本科实验——猪丹毒杆菌的检测

猪丹毒杆菌检验

1 实验目的

了解猪丹毒杆菌的检验方法

2 设备和材料

除微生物实验室常规灭菌及培养设备外，其他设备和材料如下：2.1 冰箱:2℃~5℃。

2.2 恒温培养箱:36℃士1℃，42℃士1℃。

2.3 恒温摇床：30-200RPM

2.4 凝胶成像系统仪器

2.5 显微镜

2.6 振荡器。

2.7 电了天平:感量0.1 g。

2.8 无菌锥形瓶:容量500 mL，250 mL（各6个）。

2.9 无菌吸管:1 mL(具0.01 mL刻度)、10 mL(具0.1 mL刻度)或微

量移液器及吸斗。

2.10 无菌培养皿:直径90 mm（12个）。

2.11 无菌试管:10 m m×75 mm（45个）。

2.12 无菌毛细管。

2.13 pH计或pH比色管或精密pH试纸。

2.14 接种环、接种针（各6个）。

2.15 载玻片

3 培养基和试剂

3.1 缓冲蛋白胨水（BPW）

3.2 胰蛋白胨大豆肉汤（TSB）培养基

3.3 胰蛋白胨大豆琼脂（TSA）培养基

3.4 胎牛血清

3.5 三糖铁（TSI）琼脂

3.6 乳糖发酵管

3.7 半固体琼脂

3.8 蛋白胨水，靛基质试剂

3.9 SIM培养基

3.10 硝酸盐培养基

3.11 硝酸盐还原试剂（甲液：氨基苯磺酸；乙液：甲萘胺）3.12 革兰氏染色液（一套）

3.13 甲基红

3.14 1％明胶

3.15 香柏油

4 检验程序

5操作步骤

5.1增菌

以无菌操作取检样25 g( mL)，加在225 mL 营养肉汤中，以均质器打碎1 min 或用乳钵加灭菌砂磨碎，或置于盛有225 mL BPW 的无菌均质袋中，用拍击式均质器拍打1 min~2 min 。若样品为液态，不36℃±1℃

120r/min ，8h 四区划线，挑取单菌落

挑取2~3环于3mL TSB 培养基（加血清）中 革兰氏染色

显微镜检测

MR 实验、V-P 试验、靛基质

试验、硝酸盐还原试验 MR —、V-P —、硫化氢+、靛基质—、硝酸盐还原—、

明胶穿刺—、TSI （产酸，不产气，产硫化氢）

36℃±1℃，24h 共4个试管 硫化氢试验、明胶穿刺

试验、TSI 实验 PCR 检测，凝胶电泳，凝胶成像

报告

36℃±1℃ 24h

检样

TSA 培养基（加血清）

25g （mL ）样品+225mL BPW

需要均质，振荡混匀。无菌操作将样品转至500 mL锥形瓶中，如使用均质袋，可直接进行培养，于36℃士1℃培养8 h~10h。

5.2 分离和观察

分别用接种环取增菌液1环，四区划线接种于TSA琼脂平板（加入胎牛血清），于36℃士1℃分别培养18 h~24 h，观察菌落形态。挑取单菌落，进行革兰氏染色，后显微镜观察。

5.3 生化实验

5.3.1 自TSA琼脂平板上分别挑取2个以上典型或可疑菌落，接种三糖铁琼脂，先在斜面划线，再于底层穿刺。

5.3.2 以无菌操作将各菌分别穿刺接种至SIM培养基中，将所有试管置于37℃下培养24-48小时。

5.3.3 将被检菌穿刺接种于明胶培养基，于20℃培养7天，逐日观察明胶液化现象。如室温高，培养基自行溶化时，可与冰箱内放置30分钟，然后取出观察结果，不再凝固时为阳性。

5.3.4 MR 实验、V-P试验、靛基质试验、硝酸盐还原试验检验。5.3.5 PCR检测，凝胶电泳，凝胶成像

6结果与报告

综合以上生化试验和PCR鉴定的结果，报告25 g（mL）样品中检出或未检出猪丹毒杆菌。