人溶菌酶基因在大肠杆菌中的表达研究
溶菌酶的实验报告
溶菌酶的实验报告实验报告：溶菌酶的活性和特性1. 引言溶菌酶是一种酶类蛋白质，广泛存在于细菌、真菌和某些病毒中。
它们能够降解细菌细胞壁的组分，导致细菌破裂和死亡。
溶菌酶在医疗、食品工业以及科学研究领域广泛应用。
本实验旨在测定溶菌酶的活性，并研究其特性。
2. 材料与方法2.1 实验材料- 大肠杆菌（或其他细菌菌株）- 溶菌酶溶液- 反应液：含有溶菌酶的缓冲液- 应答物：含有细菌菌株的琼脂平板2.2 实验步骤1. 在琼脂平板上涂布一层薄膜状的细菌液体（大肠杆菌）。
2. 在涂布的细菌表面滴加一定量的溶菌酶溶液。
3. 将琼脂平板在恒温孵化箱中孵育一段时间（通常为24小时）。
4. 检查平板上是否有清晰的细菌溶解区域（透明区域），观察细菌溶解的程度。
3. 结果与讨论在实验过程中，我们发现在涂布完细菌后，经过一段时间的孵育后，在加入溶菌酶的区域产生了明显的细菌溶解区域（透明区域）。
这表明溶菌酶对细菌产生了溶解作用。
溶菌酶的活性可以通过以下几个方面进行评估：3.1 溶菌酶单位（U）溶菌酶单位（U）的定义是在标准条件下，使得溶菌酶在30分钟内使细菌的可溶菌酶量增加1倍所需要的溶菌酶量。
通过测定单位时间内细菌总数量的变化，可以计算出溶菌酶的活性。
活性（U/ml）=单位时间内可溶菌酶总量/单位时间内总分析体积3.2 温度和pH值的影响我们可以通过在不同温度条件下进行实验，或者在不同pH值的溶液中测量溶菌酶活性，来研究温度和pH的影响。
溶菌酶活性在不同温度下可能表现出不同的变化趋势。
通常情况下，随着温度的升高，溶菌酶活性增加，但过高的温度可能导致其变性。
我们可以通过测量不同温度下的溶菌酶活性来确定最适温度。
溶菌酶活性也受pH值的影响。
溶菌酶通常在中性或弱碱性条件下表现出最佳活性。
在酸性环境下，酸性基团可能与酶分子中的氨基酸残基相互作用，从而降低酶的活性。
我们可以通过在不同pH值的缓冲液中测量溶菌酶活性，找到最适宜的pH值。
溶菌酶实验报告讨论
溶菌酶实验报告讨论溶菌酶实验报告讨论引言：溶菌酶是一种广泛存在于细菌和其他生物体中的酶类物质。
它具有破坏细菌细胞壁的作用，从而导致细菌的溶解。
溶菌酶在医学、食品工业和生物技术等领域具有重要的应用价值。
本实验旨在通过观察溶菌酶对细菌的作用，探讨其在抗菌领域的潜力。
实验方法：1. 实验材料准备：- 溶菌酶溶液- 青霉素溶液- 培养基- 大肠杆菌培养物2. 实验步骤：a. 在培养基上均匀涂布大肠杆菌培养物。
b. 在培养基上划分两个区域，一个区域加入溶菌酶溶液，另一个区域加入青霉素溶液。
c. 将培养皿放入恒温培养箱中，以37摄氏度培养24小时。
d. 观察培养皿上菌落的变化。
实验结果：经过24小时的培养，我们观察到以下结果：- 溶菌酶作用区域：在溶菌酶作用区域，我们发现大肠杆菌培养物的菌落明显减少，甚至完全消失。
这表明溶菌酶对大肠杆菌具有明显的抑制作用。
- 青霉素作用区域：在青霉素作用区域，我们观察到大肠杆菌培养物的菌落没有明显的减少。
这说明青霉素对大肠杆菌的抑制作用相对较弱。
讨论：1. 溶菌酶的抗菌机制：溶菌酶通过破坏细菌细胞壁的作用，导致细菌的溶解。
细菌细胞壁主要由肽聚糖和肽聚肌醇组成，溶菌酶能够水解肽聚糖，破坏细菌细胞壁的完整性，从而导致细菌的死亡。
2. 溶菌酶与青霉素的比较：溶菌酶和青霉素都具有抑菌作用，但两者的作用机制不同。
溶菌酶通过破坏细菌细胞壁来抑制细菌生长，而青霉素则是通过抑制细菌的细胞壁合成来发挥抗菌作用。
实验结果显示，溶菌酶对大肠杆菌的抑制作用更明显，这可能与大肠杆菌细胞壁的结构特点有关。
