧化氢酶(Mr:247500) (Mr:247500)E 、牛胰岛素、牛胰岛素(Mr:5700) (Mr:5700) 正确答案：D答案解析：凝胶过滤层析，分子量越大，最先被洗脱。
3蛋白质紫外吸收的最大波长是A 、250nm B 、260nm C 、270nm D 、280nm E 、290nm 正确答案：D答案解析：蛋白质紫外吸收最大波长280nm 280nm。
DNA 的最大吸收峰在260nm 260nm（显色效应）（显色效应）。
4临床常用醋酸纤维素薄膜将血浆蛋白进行分类研究临床常用醋酸纤维素薄膜将血浆蛋白进行分类研究,,按照血浆蛋白泳动速度的快慢按照血浆蛋白泳动速度的快慢,,可分为A 、α1、α2、β、γ白蛋白B 、白蛋白、γ、β、α1、α2C 、γ、β、α1、α2、白蛋白D 、白蛋白、α1、α2、β、γE 、α1、α2、γ、β白蛋白正确答案：D答案解析：醋酸纤维素薄膜电泳血浆蛋白泳动速度的快慢，白蛋白、α1白蛋白、α1--球蛋白、α2球蛋白、α2--球蛋白、β球蛋白、β--球蛋白、γ球蛋白、γ--球蛋白背吧5血浆白蛋白的主要生理功用是A 、具有很强结合补体和抗细菌功能B 、维持血浆胶体渗透压C 、白蛋白分子中有识别和结合抗原的主要部位D 、血浆蛋白电泳时、血浆蛋白电泳时,,白蛋白泳动速度最慢E 、白蛋白可运输铁、铜等金属离子 正确答案： B答案解析：血浆白蛋白的生理功用1、在血浆胶体渗透压中起主要作用，提供7575－－80%80%的血浆总胶体渗透压。
凝胶层析法(凝胶过滤)脱盐和分离蛋白质-1
凝胶层析法(凝胶过滤)脱盐和分离蛋白质-1原理凡盐析所获得的粗制蛋白质（盐析得到的IgG）中均含有硫酸铵等盐类，这类将影响以后的纯化，所以纯化前均应除去，此过程称为“脱盐”（desalthing）。
脱盐常用透析法和凝胶过滤法，这两种方法各有利弊。
前者的优点是透析后析品终体积较小，但所需时间较长，且盐不易除尽；凝胶过滤法则能将盐除尽，所需时间也短，但其凝胶过滤后样品体积较大。
所以，要根据具体情况选择使用。
凝胶达滤后样品体积不会太增加，所以选用凝胶过滤法。
凝胶过滤（gel filtration），又称为凝胶层析（gel chromatograph y）、分子筛过滤（molecularsieve filtration）、凝胶渗透层析（gel osmotic chromatography）等。
它是20世纪60年代发展起来的一种层析技术。
其基本原理是利用被分离物质分子大小不同及固定相（凝胶）具有分子筛的特点，将被分离物质各成分按分子大小分开，达到分离的方法。
凝胶是由胶体粒子构成的立体网状结构。
网眼里吸满水后凝胶膨胀呈柔软而富于弹性的半固体状态。
人工合成的凝胶网眼较均匀地分布在凝胶颗粒上有如筛眼，小于筛眼的物质分子均可通过，大于筛眼的物质分子则不能，故称为“分子筛”。
凝胶之所以能将不同分子的物质分开是因为当被分离物质的各成分通过凝胶时，小于筛眼的分子将完全渗入凝胶网眼，并随着流动相的移动沿凝胶网眼孔道移动，从一个颗粒的网眼流出，又进入另一颗粒的网眼，如此连续下去，直到流过整个凝胶柱为止，因而流程长、阻力大、流速慢；大于筛眼的分子则完全被筛眼排阻而不能进入凝胶网眼，只能随流动相沿凝胶颗粒的间隙流动，其流程短、阻力小、流速快，比小分子先流出层析柱；小分子最后流出。
分子大小介于完全排阻不能进入或完全渗入凝胶筛眼之间的物质分子，则居中流出。
这样被分离物质即被按分子的大小分开。
用于凝胶层析的凝胶均为人工合成的产品，主要有交联葡聚糖（商品名为Sephadex）、琼脂糖（商品名为Sepharose）、聚丙烯酰胺凝胶（商品名为Bio–gel）及具有一定网眼的细玻璃珠等和这些凝胶的衍生物。
凝胶过滤及离子交换层析介质详解
温度对分离效果也有一 定影响，可以通过控制 实验温度来优化分离效 果。
案例分享：成功应用案例剖析
案例一
使用琼脂糖凝胶成功分离大分子蛋白质混合物，通过优化流动相和洗脱条件，实现了高 纯度蛋白质的获取。
案例二
应用离子交换层析技术成功分离了复杂样品中的痕量金属离子，通过选择合适的离子交 换树脂和优化实验条件，提高了分离效果和检测灵敏度。
现状
目前，凝胶过滤层析介质已经广泛应用于生物大分子的分离纯化，如蛋白质、酶、多糖等。同时，随着技术的不 断进步，新型凝胶过滤层析介质不断涌现，为生物分离领域提供了更多的选择。
应用领域与前景
要点一
应用领域
凝胶过滤层析介质在生物医药、生物工程、食品科学等领 域具有广泛的应用。例如，在生物医药领域，可用于药物 的分离纯化、蛋白质组学研究、抗体药物研发等；在生物 工程领域，可用于基因工程产物的分离纯化、酶工程产物 的分离纯化等；在食品科学领域，可用于食品添加剂的分 离纯化、功能性食品的研发等。
