凯氏定氮法
凯氏定氮法
1、消化取两个凯氏烧瓶标号，一只加1.0ml蒸馏水作为空白对照，另一只加1.0ml样液。
各加硫酸钾和硫酸铜混合物约20mg、浓硫酸2ml。
烧瓶口插一漏斗（冷凝用），烧瓶置于电炉上加热。
开始时应注意火力，以免使瓶内液体冲至瓶颈。
待瓶内水气蒸完，硫酸开始分解生成SO2白烟时，适当加强火力，直至消化液透明并呈但旅色为止（约2~3h），用木夹取出，冷却，准备蒸馏。
2、蒸馏取50~100ml锥形瓶3只，先按一般方法洗净，再用蒸汽洗涤数分钟，冷却。
用移液管各加入2%硼酸溶液5.0ml和指示剂4滴。
如瓶内液体呈葡萄紫色，可再加硼酸液5ml，盖好备用。
如锥形瓶内液体呈绿色，需用蒸汽重新洗涤。
1.安全管2.导管3.汽水分离管4.样品入口5.塞子6.冷凝管7.吸收瓶8.隔热液套9.反应管10.蒸汽发生瓶微量凯氏蒸Array馏装置如图所示，蒸汽发生器内盛放有滴加数滴H2SO4的蒸馏水和数粒沸石。
加热后，产生的蒸汽经储液管、反应室至冷凝管，冷凝后的液体流入接受瓶。
每次使用前，需用蒸汽洗涤10min左右（此时可用一小烧杯盛接冷凝的水）。
然后将一只盛有硼酸液和指示剂的锥形瓶放置在冷凝管的下端，并使冷凝管之管口插入酸液面下，继续蒸馏1~2min，如硼酸液颜色不变，表明仪器已洗净，否则需再洗。
移去酸液，蒸馏1min，用水冲洗冷凝管口吸去反应室残夜。
将消化好的消化液，由小漏斗加入反应室，用蒸馏水洗涤凯氏烧瓶2次（每次约2ml），洗涤液均经小漏斗加入反应室，再在冷凝管下置一盛有硼酸液和指示剂的锥形瓶，并使冷凝管口插入酸液面下0.5cm处（10mL酸液置于50~100mL锥形瓶内，液体深度不大，可将锥形瓶斜放。
冷凝管口必须插在液面下，但也不宜太深，这样，万一发生倒吸现象时，硼酸液也不致被吸入反应室内）。
用小量筒取10~15mL30%的NaOH溶液，倒入小漏斗，放松弹簧夹，让NaOH溶液缓缓流入反应室，当小漏斗内剩下少量NaOH溶液时，夹紧夹子，再加入约3mL蒸馏水于小漏斗内，同样缓慢放入反应室，并留少量水在漏斗内做水封，即可蒸馏。
总结凯氏定氮法
注意事项： 在蛋白质测定过程中应注意与采用氨试剂的检测项目 时间错开，确保环境空气中无氨气的存在，否则将影响蛋白质的测定 结果，使最终结果偏高。 三、结果计算：
X4（干基）= (V1 - V0)×0.014×C×6.25 W（1-水分%）×0.1 ×100……… (4)
式中： X4 W V1 V0 C 0.014 6.25 试样的干基蛋白质含量， （%） ； 试样质量， （g） ； 滴定样品所消耗盐标准溶液体积， （mL） ； 滴定空白所消耗盐酸标准溶液体积， （mL） ； 盐酸标准溶液的浓度， （mol/L） ； 1mL1mol/L 盐酸溶液相当于氮的质量， （g） ； 氮换算为蛋白质的系数。
c·2%的硼酸溶液：2g 硼酸加蒸馏水定容至 100mL； d·浓硫酸： e· 复合催化剂： 硫酸钾或硫酸钠 97g 和无水硫酸铜 3g 的混合物； f·混合指示液：0.1%的甲基红乙醇溶液 20mL 与 0.2%溴甲酚绿 乙醇溶液 30mL 混合摇匀。 二、 分析步骤 a·消化：称取混匀的样品 3g（精确至 0.001g） ，放入干燥的凯 氏烧瓶中（避免样品粘在瓶颈内壁上） ，加入混合催化剂 10g，硫酸 25mL，轻轻摇动烧瓶，使样品完全湿润。然后将烧瓶以 45 角斜放在 支架上，用电炉缓慢加热，当瓶内泡沫消失后强热至沸。待瓶壁不附 有炭化物时，且瓶内液体为澄清浅绿色后，继续加热 30min 使其完全 分解（以上操作应在通风橱内进行） 。 b·蒸馏：将消化好并冷却至室温的样品溶液全部转移到 100mL 容量瓶中， 用蒸馏水定容到刻度摇匀。 向 100mL 接受瓶中加入 20mL2% 硼酸溶液和 2～3 滴混合指示液，将接收瓶置于冷凝管下口，使下口 浸入到硼酸接收液中。再吸取 10mL 定容后的样品液，沿小玻璃杯移 入反应室，并用少量的蒸馏水冲洗小玻璃杯，塞紧棒状杯塞。向小玻 璃杯中加入 20～30mL40%的氢氧化钠溶液（过量） ，慢慢提起棒状杯 塞，使氢氧化钠缓慢流入反应室（防止反应室气体从杯塞处外泄） ， 立即塞紧棒状杯塞，并在小玻璃杯中加入蒸馏水使之密封。通入蒸汽 5min，降低接收瓶位置使冷凝管末端离开液面后再继续蒸馏 1min， 用少量蒸馏水冲洗冷凝管末端，洗液并入接收瓶，取下接收瓶。 c·滴定：用 0.01mol/L 的盐酸或硫酸标准溶液滴定接收瓶瓶中 的液体，使之刚刚出现灰紫色即为终点，记录所消耗 0.01mol/L 的盐 酸或硫酸标准溶液的体积（mL） 。