3. 溶菌酶的应用前景：溶菌酶具有广泛的应用前景。
在医学领域，溶菌酶可以用于治疗细菌感染，特别是对于那些对抗生素耐药的细菌感染具有重要意义。
在食品工业中，溶菌酶可以用于食品的保鲜和防腐，有效地抑制细菌的生长。
此外，溶菌酶还可以应用于生物技术领域，用于细菌的基因工程和表达调控等方面。
结论：本实验结果表明溶菌酶对大肠杆菌具有明显的抑制作用，其抗菌机制主要通过破坏细菌细胞壁实现。
我国溶菌酶的研究与应用进展
我国溶菌酶的研究与应用进展一、本文概述溶菌酶是一种广泛存在于生物体内的水解酶，具有溶解细菌细胞壁的能力，因此在生物防御和医药领域具有重要的应用价值。
我国作为世界上人口最多的国家，对于溶菌酶的研究与应用具有深远的实际意义。
本文旨在综述我国溶菌酶的研究现状、应用领域以及未来的发展趋势，以期为推动溶菌酶在我国生物医药、食品工业、农业等领域的应用提供理论支持和指导。
在过去的几十年里，我国溶菌酶的研究取得了显著进展。
从最初的基础研究，到如今的产业化应用，溶菌酶在我国已经成为一种重要的生物活性物质。
本文将从溶菌酶的来源、性质、制备方法、应用领域等方面进行全面概述，并对我国溶菌酶研究的未来发展进行展望。
本文还将关注溶菌酶在应对抗生素滥用和耐药性问题中的潜力，以期为我国生物医药产业的可持续发展提供新的思路和方法。
二、溶菌酶的结构与性质溶菌酶是一种能水解致病菌中黏多糖的碱性酶，主要通过破坏细胞壁中的N-乙酰胞壁酸和N-乙酰氨基葡糖之间的β-1,4糖苷键，使细胞壁不溶性黏多糖分解成可溶性糖肽，导致细胞壁破裂内容物逸出而使细菌溶解。
溶菌酶广泛存在于动物、植物、微生物体内，不同来源的溶菌酶其分子结构具有一定差异，但基本性质相似。
溶菌酶分子量较小，通常约为14-15KD，是一种碱性蛋白质。
其等电点通常在pH值5-0之间，因此，在酸性环境中溶菌酶分子带正电荷，可与带负电荷的微生物细胞壁发生静电吸附。
溶菌酶具有较高的热稳定性，能在50℃左右保持较长时间的活性，但其活性受pH值影响较大，通常在pH值3-4范围内活性最高。
溶菌酶对多种化学试剂表现出较强的稳定性，如氯化钠、氯化钙等盐类以及乙醇、丙酮等有机溶剂对其活性影响较小。
溶菌酶的作用机制主要是通过其催化活性水解细菌细胞壁中的多糖成分，导致细胞壁破裂，从而使细菌失去生存能力。
溶菌酶还具有抗病毒、抗肿瘤、抗炎等多种生物活性，因此在医药、食品、饲料等领域具有广泛的应用前景。
在医药领域，溶菌酶可作为抗菌药物使用，对多种革兰氏阳性菌和阴性菌具有抑制作用，尤其对耐药性金黄色葡萄球菌和链球菌具有较强的杀菌作用。
第4章 基因在大肠杆菌和酵母中的表达
降低包含体形成的措施： 降低培养温度；诱导物浓度； 培养基中加入添加剂；培养基组分、pH等。
包含体复性方法： 尿素； 透析、稀释和超滤复性法； PEG、TritonX、肝素、人工伴侣等
原核表达系统的优点与不足
优点：
产量高、表达高效； 操作简单（可调控表达、方便纯化）； 可大规模发酵生产； 成本低。
不足：
缺乏真核中的修饰系统，产物有时缺乏活性。 表达产物易形成包含体。
第二节 真核表达——目的 基因在酵母中的表达
酵母菌表达外源蛋白的优点：
遗传背景清楚 属真核模式生物，具备蛋白质翻译后加 工系统 可发酵生产 不产生内毒素，属安全的表达系统
2
ü 优点： 1. 由于周质中蛋白质种类比较少，因此目标
蛋白质的纯化就比较简单
2. 蛋白质酶解的程度不甚严重
3. 促进了二硫键的形成及蛋白质的折叠作用 （氧化环境）
4. 蛋白质的N-末端结构真实
正确折叠的蛋白质，在转运过程中，在 体内对信号肽进行切割
五、包含体及复性