对未来发展趋势进行预测
层析技术的创新与应用拓展
随着科学技术的不断发展，层析技术将继续创新并拓展应用领域。例如，开发新型高效层析介质、优化层析条件、提 高分离效率等。
与其他技术的联合应用
层析技术可以与多种其他技术联合应用，如质谱、光谱等，实现复杂样品的高效分离和检测。这种联合应用将在未来 得到更广泛的关注和应用。
在生物医药等领域的应用前景
生物医药等领域对高纯度、高活性物质的需求不断增加，层析技术作为一种重要的分离纯化方法，将在 这些领域发挥越来越重要的作用。
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离子交换层析介质
根据目标离子的电荷性质和大小，选择合适的离子交换树脂，如阳离子
凝胶层析注意事项
凝胶层析注意事项凝胶层析是一种常用的分离技术，其原理是利用基质中化学成分在固相凝胶上的分配率差异，实现化合物的分离和纯化。
在进行凝胶层析实验时，需要注意以下几个方面：1. 选择合适的凝胶材料：根据所需要分离的物质的特性，选择适当的凝胶材料。
常见的凝胶材料有聚丙烯酰胺凝胶、琼脂糖凝胶等。
需要根据分子量、电荷性质和疏水性等因素选择合适的凝胶材料。
2. 准备凝胶：凝胶层析实验中，制备凝胶的过程非常重要。
需要注意凝胶的质量，尽量避免制备过程中出现空隙或者气泡。
应根据实验需要调整凝胶的浓度和孔径大小，以确保能够将待分离物质分离开来。
3. 样品预处理：在进行凝胶层析实验之前，需要对待分离的样品进行预处理。
一般来说，预处理包括蛋白质的去除、富集或者纯化，以及样品的去盐、去色等操作。
预处理的目的是提高样品的纯度和分离效果。
4. 蛋白样品的加载量：在进行凝胶层析实验时，需要控制好蛋白样品的加载量。
过多的样品会导致样品分离不净，而过少的样品则可能会导致分离效果不理想。
因此，需要根据实验的要求和凝胶的大小选择合适的加载量。
5. 缓冲液的选择：在凝胶层析实验中，选择合适的缓冲液非常重要。
缓冲液对于维持凝胶的pH值稳定以及样品分离的效果有着重要的影响。
需要选择合适的缓冲液体系，并根据实验需要调整缓冲液的浓度和pH值。
6. 电泳条件的设置：在进行凝胶层析实验时，电泳条件的设置直接影响实验结果。
电泳的时间、电压以及温度等因素需要根据实验的要求进行合理的调整。
过高的电压可能会导致凝胶破裂，而过低的电压则可能会影响样品的分离效果。
7. 结果分析：在凝胶层析实验结束后，需要对结果进行分析和解读。
根据实验结果，判断分离效果和样品纯度，以确定实验是否成功。
同时还需要对分离得到的样品进行进一步分析，例如质谱分析、蛋白质鉴定等。
总之，凝胶层析是一种常用的分离技术，需要严格控制实验条件和选择合适的凝胶材料。
只有在合理操作的基础上，才能获得准确可靠的实验结果。
凝胶过滤层析技术原理讲解
凝胶过滤层析技术原理讲解凝胶层析的原理基于分子在固定凝胶柱上通过孔隙的能力。
凝胶是由交联的聚合物构成的，形成了许多孔隙，这些孔隙的大小和分子的大小具有相关性。
分子大小较大的物质将难以进入凝胶孔隙内，流速比较快，从而在柱体积内快速通过，出现在柱体积较大的位置；而分子大小较小的物质则能够进入凝胶孔隙内，流速比较慢，从而在柱体积内停留更长时间，出现在柱体积较小的位置。
凝胶层析的柱层结构是由一段硬基质构成，上面带有孔隙性的功能性聚合物层。
功能性聚合物的孔隙大小可以根据需要而定，常见的为分子质量在1000道尔顿到几十万道尔顿之间的分离。
当样品在凝胶柱上通过时，较小的分子能进入到凝胶层的孔隙内，流速较慢，溶液逐渐扩散。
而较大的分子无法进入到孔隙内，流速较快。
因此，凝胶层明显的区分了分子的大小。
在凝胶柱中选择的凝胶颗粒可以根据目标物质的分子量范围和理化性质进行选择。
通常使用的材料包括葡聚糖、琼脂糖、琼脂糖琼脂、琼脂糖琼脂纤维素、聚丙烯酰胺凝胶等。
这些凝胶材料的孔隙大小和梯度能根据需要进行调整，以实现对样品分子的精确分离。
在进行凝胶层析的过程中，凝胶柱首先需要经过预处理，以去除杂质和活性剂。
样品可以直接在预处理后的缓冲液中加载到凝胶柱上，并在适当的流速下通过。
样品分子会在凝胶柱中发生分配，分子量较大的物质会穿过凝胶颗粒的外层，较小的分子则进入凝胶颗粒孔隙内。
这样，在整个流程中分子会逐渐分离并收集在柱底。
1.相对于其他层析技术，凝胶层析是一种非毒性和温和的技术，对生物大分子的分离影响较小。
2.凝胶层析具有良好的分辨率和高效率，可以实现对不同分子大小物质的分离。
3.凝胶层析可以在无需进行特殊环境条件下进行，如室温和常压。
4.凝胶层析可与其他分离技术如亲和层析、离子交换层析等相结合，实现更精确的纯化和分离过程。