凯氏定氮法
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凯氏定氮法
测定蛋白质含量的方法
常 用 的 四 种 古 老 经 典 方 法
凯氏定氮法
双缩脲法 Folin－酚试剂法 紫外吸收法
凯氏定氮法
• 凯氏定氮法可分为全量法、微量法及经改 进后的改良凯氏定氮法。
微量法：取消化液的10%加碱蒸馏 常量法：取消化液的全部加减蒸馏。
凯氏定氮法
消化
• 2NH2+H2SO4+2H＝(NH4)2SO4 • （其中CuSO4做催化剂） • (NH4)2SO4+2NaOH＝2NH3+2H2O+Na2SO4 • 2NH3+4H3BO3＝(NH4)2B4O7+5H2O • (NH4)2B4O7+H2SO4+5H2O＝(NH4)2SO4+4H3BO3 • (NH4)2B4O7+2HCl+5H2O＝2NH4Cl+4H3BO3
蒸馏
滴定
消化
蒸馏
滴定
计算：
粗蛋白质（%）= （V 滴定－V空白）×C盐酸×0.014×6.38×V总×100/m×V用
V 空白—空白试验耗用盐酸标准溶液体积，mL； V 滴定—样品耗用盐酸标准溶液体积，mL C 盐酸—盐酸标准溶液浓度，mol／L m—样品质量，g； V总—试样分解液总体积，mL； V用—用于反应的分解液体积，mL；
凯氏定氮法的原理和应用
凯氏定氮法的原理和应用1. 原理凯氏定氮法（Kjeldahl method）是一种常用的测定有机物和无机物中氮含量的方法。
它是由丹麦化学家Johan Kjeldahl在19世纪末发明的，被广泛应用于农业、环境科学、食品科学等领域。
该方法的原理是将样品中的有机氮化合物通过化学反应转化为无机氮的形式，然后用适当的碱溶液滴定测得，根据滴定所需的氢氧化钠溶液的体积来计算样品中氮的含量。
主要的反应过程如下： 1. 样品的消解：将样品与浓硫酸混合，并用加热使其反应，将有机氮化合物转化为氨的形式，生成硫酸铵和硫酸氢铵等化合物。
2.高温蒸煮：为了彻底转化所有有机氮化合物，通常需要将样品在高温下进行长时间的蒸煮。
3.酸碱中和滴定：将反应液冷却后，用稀硫酸或盐酸将其中的硫酸铵和硫酸氢铵转化为氨盐的形式。
然后，用氢氧化钠溶液进行滴定，将生成的氨中和，滴定至终点，终点可根据指示剂的改变来确定。
2. 应用凯氏定氮法广泛应用于以下领域：2.1 农业科学在农业科学中，凯氏定氮法常被用于测定土壤中的氮含量。
土壤中的氮是农作物生长所需的重要养分之一，准确测定土壤中的氮含量可以指导农民合理施肥和调节土壤养分，提高农作物产量和质量。
2.2 环境科学在环境科学研究中，凯氏定氮法可以用于测定水体、土壤和植物中的氮含量。
通过测定这些样品中的氮含量，可以评估水质、土壤质量和生态系统的健康状况，为环境保护和生态修复提供科学依据。
2.3 食品科学在食品科学领域，凯氏定氮法常用于测定食品中的蛋白质含量。
蛋白质是食品中重要的营养成分之一，准确测定食品中的蛋白质含量可以评估食品的营养价值和质量。
此外，凯氏定氮法还可以用于测定肥料中的氮含量、动物组织中的氮含量等。
3. 操作注意事项在使用凯氏定氮法时，需注意以下事项：•保持实验室的安全性，使用专门的消解设备，避免与强酸接触。
•样品的精确称量和溶解步骤十分重要，需要精确控制反应条件，以确保样品中的有机氮完全转化为氨。
凯氏定氮法
凯氏定氮法中文名称：凯氏定氮法英文名称：Kjeldahl determination定义：测定化合物或混合物中总氮量的一种方法。
即在有催化剂的条件下，用浓硫酸消化样品将有机氮都转变成无机铵盐，然后在碱性条件下将铵盐转化为氨，随水蒸气馏出并为过量的酸液吸收，再以标准碱滴定，就可计算出样品中的氮量。
由于蛋白质含氮量比较恒定，可由其氮量计算蛋白质含量，故此法是经典的蛋白质定量方法。
凯氏定氮法凯氏定氮法是测定化合物或混合物中总氮量的一种方法。
即在有催化剂的条件下，用浓硫酸消化样品将有机氮都转变成无机铵盐，然后在碱性条件下将铵盐转化为氨，随水蒸气馏出并为过量的酸液吸收，再以标准碱滴定，就可计算出样品中的氮量。
由于蛋白质含氮量比较恒定，可由其氮量计算蛋白质含量，故此法是经典的蛋白质定量方法。
原理蛋白质是含氮的有机化合物。
食品与硫酸和催化剂一同加热消化，使蛋白质分解，分解的氨与硫酸结合生成硫酸铵。
