血小板保存的研究进展

血小板保存的研究进展【中图分类号】r695 【文献标识码】b 【文章编号】1005-0515(2011)06-0418-02由于血小板制品具有显著而难以替代的止血疗效，因而随着医学技术的发展，其临床应用日益广泛。

既便如此，血小板制品在临床上仍长期处于严重供不应求的状况，未来的供需矛盾还会更加突出。

从全血中手工分离制备浓缩血小板的方法有富含血小板血浆法(prp法)和去白膜法(bc法[1])。

欧洲各国应用白膜法分离制备汇集血小板[2.3]。

目前国内制备浓缩血小板的2种方法都在应用。

下面就血小板的保存作一综述。

1 22℃室温保存由于血小板寿命短，结构和功能易受多种因素的影响，体外保存时条件要求较严格。

近年来，国内外广泛开展血小板室温保存的研究，充分肯定了22℃持续振荡保存对血小扳活力维持的可靠性和稳定性；已有许多国家将22℃作为血小板保存的常规温度。

认为保存24h的血小板具有与新鲜血小板相同的效果，血小板保存120h仍具有止血效果，而在保存过程中采用持续振荡可促进气体在血小板中的交换，防止血小板聚积，避免血小板．代谢产物形成高浓度，以及利于血小板从外界环境获取营养。

美国食品与药品监督管理局(fda)规定，血小板的储存时间为3一5d， 1984年根据已有的实验数据将保存时间延长至7 d，由于细菌污染导致输血反应发生的原因，1986年保存时间从7d缩短到5d。

现在许多国家根据血小板成分制品是否开展无菌检测决1定保存时间，通常未进行细菌培养的血小板成分制品保存5d，经细菌培养的可贮存7d。

最新的研究结果表明血小板在保存8d后其体内和体外质量指标均无差异[4]。

血小板保存液(pas)的研制和应用，改变了以往的储存环境，传统血小板成分制品经过离心，去除绝大部分血浆，制成”干血小板(dry platelet)”，不仅节约了血浆，还大大减少了过敏、发热等输血反应，提高了输血质量。

目前在英国已得到注册的pas有pas-ii、pas-iii、pas-iii m(ssp十)和composol，每种pas的使用都对应特定的血小板成分制品制备规程，一些学者研究发现血小板在pas 储存可延长约20dl[5，6]。

由于室温保存血小板时间短，长期以来，人们一直致力于血小板低温保存技术的研究，并取得较大成功。

2 血小板的深低温冰冻保存2．1 血小板深低温冰冻保存保护剂在深低温条件下，血小板胞膜内外的水都处于固态，细胞生命代谢基本停止，血小板及凝血因子等功能活性物质可长期保存而不会衰退或功能耗竭，但血小板低温保存需要经历降复温过程中的损害而存活下来，因此在降复温过程需要添加冰冻保护剂。

目前，血小板深低温冰．冻保护剂主要使用75％或100％dmso溶液，添加dmso时血小板体积先缩小再恢复至等渗的体积，在此过程中血小板体积不会发生膨胀，其缩小的最低限度也只能达到64％，所以75％dmso溶液快速添加或缓慢加入100%dmso溶液，不会导致血小扳超过安全体积范围；此外，dmso 分子量小，可透过细胞膜，可增加血液粘滞性、降低被冻细胞的变相点和延缓冷冻过程，减少冷冻过程中的蛋白质变性、延缓冰晶形成对细胞膜的损伤及减轻细胞脱水皱缩。

dmso不仅对血小板保存效果好，而且低浓度的dmso对人体没有副作用且制作方便，输注时不用洗涤；同时，dmso还有具有一定的抑菌和抗血小板凝集作用，可明显仿止微循环堵塞。

在血小板冰冻过程中，当细胞内外产生瞬间压力差时，dmso的分子运动可以迅速消除细胞内外的渗透压差和冰晶形成，避免细胞膜在冰冻过程中的损伤，从而达到低温保存的目的。

2.2 血小板深低温冰冻保存技术将制备好的fprp或机采血小板(血小板质量和标准同液体血小板)，置于无菌清净台内，把预先消毒的75％或100％dmso溶液缓慢添加到fprp或单采血小板内，边添加边轻轻振摇，添加速度为1ml／min，dmso终浓度为5％；把制作好的血小板用金属盒包装后放入-80℃冰箱，水平摆在金属架上，冰冻血小板盒之间保持3~5cm距离，在1-2h完成冰冻降温过程。