总结起来，凝胶层析是一种基于分子大小的层析技术，通过凝胶柱的孔隙大小来实现分离物质的纯化。
它是一种相对简单且温和的分离方法，适用于大多数生物分子的分离和纯化。
凝胶层析法专题培训
4．聚丙烯酰胺凝胶
聚丙烯酰胺凝胶也是一种人工合成凝胶，其 商品名为生物凝胶P（Bio-gel-P），和交联 葡聚糖一样，为颗粒状干粉，在溶剂中能自 动吸水溶胀成凝胶。其由单体丙烯酰胺
和交联剂甲叉双丙烯酰胺
经过自由基引起聚会形 成聚丙烯酰胺凝胶。
（见下图）。只要控制单体用量和交联剂 旳百分比，就能得到不同型号旳凝胶。
3．葡聚糖凝胶离子互换剂
在G类凝胶上引入某些酸性或碱性基团后， 则制得多种葡聚糖凝胶离子互换剂 。
如引入磺乙基（SE-Sephadex）、羧甲基 （CM-Sephadex）及二乙胺基乙基（DEAESephadex A）等。葡聚糖凝胶离子互换剂具有 离子互换和分子筛双重作用。其构造多孔、疏 松、非特异性吸附极少，层析时流速易控制， 尤其合用于蛋白质、酶、激素、多核苷酸等旳 分离纯化，以及生化制剂旳除热原。
像Sephadex一样，商品聚丙烯酰胺为颗粒 状旳干粉，它有十分明显形成块状并粘附在一 起旳倾向，在溶剂中能自动溶胀成胶。
根据聚丙烯酰胺凝胶旳溶胀性质和分离范 围旳不同，可提成10种类型。多种类型均以英 文字母P和阿拉伯数字表达，从Bio-Gel P-2至 Bio-Ge1 P-300。P背面旳阿拉伯数字乘以1000 即相当于排阻程度（按球蛋白或肽计算）。目 前，美国Bio-Rad Laboratories生产并出售多 种规格旳Bio-Gel P。
式中Ve为脱体积，它涉 Kd为每个溶质分子在流动相和固定相之间旳 一种特定旳分配系数，它只与被分离物质分 子大小和凝胶颗粒内孔隙大小分布有关。Kd 可经过试验由Ve、Vo和Vi求得。
Ve＝Vo＋Kd.Vi
可改写为：
（Ve-Vo） Kd=－－－－
一凝胶颗粒，如此不断地进入与逸出，使 流量增长，移动速率慢而最终流出层析柱。 而中档大小旳分子，它们也能在凝胶颗粒 内外分布，部分进入颗粒，从而在大分子 物质与小分子物质之间被洗脱。这么，经 过层析柱，使混合物中旳各物质按其分子 大小不同而被分离。
第五章 凝胶过滤层析
第五章 凝胶过滤层析 第二节 原 理
三、凝胶过滤的有关理论问题 ㈠ 凝胶介质的多孔结构和凝胶柱的体积参数 凝胶过滤介质是由多聚物交联形成的具有三维网状结构的 颗粒。 凝胶柱的体积参数包括： 总柱床体积（total volume, Vt），是凝胶经溶胀、装柱、 沉降，体积稳定后所占据层析柱内的总体积； 外水体积（outer volume, V0），是柱中凝胶颗粒间隙的液 相体积的总和； 内水体积（inner volume, Vi），是存在于溶胀后的凝胶颗 粒网孔中的液相体积的总和； 凝胶体积（gel volume, Vg），又称支持物基质体积 （matrix volume of the support, Vs）或干胶体积，是凝胶 颗粒固相所占据的体积，
第五章 凝胶过滤层析 第三节 凝胶过滤介质
一、凝胶过滤介质的基本结构 凝胶介质的基本结构都是具有多孔网状结构的水不溶性多 聚物。 理想的凝胶过滤介质必须符合以下条件： （1）有较强的机械稳定性，能满足层析过程所需流速， 在其标称的操作压力范围内不发生体积变化； （2）高化学稳定性，凝胶颗粒对分离过程中常用的试剂 和样品都保持惰性，在很宽的pH范围内保持稳定，耐去 污剂、有机溶剂，耐高温，从而方便清洗和消毒灭菌； （3）球形，颗粒直径均匀，呈现亲水性； （4）不带电荷，不对样品产生吸附作用。
第五章 凝胶过滤层析 第一节 概 述
凝胶过滤具有的优势 : （1）凝胶介质不带电荷，具有良好的稳定性，分离条件温 和，回收率高，重现性好； （2）通常情况下，溶液中存在各种离子、小分子、去污剂、 表面活性剂、蛋白变性剂等不会对分离产生影响，层析还能 在不同pH、温度下进行； （3）应用范围广，能分离的物质相对分子质量的覆盖面 宽，从几百到数百万，因此既适用于分子量较低的寡糖、寡 肽、聚核苷酸等生物小分子的分离，也适用于蛋白质、多糖、 核酸等大分子物质的纯化； （4）设备相对简单、易于操作、分离周期短、连续分离时 层析介质不需再生即可反复使用。
凝胶过滤层析如何操作？
凝胶过滤层析如何操作？凝胶过滤层析操作 1.凝胶的预处理交联葡聚糖凝胶的市售商品多为干燥颗粒，使用前必须充分溶胀。
方法是将欲使用的干凝胶缓慢地倾倒入5,10倍的去离子水中，参照相关资料中凝胶溶胀所需时间，进行充分浸泡，然后用倾倒法除去表面悬浮的小颗粒，并减压抽气排除凝胶悬液中的气泡，准备装柱。