然后碱化蒸馏使氨游离，用硼酸吸收后再以硫酸或盐酸标准溶液滴定，根据酸的消耗量乘以换算系数，蛋白质含量。
含氮量*6.25=蛋白含量.有机物中的胺根在强热和CuSO4，浓H2SO4作用下，硝化生成（NH4）2SO4凯氏定氮法反应式为：2NH2+H2SO4+2H=(NH4)2SO4（其中CuSO4做催化剂）2.在凯氏定氮器中与碱作用，通过蒸馏释放出NH3，收集于H3BO3溶液中反应式为:(NH4)2SO4+2NaOH=2NH3+2H2O+Na2SO42NH3+4H3BO3=(NH4)2B4O7+5H2O3. 用已知浓度的H2SO4（或HCI）标准溶液滴定，根据HCI消耗的量计算出氮的含量，然后乘以相应的换算因子，既得蛋白质的含量反应式为：(NH4)2B4O7+H2SO4+5H2O=(NH4)2SO4+4H3BO3 (NH4)2B4O7+2HCl+5H2O=2NH4Cl+4H3BO3试剂所有试剂均用不含氨的蒸馏水配制。
2.1 硫酸铜。
11.凯氏定氮法名词解释
凯氏定氮法名词解释
凯氏定氮法是一种常用的蛋白质测定方法，其原理是通过测定样品中氮元素的含量来推算蛋白质的含量。
以下是关于凯氏定氮法中涉及的主要步骤的名词解释：
1.样品处理：在凯氏定氮法中，需要对样品进行前处理，即将样品中的蛋白质转化为氨基酸。
这一步通常是通过在样品中加入硫酸和催化剂，然后在高温下进行消化反应来实现的。
消化反应可以将样品中的有机物质转化为硫酸铵，同时将蛋白质转化为氨基酸。
2.蒸馏：在消化反应完成后，需要进行蒸馏操作。
蒸馏的目的是将样品中的氨气从消化液中分离出来，以便后续的吸收和滴定操作。
在蒸馏过程中，需要使用特殊的蒸馏装置和高温炉，以确保氨气能够完全从消化液中逸出。
3.吸收：蒸馏出来的氨气需要被吸收液吸收。
通常使用的是硼酸溶液作为吸收液，因为它具有较高的吸收效率和较低的挥发性。
在吸收过程中，氨气与硼酸反应生成硼酸铵，然后通过滴定操作可以测定硼酸铵的量，从而计算出样品中氮元素的含量。
4.滴定：滴定操作是凯氏定氮法中的最后一步，也是最关键的一步。
在这一步中，使用标准酸溶液对已经被吸收的硼酸铵进行滴定，从而确定硼酸铵的量。
通过与标准酸溶液的对比，可以计算出样品中氮元素的含量，进而推算出蛋白质的含量。
以上就是凯氏定氮法中的主要步骤和相关名词解释。
该方法具有准确度高、适用范围广等优点，被广泛应用于食品、药品、环境等领
域中的蛋白质测定。
凯氏定氮法
凯氏定氮法凯氏定氮法（英语：Kjeldahl method，全称凯耶达尔定氮法，简称凯氮法）是分析化学中一种常用的确定有机化合物中氮含量的检测方法。
这种方法是由凯耶达尔于在1883年发明。
凯氏定氮法是分析有机化合物含氮量的常用方法。
要测定有机物含氮量，通常是设法使其转变成无机氮，再进行测定。
一、原理：凯氏定氮法首先将含氮有机物与浓硫酸共热，经一系列的分解、碳化和氧化还原反应等复杂过程，最后有机氮转变为无机氮硫酸铵，这一过程称为有机物的消化。
为了加速和完全有机物质的分解，缩短消化时间，在消化时通常加入硫酸钾、硫酸铜、氧化汞、过氧化氢等试剂，加入硫酸钾可以提高消化液的沸点而加快有机物分解，除硫酸钾外，也可以加入硫酸钠、氯化钾等盐类类提高沸点，但效果不如硫酸钾。
硫酸铜起催化剂的作用。
凯氏定氮法中可用的催化剂种类很多，除硫酸铜外，还有氧化汞、汞、硒粉、钼酸钠等，但考虑到效果、价格及环境污染等多种因素，应用最广泛的是硫酸铜。
使用时常加入少量过氧化氢、次氯酸钾等作为氧化剂以加速有机物氧化。
消化完成后，将消化液转入凯氏定氮仪反应室，加入过量的浓氢氧化钠，将NH4+转变成NH3，通过蒸馏把NH3驱入过量的硼酸溶液接受瓶内，硼酸接受氨后，形成四硼酸铵，然后用标准盐酸滴定，直到硼酸溶液恢复原来的氢离子浓度。
滴定消耗的标准盐酸摩尔数即为NH3的摩尔数，通过计算即可得出总氮量。
在滴定过程中，滴定终点采用甲基红-次甲基蓝混合指示剂颜色变化来判定。
测定出的含氮量是样品的总氮量，其中包括有机氮和无机氮。
以蛋白质为例，反应式如下：消化：蛋白质+ H2SO4→（NH4）2SO4+ SO2↑+ CO2 ↑+ H2O蒸馏：（NH4）2SO4 + 2NaOH→ Na2SO4+ 2 H2O + 2NH3 ↑2NH3 + 4H3BO3→（NH4）2B4O7+ 5H2O滴定：（NH4）2B4O7+ 2HCl + 5H2O→2NH4Cl + 4 H3BO3蛋白质是一类复杂的含氮化合物，每种蛋白质都有其恒定的含氮量[约在14％~18％，平均为16％（质量分数）]。