包含体（inclusion body）：蛋白质在大肠杆菌中 大量表达时，在胞内聚集形成不可溶的、没有生物 活性的固体颗粒。
T7 RNA聚合酶/T7启动子的优点：
合成RNA的速度高；
只识别T7启动子，不启动其它基因的转录；
对利福平（能抑制大肠杆菌RNA聚合酶）等抗 生素有抗性，能表达一些大肠杆菌RNA聚合酶 不能转录的序列；
产物量大，可达总蛋白的25％以上。
1
94kDa 67 kDa 43 kDa
大肠杆菌中的基因表达
PL 和 PR 表达系统
宿主菌中没有 cI 基因产物，PL、PR 启动子的高强度直接转录，带有PL
或 PR 启动子的表达载体在普通大肠杆菌中相当不稳定。
对宿主菌的要求
用溶源化 l 噬菌体的大肠杆菌作 PL、PR 启动子表达载体的宿主菌
N4830-1，POP2136 等菌株已经溶源化 cI 857(ts) l 噬菌体， 可用作表达外源基因时的宿主菌。 把 cI 857(ts) 基因组装在表达载体上 宿主菌选择范围更大
cAMP激活CAP，CAP–cAMP复合物与 lac 操纵子上专一位点结合
后，能促进 RNA 聚合酶与 –35、–10 序列的结合，进而促进 Plac
介导的转录。
基因工程中使用的 lac 启动子均为抗葡萄糖代谢阻遏的突变型，即 Plac UV5
cAMP
CAP lacI
RNRANA 聚聚合合酶酶
Plac
二、大肠肝菌中的基因表达
2. 影响目的基因在大肠杆菌中表达的因素
（3）表达产物的稳定性： 组建融合蛋白； 利用信号肽； 特异性突变； 位点特异突变，改变二硫键位置； 宿主蛋白酶缺陷。
二、大肠肝菌中的基因表达
2. 影响目的基因在大肠杆菌中表达的因素
（4）细胞的代谢负荷： 细胞大量生长时，抑制外源基因的表达； 宿主细胞的生长与重组质粒的复制分开；
二、大肠肝菌中的基因表达
2. 影响目的基因在大肠杆菌中表达的因素
（1）外源基因的拷贝数：与载体在宿主中的拷贝数直接相关。 （2）外源基因的表达效率：启动子的强弱，SD序列和ATG的间距等。
A、启动子的强弱：目的基因插入表达载体启动子的下游，可增加
基因的表达。lac、trp、 tac、bla。
B、核糖体结合位点的有效性 C、SD与ATG的间距：影响非融合蛋白的合成水平 D、密码子组成：设计引物或合成基因时选择大肠杆菌“偏爱”的密码
溶菌酶作用实验范文
溶菌酶作用实验范文溶菌酶作用实验是研究溶菌酶对溶菌作用的一种实验方法。
溶菌酶是一种酶，主要能够溶解细菌的细胞壁，使细菌细胞发生溶解死亡。
溶菌酶在生物学研究和医学领域具有广泛的应用价值。
下面将对溶菌酶作用实验进行详细介绍。
实验目的：1.掌握溶菌酶的提取和纯化方法；2.研究溶菌酶对不同细菌产生的溶菌作用；3.分析溶菌酶作用的影响因素。
实验材料：1.大肠杆菌、金黄色葡萄球菌等细菌菌种；2.PBS缓冲液；3.试剂：琼脂、溶菌酶提取液、洗涤缓冲液、显色液等。
实验步骤：1.细菌培养与处理：a.在LB琼脂平板上分别刺穿大肠杆菌和金黄色葡萄球菌菌种，并进行预培养。
b.将培养好的菌种转接到LB培养基中，继续培养至对数生长期。
c.收集培养好的菌液，用PBS缓冲液洗涤2次。
2.溶菌酶提取：a.在PBS缓冲液中添加适量的溶菌酶提取液，使其充分混合。
注意溶菌酶的浓度应根据实验需求调整。
b.将菌液加入上述混合液中，充分搅拌，并放置在适当的温度下孵育一段时间。
3.溶菌酶活性测定：a.取一定体积的培养液，用洗涤缓冲液洗涤。
b.加入一定体积的溶菌酶提取液，并放置一段时间。
c.加入显色液，观察样品颜色变化情况，其浓度与颜色深浅呈正比。