在许多情况下，也可采用加热煮沸方法进行凝胶溶胀，此法不仅能加快溶胀速率，而且能除去凝胶中污染的细菌，同时排除气泡。
表凝胶型号和层析柱大小与规格及凝胶用量层析柱规格凝胶的规格和用量(g)直径(cm) 高(cm) 容量 (ml) G25 G50 G100 G200 0.9 15 9.5 2.5 1 0.6 0.3 0.9 30 19 5 2 1.2 0.60.9 60 38 10 4 2.5 1.21.6 20 40 10 42.5 1.21.6 40 80 20 8 5.02.41.6 70 140 35 14 9.0 4.4 1.6 100 200 50 20 12.5 6 2.6 40 210 50 20 12 72.6 70 370 90 35 20 122.6 2.6 100 60 530 1 000 130 250 50 110 30 70 17 352.装柱层析柱的选择一般根据分离样品的种类和样品的数量而定。
纯化蛋白质时，柱床体积应为样品体积的25,100倍。
去除盐及游离荧光素约为样品体积的4,10倍。
柱太短，影响分离效果。
柱长一些，分离效果好，但柱太长，则延长分离时间，样品也稀释过度。
层析柱的内径也要选择适当。
内径过细，会发生“器壁效应”，即靠近管壁的流速要大于中心的流速影响分离效果。
所以层析柱的内径和高度应有一定的比例。
对于除盐来说应为1:5,1:25;对于纯化蛋白质来说应为1:20,1:100。
凝胶柱的装填方法和要求，基本上与离子交换柱的制备相同。
一根理想的凝胶柱要求柱中的填料(凝胶)密度均匀一致，没有空隙和气泡。
第五章+凝胶过滤
分类
葡聚糖凝胶（Sephadex） 天然琼脂糖（Sepharose、Bio-gel A） 交联琼脂糖（Sepharose CL-） 聚丙烯酰胺凝胶（Bio-gel） 交联葡聚糖 双丙烯酰胺共聚凝胶（Sephacry1） 交联葡聚糖与葡聚糖共价结合的凝胶（Superdex
）
各 种 凝 胶 层 析 的 基 质
链将发生少许水解作用；在0.2mol/L NaOH 溶 液中（室温下）处理100小时，对其低流速和 多孔性没有明显影响； c. 清洁剂（如SDS）、6mol/L盐酸胍和8 mol/L 尿素溶液可作洗脱剂，高温（120℃）消毒（ pH= 7时）处理后，层析性质没明显变化。
Sephacryl 能用于分离蛋白质、核酸、多糖和 蛋白聚糖（Proteoglycans）。也可用于大的 病毒颗粒（直径 >300-400 nm）的分离。层 析时，用细颗粒凝胶分辨率高。
粗颗粒凝胶流速快，宜用小直径的层析柱，如操 作得当，可得到较满意的结果。
2．凝胶用量的计算
根据层析柱的体积和干凝胶的膨胀度，可计算 出所需干凝胶的用量：
干凝胶用量（g）=∏r2 h / 膨胀度（床体积/克干 胶）
用此法计算出的干凝胶用量还需增加 10%-20％ ，因为凝胶在处理过程中会有一部分损失。
不同类型凝胶的筛孔的大小不同
凝胶过滤基本原理
相对分子质量较大的物质由于直径大于凝胶网 孔被完全排阻在孔外，只能在凝胶颗粒外的空 间向下流动，因此流程较短，移动速度快，所 以首先流出。
相对分子质量较小的物质由于直径小于凝胶网 孔，可完全渗透进入凝胶颗粒的网孔，在向下 移动过程中，因此流程较长，移动速率慢，所 以最后流出。
不同型号的葡聚糖凝胶的交联度不同，膨胀 度、吸水量、筛孔的大小和分组范围有明显 的差异。
第七章 凝胶层析
一、凝胶的选择和处理 二、凝胶层析柱的设计和制备 三、凝胶层析操作 四、主要参数测算 五、凝胶层析的扩展
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一、凝胶的选择和处理
（一）凝胶的选择 (1).将分子量极为悬殊的两类物质分开，如蛋
白质与盐类，称作类分离。
(2).将分子量相差不大的大分子物质加以分离， 如分离血清球蛋白与白蛋白，这叫做分级分 离。
避免硼酸缓冲液
（二）架桥琼脂糖凝胶（Sepharose CL）
架桥琼脂糖凝胶为琼脂 线性分子经1，3-二溴丙 醇交联的凝胶。
它的凝胶孔径均匀，机 械强度明显加大。
对热和化学物质的稳定 性 大 大 增 加 , 在 pH3~14
范围内稳定。
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（三）超胶（Utro-gel ACA）
所谓超胶是琼脂糖与聚丙烯酰胺的混合凝胶。 商品名称后面的编号为两位数，各表示混合胶中聚
例如Sephadex G-50的排阻极限为30,000，它表示分 子量大于30,000的分子都将直接从凝胶颗粒之外被洗 脱出来。
4. 分级分离范围
分级分离范围表示一种凝胶适用的分离范围，对于分 子量在这个范围内的分子，用这种凝胶可以得到较好 的线性分离。