凯氏定氮法
2.4 注意事项
（1） 所用试剂应用无氨蒸馏水配制。加
指示剂数滴及硫酸数毫升，以保持水呈 酸性。 （2） 若样品含脂肪或糖较多时，应注意 发生的大量泡沫 应加入少量辛醇或液体 石蜡，或硅消泡剂，防止其溢出瓶外， 并注意适当控制热源强度。 （3） 若样品消化液不易澄清透明，可加 入300g/L2~3ml 过氧化氢后再加热。
消化反应方程式如下： 2NH2(CH)2COOH＋13H2SO4 ＝(NH4)2SO4＋6CO2＋12SO2 COOH＋ ＋16H2O 浓硫酸具有脱水性: 浓硫酸具有脱水性:使有机物脱水后被炭化为碳、氢、 氮。 硫酸又具有氧化性: 硫酸又具有氧化性:将有机物炭化后的碳化为二氧化 碳，硫酸则被还原成二氧化硫 2H2SO4 ＋C ＝2SO2＋ 2H2O ＋CO2 二氧化硫使氮还原为氨，本身则被氧化为三氧化硫， 氨随之与硫酸作用生成硫酸铵留在酸性溶液中。 H2SO4＋2NH3 ＝ (NH4)2SO4
③ 滴定 滴定：取下接受瓶，以0.01000mol/L盐酸标 准溶液滴定至微红色为终点。
(V1 − V0 ) × c × 0.014 × F (5) 结果计算： W = ×100% V2 m× 100
式中W—蛋白质的质量分数，%； V0—滴定空白蒸馏液消耗盐酸标准液体积，mL； V1—滴定样品蒸馏液消耗盐酸标准液体积，mL； V2—蒸馏时吸取样品稀释液体积，mL； C—盐酸标准液的浓度，mol/L； 0.014—氮的毫摩尔质量，g/mmol； F—蛋白质系数； m—样品质量，g。
② 蒸馏 在消化完全的样品溶液中加入浓氢氧化钠使呈碱性， 在消化完全的样品溶液中加入浓氢氧化钠使呈碱性， 加热蒸馏，即可释放出氨气，反应方程式如下： 加热蒸馏，即可释放出氨气，反应方程式如下： 2NaOH＋ (NH4)2SO4＝ 2NH3↓＋ Na2SO4 ＋ 2H2O OH＋
凯氏定氮法
常量法 原理：
样品中含氮有机化合物经浓硫酸加消化，硫酸使有机物脱 水； 同时有机物炭化生成炭；
碳将硫酸氧化C成CO2自身还原为SO2 ；
2H2SO4+C=2SO2+2H2O+CO2
SO2使氮还原为氨，本身则氧化为SO3； 在反应过程中生成的氢，又加速氨的形成； 生成物中水和SO2逸去，氨与硫酸结合生硫酸铵留在溶液 中。 H2SO4+2NH3=(NH4)2SO4
有关加入K2SO4 CuSO4说明：
(1)、K2SO4的作用：提高溶液沸点从而加快 有机物分解（较其他硫酸盐效果好） 原理： K2SO4+H2SO4=2KHSO4 2KHSO4=K2SO4+H2O+SO2
• 但加入过多硫酸钾会导致体系温度过高， 引起生成的（NH4)2SO4热解造成N损失。 • （NH4)2SO4=NH3+NH4HSO4 • NH4HSO4=NH3+SO3+H2O
NH3+H2O
3、吸收与滴定
• 加热放出的氨用硼酸吸收，待吸收完后， 用盐酸标准液滴定
NH3 + H5BO3 NH4+ + H2BO3-
H2BO3- + H+
H3BO3
以上离子方程式说明:硼酸是弱酸，盐酸为强酸， 强酸制弱酸，且不影响指示剂显色结果
凯氏定氮法—原理小结
消化
• 2NH2+H2SO4+2H＝(NH4)2SO4 • （其中CuSO4做催化剂）
• • • • •
重要试剂的作用： 浓H2SO4：脱水、氧化 CuSO4溶液：催化剂（加速有机物氧化） 消化指示剂 K2SO4溶液：提高溶液沸点
（ ） 仪 器
凯氏定氮法
凯氏定氮装置仪器使用->凯氏定氮装置凯氏定氮仪由蒸汽发生器、反应室、冷凝管三部分组成（见下图）。
凯氏定氮蒸馏装置示意图1.电炉2.蒸气发生器3.安全管4.橡皮管5.碱液室6.反应室7.加样口8..安全管9.冷凝管10.接受瓶 11.棒状玻塞12.夹子仪器原理：含氮有机物与浓硫酸共热，有机物中所含氮转变成氨，并与硫酸结合为硫酸氢铵和硫酸铵，用氢氧化钠碱化后，释出氨，随水蒸馏出，用硼酸溶液或定量的酸吸收后，用标准酸液或标准碱液滴定，用空白试验校正。
使用方法：1. 定氮仪的构造和安装蒸汽发生器包括一个电炉(1)及一个3～5升容积的烧瓶(2).蒸汽发生器借橡皮管(4)与反应室相连。
反应室上边有二个小烧杯，一个叫加样口(7) 上面有棒状玻塞(11)供加样用；一个叫碱液室(5) 盛放液。