其保存有效期为1年；如需继续储存可置于液氮或-150℃以下，保存3年。

在保存期间低温冰箱断电不超过1h，并尽量减少打开冰箱门的次数，可延长深低温保存血小扳的保存期。

使用前从冰箱中取出，直接置于37℃循环式水浴箱内完全融化，融化完毕后室温可放置4h，采用普通输血器以患者可耐受的速度尽快输注。

随着-80℃冰箱在我国各地血站和输血科的逐渐推广应用，在血小板低温保存关键技术指导下采用-80℃低温冰箱保存血小板可以简化和解决上述不便，使冰冻血小板得以批量制备和大量储存，实现了血小板临床应用“零预约”，促进了冰冻血小板的临床应用[7]。

2．4 深低温冰冻保存血小板的临床应用效果深低温保存血小板输注疗效与新鲜血小板基本相同，具有即刻止血效果，特别适合手术、急诊、急性创伤出血的紧急抢救需求[8]。

研究表明，冰冻血小板比新鲜液态血小板具有更好的止血效果[9，10]。

深低温保存血小板制品内还有效保存了等体积血浆的全部凝血因子，融化后直接输注到受者外周循环血液中，可同时给患者提供血小板和全部凝血因子，特别适合战、创伤出血患者的输血救治，降低死亡率和致残率，同时可大幅度降低战时和紧急情况时血液的总需求量，将战时和紧急情况时输血救治提高到一个崭新的水平。

临床基层应用结果显示：没有发生严重的输血反应，其安全性高，止血疗效显著。

3 血小板的冰冻干燥保存3.1 血小板冻干保护剂筛选血小板来源于骨髓巨核细胞，无细胞核，在体外极易激活而发生聚集、胞内颗粒释放、变形反应等，结果是输入体内的血小板功能降低乃至丧失，也使得血小板的冻干保存方法不同于其它细胞--既要避免血小板冻干损伤，又要防止其体外过度激活--故血小板干燥保护剂的选择是保证其质量的关键。

海藻糖a (a-海藻糖)是一种对于环境变化形成的应激状态具有高抗性的物质，是生物体内的一种典型的应激代谢物，最初由wiggers 从黑麦麦角菌中分离出来，后发现它存在于低等蕨类植物、藻类、细菌、真菌、酵母、昆虫及无脊椎动物中，特别是在酵母、霉菌等真菌中，含量可>20％的生物体干重。

20世纪90年代以来，海藻糖的研究成为世界各国科学家研究的热点，其原因不仅因为海藻糖是一种低聚糖，而且它还具有独特的生物活性，即它对生物体和生物分子具有独特的非特异性保护作用。

迄今，国外对血小板冻干保存研究取得了一定进展，如美国加州大学生物稳定中心wolkers等[11]将负载海藻糖的血小板冻干再水化后，检测其对包括凝血酶、adp 在内的诱导剂的聚集反应性同新鲜血小板类似，但重复实验证明该法保存的血小板激活率高，体内存活期缩短。

1995年，read和bodel[12]首次观察到：将人血小板用1.8％的多聚甲醛固定、冻干、复水后，其超微结构完整，具有大多数血小板膜糖蛋白和黏附功能，但在体外，adp不能诱导冻干再水化后的血小板发生聚集反应，原因是多聚甲醛与膜和蛋白质发生不可逆交联作用，使血小板发生了理化性质改变，从而减弱了血小板的止血功能；海藻糖性质十分稳定，是天然双糖中性质最稳定的，无还原性，而且能够降低细胞膜的相变转化；同其它糖类如蔗糖相比较，海藻糖以其稳定性能好、不易降解变性等特性显示出了其巨大的优越性。

在各种恶劣环境下，海藻糖表现出对物种的生物膜、蛋白质和核酸等生物大分子良好的保护作用。

最新的研究表明，外源性的海藻糖具有良好的非特异性保护作用，因此有人把海藻糖称为“生命之糖”。

目前国内首选海藻糖作为血小板冷冻干燥的重要保护剂已取得了一些初步成果[13,14]。

3．2 冻干前有效负载海藻糖至胞内是血小板冻干保存成功的重要海藻糖是一种分子量较大的非还原性二糖，血小板胞膜对其具有非渗透性--海藻糖不能自由穿过细胞膜进入血小板胞内--而血小板自身又不能产生海藻糖，如何克服细胞膜的非渗透性而有效地将海藻糖载入到血小板胞内，是目前国内外学者研究的重点和热点。