例如Sephadex G-75对球形蛋白的分级分离范围为 3,000－70,000，它表示分子量在这个范围内的球形 蛋白可以通过Sephadex G-75得到较好的分离。
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一、葡聚糖凝胶 (Sephadex)
1.结构
商品名为Sephadex G类 . 交联葡聚糖的基本骨架是葡
聚糖。 再经3-氯-1，2-环氧丙烷为
交联剂，形成三维网状结构 的高分子化合物。 其交联度是通过交联剂的加 量及反应条件来控制的。
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2 规格型号：
凝胶过滤、离子交换层析、亲和层析、疏水层析的洗脱条件
凝胶过滤、离子交换层析、亲和层析、疏水层析的洗脱条件下载温馨提示：该文档是我店铺精心编制而成，希望大家下载以后，能够帮助大家解决实际的问题。
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凝胶过滤层析讲解
四、加样 加样体积越小，分辨率越高。 两种蛋白洗脱体积为VeA、VeB，两种蛋白分离体 积Vs（洗脱体积之差），Vs＝VeA-VeB,
理论上，Vp(加入样品体积）＝Vs时就能分离两种
蛋白质
Vp<Vs时效果好。
样品粘度的影响
五、 洗脱 洗脱液：能溶解被洗脱物质、不使其变性或 失活为原则。 一般都以单一缓冲液(如磷酸缓冲液、TrisHCl缓冲液等)或者盐溶液作为洗脱液。
3)中等大小的分子，在凝胶颗粒内外均有分布，部分进 入颗粒，从而在大分子物质与小分子物质之间被洗脱。
凝胶过滤原理示意图
凝胶层析的几个概念
外水体积（Vo）：是指凝胶柱中凝胶颗粒周围空间的体积，也就是凝胶颗粒间液体流 动相的体积。 内水体积（Vi）：是指凝胶颗粒中孔穴的体积，凝胶层析中固定相体积就是指内水体 积。 基质体积（Vg）：是指凝胶颗粒实际骨架体积。
分级分离一般选用排阻极限略大于样品中最高分子 量物质的凝胶。
2）粒度的选择
目数（反映凝胶颗粒直径的大小）。目数越 大，直径越小。 每种型号凝胶都有有粗粒和细粒之分。 细粒均一性好，分离效果好，但是流速慢， 适合小型实验。层析柱选用大直径的； 粗粒的优势是流速快，适合样品量大的实验， 选用小直径的柱子提高分辨率。
（2） 琼脂糖凝胶
凝胶过滤层析技术原理讲解
凝胶过滤层析技术原理讲解凝胶过滤层析技术（GFC，Gel filtration chromatography）是一种基于分子大小差异的分离技术。
该技术通过在一个多孔凝胶柱中进行分离，使分子根据其大小在凝胶柱中的迁移速率不同而得到分离。
本文将详细讲解凝胶过滤层析技术的原理。
凝胶过滤层析技术的原理基于分子在多孔凝胶柱中迁移的速率与其体积大小成反比的规律。
凝胶柱中的多孔凝胶由多聚物（如聚丙烯酰胺、海藻酸钠等）构成，呈现出一定的孔径分布。
分子小于凝胶孔径的分子可以进入孔道中，而大于凝胶孔径的分子则无法进入孔道，只能沿凝胶颗粒表面通过。
因此，相对较大的分子在凝胶柱中的迁移速率更快，相对较小的分子则迁移速率较慢。
具体而言，凝胶过滤层析技术分为两个主要步骤：样品加载和洗脱。
1.样品加载：首先将待分离的样品溶液加入到凝胶柱中，样品中的各种分子根据其体积大小进入到凝胶孔道或沿凝胶颗粒表面通过。
体积较大的分子无法进入孔道，因此会快速通过凝胶柱，迁移速率较快。
体积较小的分子则能够进入孔道，受到凝胶孔道的阻碍，迁移速率较慢。
这样，样品中的不同分子就会在凝胶柱中根据其体积大小而分离。
2.洗脱：在样品加载后，需要通过洗脱来收集分离的目标分子。
洗脱过程中使用一种洗脱缓冲液，缓冲液的成分和pH值可以调整以满足对目标分子的选择性洗脱。
这样，在洗脱过程中，不同体积大小的分子将以不同的速率从凝胶柱中洗出，实现对目标分子的分离纯化。
需要注意的是，凝胶过滤层析技术不仅仅能够根据分子的大小分离，还可以用于蛋白质的分离，通过调整凝胶柱中的凝胶孔径和选择合适的缓冲液来实现蛋白质的选择性分离。
总结而言，凝胶过滤层析技术通过利用多孔凝胶柱的孔径分布特性，实现对分子根据其体积大小的分离。
通过加载样品并使用合适的洗脱缓冲液，不同体积大小的分子可以在凝胶柱中分离纯化。
这种技术简单易行，广泛应用于分子生物学、生物医学等领域的分离纯化研究中。
凝胶过滤层析技术原理讲解