样品和碱液由此可直接到反应室 (6)中。
反应室中心有一长玻璃管，其上端通到反应室外层，下端靠近反应室的底部。
反应室外壳下端底部有一开口，连有橡皮管和管夹 (12)，由此放出反应废液。
反应所产生的氨可通过反应室上端气液分离器 (8)经冷凝管 (9)通入收集瓶 (10)中。
反应室与冷凝管之间由橡皮管相连。
2. 样品的处理固体样品随机取一定量研磨细的样品放入恒重的称量瓶中，置于105℃的烘箱中干燥4h用坩锅钳将称量瓶取出放入干燥器内，待降至室温后称重，随后继续干燥样品，每干燥1h，称重一次，恒重即可。
血清样品取人血（或猪血）放入离心管中，于冰箱中放置过夜。
次日离心除去血凝块，上层透明清液，即为血清。
吸出1ml血清加到50ml容量瓶中，用蒸馏水稀释至刻度，混匀备用。
3. 消化取3支消化管并编号，在1、2号管中各加入精确称取的干燥样品0.5～1g，加催化剂6.4g，浓硫酸10ml和2粒玻珠，在3号管中各加相同量的催化剂和硫酸（若样品是液体时，还要加与样品等体积的蒸馏水）作为对照，用以测定试剂中可能含有的微量含氮物质。
摇匀后，将瓶口上放一小漏斗，再把烧瓶斜置铁筐内放在通风厨内的电炉上消化。
凯氏(Kjeldahl)定氮法
为了加速消化，可以加入CuSO4作催化剂，K2SO4以提高溶液的沸点。收集氨可用硼酸溶液，滴定则用强酸。
计算所得结果为样品总氮量，如欲求得 样品中蛋白含量，应将总氮量减去非蛋白氮即得。如欲进一步求得样品中蛋白质的含量，即用样品中蛋白氮乘以6.25即得。
凯氏定氮法适用范围广泛，测定结果准确,重现性好，但操作复杂费时,试剂消耗量大。若采用模块式消化炉代替传统的消化装置, 可同时测定几份样品，节省时间,提高了工作效率，适用于批量蛋白质的测定,具有准确、快速、简便、低耗、稳定的优点。
1. 2 特点
凯氏定氮法是目前分析有机化合物含氮量常用的方法，是测定试样中总有机氮最准确和最简单的方法之一，被国际国内作为法定的标准检验方法。凯氏定氮法样品的最佳消化条件为硫酸铜2.50 g, 硫酸钾0.10 g,浓硫酸4.00 mL；硫酸铜的用量为影响消化时间的主要因素,硫酸钾和浓硫酸用量为第二和第三主要因素；用此最佳条件做实验, 消化时间仅为12 min；与其他硫酸铜、硫酸钾、浓硫酸用量方法对比,该法所需消化时间最短,试剂用量减少,可降低实验成本,也降低了对环境的污染。
一、微量凯氏（Kjeldahl）定氮法
1. 原理
凯氏定氮法测定蛋白质分为样品消化、蒸馏、吸收和滴定4 个过程。其原理是样品中含氮有机化合物与浓硫酸在催化剂作用下共热消化，含氮有机物分解产生氨,氨又与硫酸作用,变成硫酸铵。然后加碱蒸馏放出氨, 氨用过量的硼酸溶液吸收,再用盐酸标准溶液滴定求出总氮量换算为蛋白质含量。若以甘氨酸为例，其反应式如下：
CH2COOH
| + 3H2SO4——2CO2 + 3SO2 +4H2O +NH3 (1)
凯氏定氮法
(NH4)2SO4 + 2NaOH = Na2SO4 + 2NH4OH
NH3+H3BO3=NH4H2BO3
3. 再用已知浓度的HCI标准溶液滴定，根据HCI消耗的量计算出氮的含 量，然后乘以相应的换算因子，既得蛋白质的含量。
(NH4)2SO4 + 2NaOH = Na2SO4 + 2NH3 +2H2O
3. 吸收与滴定 硼酸H3BO3： 半微量或微量定氮通常用硼酸溶液吸收氨 的作用。硼酸呈微弱酸性，用酸滴定不影 响指示剂变色反应。
NH3+H3BO3=NH4H2BO3
标准溶液： 盐酸： HCl 硼酸溶液吸收后，再用标准盐酸直接滴定， 根据消耗体积得出氮的含量。
ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
5. 不要将样品粘在瓶颈上，炭化粘在壁上消 化不彻底．消化过程中要逐渐升温，当低温 加温至出现带有硫酸的白色气体后，才可升 温使溶液沸腾，但避免剧烈沸腾。 6.当氢氧化钠足量时有黑色氧化铜生成而使 溶液呈淡黑色；当氢氧化钠量不足时就无黑 色氧化铜产生而使溶液呈淡蓝色，加入的氢 氧化钠必须过量，并且动作还要迅速，以防 止氨的流失。
NH4H2BO3 + HCl =H3BO3 + NH4Cl
（二）各种试剂的作用 1. 消化：
硫酸： 1. 脱水。使有机物炭化，生成C， 2. 氧化。 H2SO4将C、 H氧化为CO2和H2O蒸汽逸 出，本身还原为SO2，而pro则分解成氮，则与硫 酸结合成硫酸铵，留在酸性溶液中
