第五章 茎尖培养与快速繁殖

第五章茎尖培养与快速繁殖
第一节茎尖培养脱毒技术
一、培育无病毒苗的意义
植物病毒病：由病毒和类病毒、支原体等引起，已发现此类病害700多种，无性繁殖植物严重；无特效药，培育无毒种苗是主要防治措施。

获得无病毒种苗的途径：
1）从现有种质中筛选无毒单株；
2）已感染植株脱毒。

二、植物脱毒的方法
1. 热处理：病原物与植物耐热性不同，将植物在较高温度下处理一段时间，病原物钝化、失活或不能繁殖，而植物所受影响较小、生长较快，使病毒减少甚至消灭。

方法：
1) 温汤浸渍：50℃温水中浸10分钟~数小时，简便易行，适用于休眠器官、接穗或种子。

2) 热空气处理：在温热治疗室/箱内，35~40℃，几十分钟~数月。

对茎尖效果较好，热处理后取较大茎尖培养，可提高成活率与脱毒率。

注意：易受伤，掌握温度与时间。

2. 茎尖培养脱毒
3. 其他途径脱毒
3.1 愈伤组织培养脱毒：花器官、珠心胚等愈伤中存在无病毒细胞群，从再生植株可得到无病毒苗。

3.2 茎尖微体嫁接脱毒：在无菌条件下，将切取的茎尖嫁接到培养的砧(zhen)木苗上。

3.3 抗病毒剂的应用：
抗病毒醚: 可抑制病毒复制和扩散，
嘌呤和嘧啶类似物;
抗菌素
三、茎尖培养脱毒技术
1、原理
病毒在植物体内分布不均匀，茎尖等生长点因为无维管束，病毒只能通过胞间连丝传递，赶不上细胞分裂和生长的速度，所以茎尖几乎不含病毒。

茎尖培养脱毒效果好，后代稳定，目前广泛应用。

2、脱毒技术
2.1 操作
取无菌顶稍1~2 cm→解剖镜(8—40倍)下→剥去幼叶→切取茎尖0.2～0.5 mm、带1~2个叶原基→接种。

注意：随切随接，防止变干；茎尖小较好，但太小不易成活，过大又不能保证完全脱毒。

草莓：茎尖0.2~0.3mm，脱毒率100%；1mm，脱毒率50%。

2.2 培养基
基本培养基: MS、White、B5等。

碳源: 蔗糖效果好，可用白砂糖
激素：2,4-D、IAA、NAA等，通常低浓度。

2.3 继代培养
初代培养长成的新梢→切成小段→增殖培养基→1个月左右→新梢又可扩繁→→建立和维持茎尖无性系。

继代培养常用MS培养基。

2.4 生根与移栽
常用生根方法：
用1/2、1/3、1/4MS或White培养基，附加NAA、IAA、IBA等，最好加活性炭(0.3％)。

或者：
将新梢基部浸入50~100mg/L的IBA中4-8h，然后转入无激素培养基中生根。

移栽：同前。

3、脱毒苗的鉴定
3.1 酶联免疫法（ELISA）
将抗原和抗体的免疫反应与酶的高效催化作用相结合，形成酶标记的免疫复合物；酶遇到底物后生色，用肉眼观察，或用比色法检测结果。

灵敏度高，广泛应用。

3.2 抗血清鉴定法
用已知抗血清鉴定未知病毒的种类。

3.3 指示植物法
指示植物：对某种或某几种病毒/类病毒具有敏感反应，并表现明显症状的寄主植物，又称鉴别寄主。

两类指示植物：
一是产生系统性症状，病毒可扩展到非接种部位，常无局部病斑；
二是只产生局部坏死、褪绿或环状斑。

方法：将脱毒苗汁液接种在指示植物上，根据病斑产生与否鉴别脱毒情况。

只能鉴定靠汁液传染的病毒，草本接种较易，木本较难，用嫁接传染法。

3.4 分子生物学检测
1）dsRNA分析
2）核酸分子杂交。

3）PCR技术。

3.5 电镜检查
4、脱毒苗的保存与利用
4.1 脱毒苗的保存
脱毒植株可能很快被重新感染，应隔离繁殖与保存。

原原种：经脱毒处理、检测无毒的植株；
原种：由原原种在隔离条件下繁殖的种苗；
由原种繁殖的脱毒苗供生产用。

隔离措施：建立隔离带、防虫网室，土壤消毒。

4.2 脱毒苗的利用
尽量用染毒轻的生产场地，一旦感染，应重新采用无病毒苗。

脱毒苗的繁育体系
流程工作区域
第一年脱毒试管苗无菌室
第二年原原种无菌室
第三年原种网室/温室
第四年良种隔离区
第五年商品种繁殖区
生产生产大田
5. 中国组培脱毒苗生产现状
已建立马铃薯（病毒病减产50%以上）、草莓、甘薯、苹果、葡萄、香蕉、菠萝、番木瓜、甘蔗等脱毒苗生产基地。