凝胶过滤层析技术原理讲解凝胶过滤层析技术原理讲解(附动画)原创作者;gfzhang凝胶过滤层析(Gel Filtration Chromatography，GFC)又称尺寸排阻层析(Size Exclusion Chromatography，SEC)凝胶渗透层析(Gel Permeation Chromatography，GPC)分子筛层析(Molecular Sieve Chromatography，MSC)注:在高效液相色谱分析中，用GFC或SEC表示凝胶过滤色谱或尺寸排阻色谱，流动相通常是水溶液;在有机高分子分析中，常用GPC表示凝胶渗透色谱，流动相通常是有机溶剂;在蛋白质分离纯化中用GFC或SEC表示凝胶过滤层析或尺寸排阻层析;本文以下内容均针对蛋白质分离，因此均以凝胶过滤层析(GFC)表示。
(1)分离机理GFC填料是由高分子交联而成、内部具有网状筛孔的固体颗粒，利用球状凝胶内的筛孔的大小，不同水力学半径的分子在通过填料时运行路径存在差异，利用该差异将不同大小的蛋白质进行分离。
蛋白质分子流过填充凝胶的管柱时，大分子无法进入凝胶筛孔，而只流经凝胶及管柱间的孔隙，因此总体运行路径较短，从层析柱入口到出口所需时间较短;较小的分子因为进入凝胶内的筛孔，总体运行路径较长，故在管柱内的停留时间较长;基于此原理可以区分大小不同的分子，亦可与已知大小的分子作比较而确定未知样品的分子量。
注1:球形蛋白与线性分子在凝胶过滤层析中的保留行为存在差异，因此使用球形蛋白制作的分子量标准曲线不能用于明胶多肽、淀粉或其它聚合物。
(2)应用范围A蛋白质分离，基于混合中不同蛋白质分子尺寸大小进行分离;B分子量测定，蛋白质分子量(球形)的对数与其在凝胶过滤层析时的保留时间呈线性关系; C样品脱盐或溶剂置换。
(3)填料要求一般状况下，用于制备凝胶过滤层析的填料应不吸附目标成份，所有欲分离物质均被洗脱出，这是凝胶层析法与其它层析法不同的地方。
凝胶过滤法原理
凝胶过滤法原理凝胶过滤法是一种常用的分子分离方法，主要用于分离和分析生物大分子，如蛋白质、核酸和多肽等。
凝胶过滤法是一种基于分子大小的分离方法，利用分子在凝胶中的深度穿透程度来分离分子大小不同的物质。
本文将详细介绍凝胶过滤法的原理、操作步骤、优缺点以及应用领域。
一、凝胶过滤法原理凝胶过滤法是一种分子尺寸分离的方法，属于分子筛分离方法。
其原理是通过凝胶微球的孔径大小来实现对分子进行分离。
凝胶微球的孔径大小与其交联程度及交联剂浓度有关，一般来说，交联程度越高，孔径越小，分子的分离效果就越好。
凝胶过滤法的操作步骤如下：1. 凝胶材料的制备：根据需要分离的分子大小选择合适的凝胶材料，如聚丙烯酰胺凝胶、琼脂糖凝胶等。
制备时需要根据实验要求控制凝胶的交联程度和孔径大小，并进行脱氧处理以去除残留的殉使剂。
2. 凝胶柱的制备：将制备好的凝胶注入柱体中，制备凝胶柱。
凝胶柱的长度和直径应根据实验需要进行选择。
凝胶柱的前端和后端各设置一个过滤器，以保持凝胶柱内部的凝胶均匀分布。
3. 样品的预处理：根据实验需要，对待分离样品进行预处理，如去除蛋白质中的盐、重组蛋白中的肽、除去核酸样品中的杂质等。
预处理的方法包括低速离心、热处理、加盐沉淀、酸性沉淀、甲醇沉淀等。
4. 样品的注入：将预处理好的样品注入凝胶柱中，根据实验需要调整注入速度和量，并在实验过程中保持凝胶柱内部湿润。
5. 柱洗脱液的选择：根据分离物的性质和实验要求选择合适的柱洗脱液，如生理盐水、磷酸盐缓冲液、硝酸盐缓冲液等，逐一加入凝胶柱中。
6. 分离物的收集：收集不同分子大小的分离物，根据需要进一步进行分析、纯化、测定样品的组成和浓度等。
凝胶过滤法有许多优势，如不需要高压，适用范围广，简单易操作，分离效果好，分离物得到的样品污染小等。
它也有一些缺点，如无法分离小分子物质，分子大小分离效果有限，凝胶材料存在的自由基和殉使剂会对样品产生影响等。
二、应用领域凝胶过滤法广泛应用于生命科学领域中各项研究中，如基因工程、蛋白质分离纯化、酶学研究、药物筛选等。
实验六凝胶过滤层析
一 实验原理
凝胶层析是将样品混合物通过一定孔径的凝胶固定相， 由于在层析过程中样品不同的蛋白质具有不同的洗脱， 使不同的分子量的组分得以别离的层析方法。凝胶层 析的别离过程是在装有多孔物质如交联聚苯乙烯、多 孔玻璃、多孔硅胶、交联葡聚糖等填料的柱中进展的。
填料颗粒含有许多不同大小的孔隙。这些孔隙对于溶 剂分子而言是很大的，他们可以自由扩散出入。对于 溶质分子而言，如果分子大小适宜时，那么可以不同 程度地往孔隙中扩散，大分子量的溶质分子只能占有 较小的孔隙，而小分子量的溶质分子除能占住大孔隙 外，还可以占有另外一些起更小的孔隙。
其定量关系符合以下公式：
Ve=Vo+KV1 Ve：某一溶质的洗脱体积 Vo：层析柱的外水体积 Vi：层析柱的内水体积 K：某一溶质的分配系数
二试剂和器材
1．试剂
Sephadex G-75 0.005M PBS 兰色葡聚糖 样品溶液