NH2 CHCOOH+2 H2SO4= SO2 + H2O + 2CO2 + NH3 2NH3+H2SO4= (NH4)2SO4
凯式定氮法 实验方法
Байду номын сангаас
通过进气口进入反应室进行洗涤，在冷凝管下口放一个盛有硼酸指示剂混合液的锥形瓶，冷凝管下端应完全浸没于液体中，洗涤 1~2 min，观察锥形瓶中溶液是否变色，若基本不变色，证明蒸馏
实验原理：被测的天然含氮有机物与浓硫酸共热时，其中的碳、 氢元素转变成CO2和H2O，而氮元素转变成氨，并进一步与硫酸 反应生成硫酸铵，此过程称为“消化”。消化时分解反应进行得 很慢，需要加入硫酸钾以提高沸点（可由290℃提高到400℃）， 加入硫酸铜作为催化剂（其他氧化剂如H2O2也可）。
蒸馏：凯氏定氮仪
凯氏定氮法
凯氏定氮法：
仪器：硝化炉 凯氏定氮仪
试剂：浓硫酸 0.5 mol/L 盐酸 40% NaOH
2% 硼酸
粉末硫酸钾-硫酸铜混合物（K2SO4: CuSO4〃5H2O=3 : 1） 混合指示剂：由50 ml 0.1%甲基蓝酒精溶液与100 ml 0.1%
甲基红酒精溶液混合而成，酸色为紫红色，碱色为绿色
洗，水封住进样口。酒精灯加热蒸馏瓶。当第一滴氨水从冷凝管
中滴下的时候，计时5min，后将硼酸溶液稍微离开蒸馏管口，让 蒸馏管口在硼酸液面吹2min，清洗蒸馏管口。
蒸馏时，碱液一定要控制好量，硼酸里面的指示剂颜色变为蓝色
后要再蒸馏五分钟左右。
滴定：滴定管
实验步骤：用0.5 mol/L 的盐酸滴定 用HCl滴定兰色蒸馏液和硼酸液的混合物，直至蓝色褪去，稍微有 一点粉色，滴定结束。
凯氏定氮法：
硝化：硝化炉
实验步骤：取2ml样液，加入到硝化管中，加入1.5g的催化剂 （K2SO4: CuSO4〃5H2O=3 : 1），后在通风橱中进行操作。在 消化管中加入放入浓硫酸6ml消化至消化管内的液体呈现出澄清 的浅蓝色。去除消化管，将其冷却后定容到50mL容量瓶中。 在消化时，电压先调低，约100v左右，一小时后再调最大。直 到消化成绿色透明状。 硝化温度：300—400℃
凯氏定氮法
一、凯氏（kjeldahl）定氮法优点：用于标准蛋白质含量的准确测定；干扰少优点①可用于所有食品的蛋白质分析中;②操作相对比较简单;③实验费用较低;④结果准确,是一种测定蛋白质的经典方法;⑤用改进方法(微量凯氏定氮法)可测定样品中微量的蛋白质缺点①最终测定的是总有机氮,而不只是蛋白质氮;②实验时间太长(至少需要2h才能完成);③精度差,精度低于双缩脲法;④所用试剂有腐蚀性.灵敏度低适用于0.2-1.0mg氮干扰物质：非蛋白氮（可用三氯乙酸沉淀蛋白质而分离）；费时太长二Folin-酚试剂法优点：操作简便，灵敏度高，比双缩脲法灵敏得多，样品中蛋白质含量高于5μg即可测得，是测定蛋白质含量应用得最广泛的方法之一。
缺点是费时间较长，要精确控制操作时间，标准曲线也不是严格的直线形式，且专一性较差，干扰物质较多。
对双缩脲反应发生干扰的离子，同样容易干扰lowry反应。
而且对后者的影响还要大得多。
酚类、柠檬酸、硫酸铵、tris缓冲液、甘氨酸、糖类、甘油等均有干扰作用。
浓度较低的尿素（0.5%），硫酸纳（1%），硝酸纳（1%），三氯乙酸（0.5%），乙醇（5%），乙醚（5%），丙酮（0.5%）等溶液对显色无影响，但这些物质浓度高时，必须作校正曲线。
含硫酸铵的溶液，只须加浓碳酸钠—氢氧化钠溶液，即可显色测定。
若样品酸度较高，显色后会色浅，则必须提高碳酸钠—氢氧化钠溶液的浓度1～2倍。
此法也适用于酪氨酸和色氨酸的定量测定。
此法可检测的最低蛋白质量达5mg。
通常测定范围是20~250mg。
三、Bradford法的突出优点是：（1）灵敏度高，据估计比Lowry法约高四倍，其最低蛋白质检测量可达1mg。
这是因为蛋白质与染料结合后产生的颜色变化很大，蛋白质－染料复合物有更高的消光系数，因而光吸收值随蛋白质浓度的变化比Lowry法要大的多。
（2）测定快速、简便，只需加一种试剂。
完成一个样品的测定，只需要5分钟左右。
由于染料与蛋白质结合的过程，大约只要2分钟即可完成，其颜色可以在1小时内保持稳定，且在5分钟至20分钟之间，颜色的稳定性最好。
凯氏定氮法
③同时作一空白试验，从消化开始到滴定。
④消化时不要用强火，应保持和缓沸腾，以免粘 贴在凯氏瓶内壁上的含氮化合物在无硫酸存在 的情况下消化不完全而造成氮损失。