脱毒苗通常增产20~30%，草莓可达50%，且上等果比例高。

第二节茎段培养快速繁殖技术
一、离体快繁的应用
1、概念：将植物的器官和组织进行离体培养，使其快速成苗的技术，又叫微繁殖。

应用：
珍稀濒危植物
名优特新品种
脱毒苗
转基因试管苗的快繁。

林木、园艺、药用植物广泛应用，
重点在无性繁殖植物。

2、优缺点
优点：
1）繁殖系数高、速度快：扦插和嫁接每年几倍~几十倍；离体快繁几万~百万倍。

2）繁殖特殊材料：单倍体、三倍体，常规方法繁殖难。

3）可与脱毒技术相结合。

4）生长一致，商品性好，可常年进行。

缺点：
操作复杂，设备昂贵，成本较高。

二、离体快繁技术
1.无菌培养物的建立
常用带芽的茎段、茎尖或芽，某些植物用根、茎、叶或花器官等作外植体，接种培养，获得初代培养物。

2. 茎芽的增殖
以芽的增殖为主，可以不考虑根的生长。

依外植体不同，初代培养获得茎芽有4种途径：
1）顶芽/腋芽增殖：用茎尖或侧芽培养获得丛芽或芽苗，可加细胞分裂素促进之。

草莓、香石竹、唐菖蒲、非洲菊、月季、苹果、葡萄、猕猴桃等。

此途径较普遍。

2）不定芽增殖：在根、茎、叶、愈伤等非芽固定生长位置产生的芽都叫不定芽。

此途径较普遍。

由愈伤再生不定芽一般不可取（耗时、变异）。

3）体胚增殖：有200多种植物可产生体胚，前景好，但目前很多物种还不成熟，成苗率低。

4）原球茎增殖：兰科植物茎尖或侧芽培养形成球形块茎，一种特殊的繁殖体，本身可以增殖，转移到生根培养基上后长成小植株。

以兰花为例：
兰花离体快繁：
Morel提出了兰花离体无性繁殖方法。

兰茎尖→原球茎→芽→根（兰苗）
原球茎: 类似于种子萌发时由胚形成的结构；将原球茎分割成小块后可快速产生新的原球茎，并可成苗。

3. 壮苗、生根与移栽
组培苗/嫩枝1~2cm高时进行。

先壮苗后生根，即降低细胞分裂素浓度，增强光照等。

问题：不易生根（延长时间、继代）；
生根：1/2或1/4 MS，减少或去掉细胞分裂素，加适量NAA或IBA（吲哚丁酸）；减少蔗糖，增强光照。

移栽：同前。

4、存在问题
1）外植体褐变
原因：主要是外植体中的多酚氧化酶被激活，催化酚类生成醌类，醌经非酶促聚合，形成深色物质。

危害：毒害细胞，影响外植体生长与分化，甚至死亡。

影响因素：基因型、生理状态、外植体受伤程度、灭菌时间、培养基和培养条件。

减轻褐变的措施：
a. 外植体：选酚类含量低的基因型及幼龄材料剪取外植体→液体预培养3~7d →取出用漂白粉等还原剂浸泡→正式接种培养。

b. 培养基与培养条件：用低盐培养基，减少细胞分裂素，适当低温、弱光照，连续继代培养。

c. 用褐变抑制剂和吸附剂：培养基中加Vc、聚乙烯吡硌烷酮（PVP，酚类专一吸附剂）、活性炭、半胱氨酸、柠檬酸、谷胱甘肽[glu:tə'θaiəun]等抗氧化剂，或用SO2、亚硫酸盐、氯化钠等PPO (多酚氧化酶) 抑制剂。

几种试剂混用效果可能更好。

2）组培苗玻璃化
症状：茎叶半透明或透明、水渍状，叶皱缩卷曲，植株矮小、失绿、含水多、脆弱易碎。

原因：不清楚，基因型、培养基、细胞分裂素较高及弱光照、高温高湿、透气性差、继代次数过多等都有影响。

降低玻璃化的措施：
a. 增加琼脂或蔗糖，或加渗透剂，以提高培养基渗透压，使组培苗吸水困难；
b. 降低细胞分裂素用量，加适量IAA、GA3、ABA；
c. 减少NH4+、提高Ga2+含量；
d. 增加/进行自然光照（UV促进木质化和试管苗成熟）；
e. 降低培养温度，或变温培养；
f. 用通气性好的封口材料。

3）生根难：
对策：
a. 降低培养基盐浓度；
b. 适当增加IAA等生长素用量，不用或少用细胞分裂素；
c. 减少糖供应、增加光照以增强植株的自养能力；
d. 较难生根的木本植物采取微体嫁接、化学刺激等方法处理。