二试剂和器材
2．器材 〔1〕带夹套层析柱：φ：h=1:24 〔2〕加样器 〔3〕分部收集器 〔4〕核酸蛋白检测仪 〔5〕小玻棒
三 操作步骤
2 层析柱的选择 对于大分子量化合物的分级别离，要求
柱床体积大于样品体积25倍以上，最高 可达100倍，层析柱的径高比也在25100之间。为了减少温度对别离蛋白质 活性的影响，层析柱外加夹套，通入低 温循环水，以保持低温。
三 操作步骤
3 凝胶柱的装填和凝胶床的检查 将层析柱垂直固定，层析柱预装1/5的平衡溶液，再将适当浓度
三 操作步骤
5 洗脱与收集 为了防止柱床体ห้องสมุดไป่ตู้的变化，造成流速降低及重复
性下降，整个洗脱过程应始终保持一定的操作压。 流速不能过快且要稳定。洗脱液的成分不应改变。 洗脱液采用分部收集器收集，以核酸蛋白检测器 检测洗脱峰。
凝胶过滤层析实验
凝胶过滤层析实验凝胶过滤作为实验室最常用的层析方法之一，无疑是众多层析方法中最娇贵的存在。
原理凝胶过滤层析是根据蛋白质分子大小不同而达到分离效果的，凝胶过滤填料中含有大量微孔，只允许缓冲液及小分子量蛋白质通过，而大分子蛋白质及一些蛋白复合物则被阻挡在外。
因此，高分子量的蛋白质在填料颗粒间隙中流动，比低分于量蛋白更早地被洗脱下来。
最大的蛋白质分子最早流出柱子，因为它们在到达柱底前经过的体积最小。
中等大小的蛋白质可以进入填料分子中较大的孔内，因此它们晚一些到达柱底，而小蛋白质可以逬入所有填料的孔内，有最大的通过体积，故最后到达柱底。
材料与仪器蛋白质溶液缓冲液、蓝色葡聚糖溶液、乙醇、乙腈、乙酸、胃蛋白酶低压层析系统操作步骤1.凝胶的填装1.1凝胶的溶胀如果凝胶是脱水的干粉（例如Sephadex）在使用前需要溶胀。
1.1.1一份凝胶加10份的缓冲液，原则上应将凝胶颗粒放入洗脱缓冲液中。
1.1.2在摇床上或手动搅拌混合，避免使用电力搅拌器。
因为机械搅拌力会导致凝胶颗粒破裂成碎片，这些细小的碎片将干扰层析。
如果出现细小的凝胶碎片可将凝胶浆悬浮，待凝胶颗粒沉降后，去除上清，重复几次，直到液相不再混浊为止。
1.1.3自然溶胀需要24 h至数天，为了加速溶胀，可用热法溶胀。
即在沸水浴中将凝胶浆逐渐升温至近沸，这样可加速溶胀平衡，通常1～2 h即可完成。
这种方法不但省时，还可以排除气泡和消毒。
1.1.4无论凝胶是否需要溶胀，为了防止气泡影响层析，需用水泵或真空泵对凝胶浆抽气1 h。
1.2装柱1.2.1将层析柱垂直安装在无直接光照、无空气对流处，以防止由于温度变化使层析柱内产生气泡。
通常放在专用的层析冷柜中；1.2.2装柱前取3/4体积的凝胶和1/4体积的缓冲液制成凝胶浆；1.2.3对于经常使用的层析柱，建议使用一个商品化的流动相接头（flow adaptors）。
它对柱床表面有保护作用，还可以避免样品中的大颗粒混入凝胶中，从而延长层析柱的寿命；1.2.4将缓冲液加入层析柱，当有缓冲液流出时关闭柱的出口。
蛋白质纯化常见问题及解决方案
蛋白质纯化常见问题及解决方案蛋白质纯化是生物化学研究中非常重要且常见的实验技术。
纯化蛋白质可以帮助科学家深入理解蛋白质的结构和功能，从而推动相关领域的研究进展。
然而，在进行蛋白质纯化的过程中，科学家们常常会遇到各种问题。
本文将介绍一些常见的问题，并提供解决方案，以帮助研究人员顺利进行蛋白质纯化实验。
常见问题一：蛋白质表达量太低在蛋白质纯化中，蛋白质的表达量是一个非常关键的因素。
然而，有时候我们会发现蛋白质的表达量过低，难以获得足够纯度的样品。
这可能有以下几个原因：1. 载体选择不当：选择适合的表达载体对蛋白质表达量有很大影响。
可以尝试使用高效表达载体，如pET系列载体，来提高蛋白质的表达量。
2. 菌株选择不当：不同菌株对蛋白质表达量有差异。
常用的菌株包括大肠杆菌（E.coli）和酵母菌等。
可以尝试不同菌株进行表达，找到最适合的菌株。
3. 条件优化不足：包括温度、培养基和诱导条件等。
合理优化这些条件有助于提高蛋白质的表达量。
解决方案：针对上述问题，可以尝试优化表达载体、菌株和条件，并进行系统的优化实验。
此外，还可以尝试使用其他表达系统，如哺乳动物细胞和昆虫细胞等。
常见问题二：蛋白质不稳定或易聚集蛋白质在纯化过程中可能会失去稳定性，因而导致降解、聚集或失活。
这种情况可能是由于多种因素造成的，例如温度、pH值、盐浓度和氧气等。
解决方案：对于易聚集和不稳定的蛋白质，可以采取以下一些措施：1. 降低温度：将温度降低到4℃以下，可以减缓蛋白质的降解和聚集速度。
2. 优化缓冲液：选择合适的缓冲液，并进行pH和离子强度的优化。
有时候添加一些辅助物质，如甘油、蔗糖或胰蛋白酶抑制剂，可以提高蛋白质的稳定性。