⑤ 消化时应注意不时转动凯氏烧瓶，以便利用 冷凝酸液将附在瓶壁上的固体残渣洗下，并促进 其消化完全。
⑥ 样品中若含脂肪或糖较多时，消化过程中易 产生大量泡沫，为防止泡沫溢出瓶外，在开始 消化时应用小火加热，并时时摇动；或者加入 少量辛醇或液体石蜡或硅油消泡剂，并同时注 意控制热源强度。
(NH4)2SO4 检验
⑩蒸馏前加NaOH要足量，溶液应变为深蓝色或 黑褐色↓（Cu（OH）2、CuO、铜氨离子），如 颜色不变可能碱不够 。
⑾蒸馏完毕后，应先将冷凝管下端提离液面清洗 管口，再蒸1分钟后关掉热源．否则可能造成吸 收液倒吸。
⑿H3BO3吸收液的温度不应超过40℃，否则对 NH3的吸收作用减弱而造成损失。
<1>加硫酸钾 作为增温剂，提高溶液沸点， 纯硫酸沸点 340℃，加入硫酸钾之后可以提高 至400℃以上。也可加入硫酸钠，氯化钾等提 高沸点，但效果不如硫酸钾。
<2> 加硫酸铜 作为催化剂。还可以作消化终点 指示剂、蒸馏时碱性指示剂。还可以加氧化汞、 汞（均有毒，价格贵）、硒粉、二氧化钛。
<3> 加氧化剂 如双氧水、次氯酸钾等加速有机 物氧化速度。
2、特点：
（1）消化装置用优质玻璃制成的凯氏消化瓶，红 外线加热的消化炉。 （2）快速：一次可同时消化8个样品，30分钟可消 化完毕。 （3）自动：自动加碱蒸馏，自动吸收和滴定，自 动数字显示装置。可计算总氮百分含量并记录，12 分钟完成1个样。
如何测定蛋白氮？
先把非蛋白质的含氮物与蛋白质分开。一般多 采用沉淀剂（CuSO4 + NaOH，或三氯乙酸 ）， 将蛋白质沉淀析出，经过过滤（或离心分离）， 将沉淀物再用凯氏法测定含N量。
凯氏定氮法
谢谢大家 Thank you very much
.有机物中的胺根在强热和CuSO4，浓H2SO4 作用下，硝化生成
NH4HSO4反应式为： C12H14N2O2 +2H2SO4 → 2NH4HSO4 （其中CuSO4做催化剂） 2.在凯氏定氮器中与碱作用，通过蒸馏释放出NH3 ，收集于 H3BO3 溶液中 反应式为: NH4HSO4+2NaOH=NH3+2H2O+Na2SO4 2NH3+4H3BO3=(NH4)2B4O7+5H2O 3. 用已知浓度的H2SO4标准溶液滴定，根据H2SO4消耗的量计算 出氮的含量 反应式为： (NH4)2B4O7+H2SO4+5H2O=(NH4)2SO4+4H3BO3
凯氏定氮法
消解剂：常在硫酸中加入硫酸钾（或无水硫酸钠）提
高硫酸沸点，以提高消解温度，缩短消解时间，防止 铵盐分解
催化剂：加入催化剂加快溶解速度，以缩短消解时间。
常用的催化剂是低价、低毒、无挥发性的硫酸铜
辅助氧化剂：用以使某些难以分解的药物分解完全并
缩短消解时间。常用的辅助氧化剂有30%过氧化氢和 高氯酸。其中高氯酸为强氧剂，用量不宜过大，否则 可能生成高氯酸铵而分解或将氮元素氧化成氮气而损 失，而且高氯酸在高温加热时易发生爆炸
酸水解
水解法
不经有 机破坏
碱水解 还原法
药品分析的 前处理方法 湿法破坏
经有机 破坏
凯氏定氮法 高温炽灼发 单击添加文本
干法破坏Biblioteka 单击添加文本氧瓶燃烧法经有机破坏的处理方法
含金属及含卤素、氮、硫、磷等有机物结构中的待测
原子与碳原子结合牢固者，用水解或氧化还原的方法 难以定量将有机结合的待测原子转变为无机形式
凯氏定氮法
凯氏定氮法1. 简介凯氏定氮法（Kjeldahl method）是一种用于测定有机物中氮含量的常用方法。
它是以丹麦化学家尤利乌斯·凯尔达尔（Johan Gustav Kjeldahl）的名字命名的，凯尔达尔于1883年首次提出了这种方法。
该方法适用于几乎所有的有机物样品，例如农产品、食品、肥料、土壤和水等。
凯氏定氮法的优点包括简单、准确、可靠，并且适应性强。
2. 测试步骤步骤一：样品处理将待测样品称取一定量（通常1-2g），精确称量并记录质量。
步骤二：消解将样品转移到凯氏消解管中，加入适量的浓硫酸（H2SO4）。
为使反应顺利进行，可以加入一些催化剂，如汞硫化物（HgS）。
经过消解，样品中的有机氮转为无机氮盐，主要形式为硫酸铵（NH4HSO4）。
消解期间要保持适当的温度控制，一般在沸水浴中加热1-2小时，直至反应结束。
步骤三：蒸馏将消解液转移到凯氏蒸馏装置中，加入含有氢氧化钠（NaOH）和含有酚酞指示剂的接收瓶中。
蒸馏器中的氢氧化钠用于吸收硫酸铵产生的氨气，并将其转化为氨水（NH4OH）。