海藻糖只有均匀分布在胞膜内外达到一定浓度，才能在血小板的冻干过程中对血小板起到更好的保护作用。

wolkers等发明了一种简便有效的将海藻糖负载到血小板胞内的方法-液相内吞方法。

3．3 血小板体外冻于前可逆性激活抑制剂的筛选在血小板体外冻干保存整个过程中(包括血小板负载海藻糖、在冻干缓冲液中再悬、冰东干燥、再水化等步骤)，皆可引起血小板过度激活，细胞数量回收率降低，使输入体内血小板功能降低乃至丧失，因此整个过程的处理损伤是影响血小板冻干后再水化特性的重要因素。

实践证明，获得高功能活性且数量回收率高的冻干血小板制品，避免血小板在处理过程的过度激活，筛选1种或几种可逆性的激活抑制剂来稳定保护血小板，防止其在体外过度激活，使其处于应用前的暂时休眠状态，是保证再水化血小板临床输注效果的关键[15]。

国外对可逆性血小板激活抑制剂的添加研究较少，国内有人将可逆性激活抑制剂腺苷和前列腺素e1 (pgel)在冻干血小板制备整个过程中对血小板激活抑制作用进行了系统研究[16]。

3．4 血小板冷冻干燥保存技术 1)37℃条件下，负载冻干保护液4h，冻干保护液中，血小板20％-50％、海藻糖0. 5％-2％、白蛋白0.5％-2％，干燥体积厚度<lcm、最佳<0.5cm。

2)冷冻：①自由降温至-15℃②由-15℃降至-40℃，降温速度(-1--5) ℃／min(最佳-1℃／min)；③-60℃以下维持1h以上。

3)干燥：①一级干燥，-35℃， 10-100mt；②二级干燥，18℃，10-100mt；③一级干燥和二级干燥之间采用快速直接升温，避免梯度升温。

4)真空干燥完毕后；充入保护气氮后封装保存，需要时复水后使用。

参考文献[1] 赵士刚，卢发强，徐国美，等．去白膜法分离血小板的研究进展[j]．中国输血杂志,2007，20(5)：438-440[2] vasconcelos e，figueimdo ac，seghatchian j．quality of platelet concentrates derived by platelet rich p]asma，buffy coat and apheresis[j]．transfus apher sd，2003，29(1)：13-16[3] murphy s．platelets from pooled buffy coats；an update[j]．transfusion，2005，45(4)：634-639[4] sherrill js, doug b,mary kj,et al. viability andfunction of 8- day-stored apheresis platelets [ j ]. transfusion,2006,46 ( 10 ): 1763-1769[5] van der meer pf,pietersz rni,reesink hw. storage platelets in additive solution for up to 12 days with maintenance of good invitro quality[j].transfusion ,2004,44(9) :1204-1211[6] hornsey vs, mocoll k, drummond o, et al. extended storage of platelets in ssp + platelet additive solution[ j]. vox sang,2006,94(1) :41---46[7] 刘景汉，欧阳锡林，王青梅，等．低温保存血小板在外科手术的应用[j]．中国输血杂志，2001，14（3）：139-141[8] khuri-sf, healey n, macgregor h, et al. comparison of the effects of transfusions of cryopreserved andliquid-preserved platelets on hemostasis and blood loss after cardiopulmonary bypass[j]．j thorac cardiovasc surg, 1999,117(1):172[9] bamard mr，macgregorh，ragno g，et al．fresh，1iquid -pre-served, and eryopreserved plateles adhesivc surface receptors and membrane prccoabmlant activity[ j]. fransfusion, 1999, 39 (8) :880-888[10] 刘景汉，于洋，欧阳锡林，等．深低温保存血小板临床应用疗效评价 [j]．中国医师杂志，2004, 6 (8) :1046-1048[11] wolkers wf，walker nj，tablin f，etal．human platelets loaded with trehalose survive freeze-drying[j]．cryobiology，2001，42(2)：79-87[12] bode ap．preclinical testing of lyophilized platelets as a product for transfusion medicine[j]．transfus sci，1995，16(2)：183-185[13] 卢发强，刘景汉，欧阳锡林，等．冻干前负载海藻糖对血小板体外激活和聚集反应的影响[j]．中国医师杂志，2005，7(11)：1441-1443[14] 刘景汉，卢发强，欧阳锡林，等．dmso在人血小板冻干前负载海藻糖过程中耐血小板的保护作用[j]．中国输血杂志，2006，19(4)：265-267[15] alberio l，clemetson kj．platelet inhibition and activation．mechanisms and clinical implications[j]．herz，2005，30(3)：176-180[16] 卢发强，刘景汉，欧阳锡林，等．人血小板冻干前负载海藻糖技术的研[j]．中国实验血液学杂志，2006，14(1)：156-161 作者单位：536000 北海市中心血站。