3. 使用小分子化合物：有时候可以加入一些小分子化合物，如L-辅酶A和聚氧乙烯醇等，来增强蛋白质的稳定性。
常见问题三：蛋白质纯化的污染蛋白质纯化过程中常常会伴随着各种污染物的存在，如其他蛋白质、核酸、有机化合物和盐等。
通过实验让学生理解影响凝胶过滤层析的因素
通过实验让学⽣理解影响凝胶过滤层析的因素通过实验让学⽣理解影响凝胶过滤层析的因素在⽣物化学实验中,凝胶过滤层析,也称分⼦筛层析、排阻层析,是以被分离物质的分⼦量差异为基础的⼀种层析分离技术。
笔者现将凝胶层析的⽤途及通过实验让学⽣理解掌握影响凝胶过滤层析的两种因素阐述如下。
⼀、凝胶层析的应⽤⼴泛凝胶层析的应⽤⾮常⼴泛,最主要的应⽤有以下四种。
1.脱盐⾼分⼦(如蛋⽩质、核酸、多糖等)溶液中的低分⼦量杂质,可以⽤凝胶层析除去,这⼀操作称之为脱盐。
2.⽤于分离提纯凝胶层析已⼴泛⽤于酶、蛋⽩质、氨基酸、多糖、激素、⽣物碱等物质的分离提纯。
凝胶对热原有较强吸附⼒,可⽤于除去⽆离⼦⽔中的致热原制备注射⽤⽔。
3.测定⾼分物质的分⼦量⽤⼀系列已知分⼦量的标准品放⼊同⼀凝胶柱内,在同⼀条件下层析、记录每⼀分钟成分的洗胶体积;根据物质的洗胶体积,在标准曲线上查出其分⼦量。
4.⾼分⼦溶液的浓缩⼆、通过葡聚糖凝胶柱层析实验,让学⽣理解影响凝胶过滤层析的两种因素学⽣通过实验,掌握葡聚糖凝胶的特性及凝胶层析的原理。
对于凝胶过滤层析的理论学习,学⽣普遍感到抽象、难理解。
通过实验,可以让学⽣在实验的过程中,变抽象为直观,变难懂为易懂。
在实验开展的进程中,学⽣可以亲眼观察到凝胶的选择和层柱⼤⼩、长短的不同均会对实验结果产⽣影响。
1.凝胶的选择,根据实验⽬的不同,选择不同型号的凝胶⽬前,市售凝胶主要包括:价格便宜的凝胶葡聚糖G-10,分离范围<700;价位适中的凝胶葡聚糖G-35,分离范围是<5000;价格偏贵、胶位度较⼤的为凝胶葡聚糖G-35、G50,分离范围分别为1000-17000及1000-30000。
在该实验中,样品蓝⾊葡聚糖2000分⼦量的约为2×105,⽽溴酚蓝分⼦量约为670,两者分⼦量相差较⼤,可选择颗粒较⼤⽽胶联度较⼩的、价格相对适中的凝胶葡聚糖G25。
由于蓝⾊葡聚糖分⼦量过⼤,不能从凝胶分⼦中通过,所以蓝⾊葡聚糖2000克于溴酚蓝出柱,。
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凝胶过滤层析常见问题解析
1. 色谱峰对称性差
出峰上升时，上升缓慢是填料装填过紧，而拖尾是因为装填的太松，此时对称因子及
柱效都很差，出现这种情况就要重现装柱。
装柱前要了解填料的压缩系数（压缩因子）如Focurose FF系列的填料的压缩系数是1.15，且装完后要测柱效。
2. 柱床有裂缝或干涸等塌柱现象
检测管路及柱床体系是否有泄露或气泡，必要时重现装柱。
3. 分离度差
(1) 样品和选择的填料不匹配
待分离的样品中目标物质和其它杂质的分子量小于2倍且都在选择的填料的排阻极限
之外或者之内。
若样品中目标物质的分子量和其它杂质的分子量小于2倍时，建议尝
试其它方法分离，反之选择凝胶过滤层析时，填料的选择应根据样品中目标分子的大
小选择最接近（大或小都可以）目标分子排阻极限的填料进行分离。
(2) 柱床装填的效果差
通过测柱效等方式确保柱床装填的满足凝胶过滤层析的过程。
(3) 上样量过大
根据样品中目标物质和杂质的分子差异优化上样量，如脱盐等样品中目标分子和杂质
的分子量大于50倍时，上样量可以达到柱床体积的25%，最高不超过30%，若样品
中目标分子和杂质的分子量差异在2-5倍时，通常上样量控制在柱床体积的5%以内。
(4) 流速过快
凝胶过滤的过程流速不宜过快，降低流速在一定程度上可以提高分离度。
(5) 层析填料被污染或老化
随着填料的使用，一些杂质的积累会使层析填料的孔径发生变化（如堵塞，非特异性
吸附积累，微生物污染，破碎等），导致其排阻能力发生偏差而影响分离度。
此时可
对填料进行CIP清洗，若清洗后还不能达到分离要求，就要更换新的填料。
(6) 样品自身的问题
样品粘度过大也会导致分离度下降，粘度大的样品在凝胶过滤时要对其进行稀释处理在凝胶过滤；
样品中目标物质和其它杂质的非特异性结合或者作用力，此时就要尝试添加一些添加剂（如2%的Triton x-100,150mM NaCl等），减少样品中各组份之间的作用力；
样品的pH，离子强度对某些填料的柱床体积会产生一些影响，也会影响分离度，必要时可以优化样品的缓冲液。
4. 反压大，液流慢
凝胶过滤层析柱的装填应控制在60-100cm，太低影响分离度，太高反压增大。
另外填料的清洁程度及样品的粘度，pH，离子强度也会影响液流速度。