使用蒸馏水蒸馏样品溶液，将氨气从样品中分离出来。
通过连续蒸馏过程，将氨气捕集在接收瓶中。
蒸馏过程中，要注意控制好蒸馏速度，并确保溶液中氨气的完全转化。
步骤四：滴定将收集到的氨水与盐酸（HCl）标准溶液进行滴定，用来确定氨气的数量。
滴定过程中，使用酚酞指示剂作为指示剂，使溶液在转变至中性时由红色变为无色。
通过滴定得到的氨氮量与消解液中样品的氮量成正比。
3. 计算氮含量根据凯氏定氮法的原理，可以通过以下公式计算样品中氮的含量：氮含量（%） = 滴定液中的NH3-N浓度（mol/L） × 滴定体积（L） ÷ 样品质量（g）4. 注意事项•操作过程中要注意安全，避免与强酸和强碱接触，戴上实验手套和护目镜。
•操作前应将仪器设备清洗干净，以免产生误差。
•消解液中加入的催化剂必须少量使用，过多会导致滴定过程中的误差。
凯氏定氮法
凯氏定氮法编辑锁定凯氏定氮法是测定化合物或混合物中总氮量的一种方法。
即在有催化剂的条件下，用浓硫酸消化样品将有机氮都转变成无机铵盐，然后在碱性条件下将铵盐转化为氨，随水蒸气蒸馏出来并为过量的硼酸液吸收，再以标准盐酸滴定，就可计算出样品中的氮量。
由于蛋白质含氮量比较恒定，可由其氮量计算蛋白质含量，故此法是经典的蛋白质定量方法。
中文名凯氏定氮法外文名kjeldahl method分类蛋白质类型生物化学与分子生物学目录1. 1原理2. 2试剂1. 3仪器2. 4操作1. 5计算2. 6注意凯氏定氮法原理编辑蛋白质是含氮的有机化合物。
蛋白质与硫酸和催化剂一同加热消化，使蛋白质分解，分解的氨与硫酸结合生成硫酸铵。
然后碱化蒸馏使氨游离，用硼酸吸收后再以硫酸或盐酸标准溶液滴定，根据酸的消耗量乘以换算系数，并换算成蛋白质含量。
含氮量*6.25=蛋白含量.有机物中的胺根在强热和CuSO4，浓H2SO4 作用下，硝化生成（NH4）2SO4凯氏定氮法反应式为：2NH2+H2SO4+2H=(NH4)2SO4 （其中CuSO4做催化剂）2.在凯氏定氮器中与碱作用，通过蒸馏释放出NH3 ，收集于H3BO3 溶液中反应式为:(NH4)2SO4+2NaOH=2NH3+2H2O+Na2SO42NH3+4H3BO3=(NH4)2B4O7+5H2O3. 用已知浓度的H2SO4（或HCI）标准溶液滴定，根据HCI消耗的量计算出氮的含量，然后乘以相应的换算因子，既得蛋白质的含量反应式为：(NH4)2B4O7+H2SO4+5H2O=(NH4)2SO4+4H3BO3(NH4)2B4O7+2HCl+5H2O=2NH4Cl+4H3BO3凯氏定氮法试剂编辑所有试剂均用不含氨的蒸馏水配制。
2.1 硫酸铜。
2.2 硫酸钾。
2.3 硫酸。
2.4 2%硼酸溶液。
2.5 混合指示液：1份0.1%甲基红乙醇溶液与5份0.1%溴甲酚绿乙醇溶液临用时混合。
也可用2份0.1%甲基红乙醇溶液与1份0.1%次甲基蓝乙醇溶液临用时混合。
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凯氏定氮法
称取大米试样m克(0.65 g左右)（建议称取1.00-1.50g左右的样品），置于干燥的250mL 定氮瓶中，加入0.2g硫酸铜，6g硫酸钾及20mL浓硫酸，由GB/T5009.5-2003第一法，试样消化完全后（消化变绿之后继续消化半小时即可）移入100mL容量瓶中，并用蒸馏水定容，移取50 mL试样处理液加入定氮蒸馏装置中，加入50 mL氢氧化钠溶液(400 g/L)，以硼酸溶液(20 g/L) 50 mL作为吸收液，并加入3滴甲基红-亚甲基蓝指示液，蒸馏，用c (1/2H2SO4) =0.04526 mol/L硫酸标准滴定溶液滴定，同时进行空白试验，并在结果中加以校正。
计算公式：X=(V1-V2)×c×0.0140m×V50/V100×100(1)
其中：X—样品中蛋白质的含量(以氮计)，单位：g/100g；V1—试样消耗硫酸标准滴定溶液的体积，单位：mL；V2—试剂空白消耗硫酸标准滴定溶液的体积，单位：mL；c—硫酸标准滴定溶液的浓度，单位: mol/LV50—用50 mL移液管移取试样消化液的体积，单位: mL；V100—用100 mL容量瓶定容的试样消化液体积，单位：mL；m—样品的质量，单位：g0.0140~ 1.0 mL硫酸[c (1/2H2SO4) =1.000 mol/L]标准滴定溶液相当的氮的质量，单位：g。
通过以上公式就能够准确的测定出大米中的蛋白质含量。