4.溶菌酶对细菌的溶菌作用观察：a.在琼脂平板上分别刺穿大肠杆菌和金黄色葡萄球菌菌种。
b.在刺穿孔中滴加经溶菌酶处理后的细菌菌液，观察菌液滴体周围有无溶菌区域的产生。
实验结果与讨论：通过上述实验步骤，可以得到如下结果和讨论：1.溶菌酶提取和纯化方法的效果：根据溶菌酶的活性测定结果，可以评估溶菌酶提取和纯化的效果。
如实验结果呈现浓度与颜色深浅呈正比的趋势，则说明溶菌酶提取和纯化方法较为有效。
2.溶菌酶对不同细菌的溶菌作用：根据溶菌酶对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌菌液的处理结果，可以观察溶菌区域的产生情况。
如果溶菌区域明显，则说明溶菌酶对这些细菌有明显的溶菌作用。
3.溶菌酶作用的影响因素研究：可以通过改变实验条件，如溶菌酶的浓度、温度和pH值等，对溶菌酶的活性产生影响的强弱进行分析和讨论。
人类抗菌肽及溶菌酶对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌的白念珠菌的协同抗菌作用
为另～类重要的天然阳离子抗菌肽，由于其氨基酸序列以两个亮氨酸 （Ｌｅｕｃｉｎｅ，简称Ｌ）起始，共３７个氨基酸残基而得名。ＬＬ一３７在中性粒细 胞组成性分泌，在角质形成细胞可被诱导产生。抗菌肽具有广谱抗微生 物活性，可杀灭细菌、真菌以及病毒。溶菌酶主要存在于分泌细胞、角 质形成细胞和汗液、唾液、泪液、乳汁等体液中，也具有杀灭细菌和真 菌的能力。已有报告人类ａ防御素和ＬＬ．３７能协同抗金黄色葡萄球菌（金 葡菌）和大肠杆菌，也有报告人类正常皮肤的ｐＨ值为酸性。而ｈ／３Ｄ一１、 ｈＢＤ一２、ｈＢＤ．３、ＬＬ．３７以及溶菌酶能否在中性及酸性ｐＨ条件下协同抗细 菌及真菌尚未见报道。 目的：研究在酸性和中性ｐＨ条件下ｈＢＤ一１、ｈＢＤ一２、ｈＢＤ一３、ＬＬ一３７ 以及溶菌酶对金葡菌、大肠杆菌和白念珠菌的协同抗菌作用。 方法：抗菌肽和溶菌酶的抗金葡菌和大肠杆菌敏感性用微量稀释法 检测，抗白念珠菌活性采用稍加修改的美［雪ＮＣＣＬＳ ＣＮａｔｉｏｎａｌ
ｔｏ
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ｗｉｔｈ ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌ ａｃｔｉｖｉｔｙ ａｇａｉｎｓｔ ｂａｃｔｅｒｉａ ｈｕｍａｎ ｕ—ｄｅｆｅｎｓｉｎｓ
ｒｅｍａｉｎｅｄ ｕｎｃｈａｎｇｅｄ．Ｉｎ ｔｈｅ
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ｌｙｓｏｚｙｍｅ
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溶菌酶研究进展及在畜牧业中的应用
溶菌酶研究进展及在畜牧业中的应用作者：张莹雪来源：《科学与财富》2018年第28期摘要：溶菌酶是一种性质稳定、耐酸耐高温、来源于动植物及微生物的球蛋白，具有抑菌、抗病毒等功能。
通过对溶菌酶进行物理、化学及配伍改进，能够提高溶菌酶的生物学功能，作为一种对人和动物安全的抗菌剂，溶菌酶能够提高饲料利用率，用作饲料防腐剂和杀菌剂，用于饲料中可替代抗生素，治疗畜禽疾病等，应用前景相当广阔。
关键词：溶菌酶；功能；改进；饲料；畜牧业1、溶菌酶的结构及性质溶菌酶是由多种氨基酸残基构成的碱性球蛋白，属于葡萄糖苷酶，其纯品为白色或微黄色结晶体或无定型粉末，无臭、微甜、易溶于水和盐溶液，不溶于丙酮、乙醚，化学性质稳定，干燥室温条件下可长期保存。
目前研究比较透彻的是鸡蛋清溶菌酶和牛胃溶菌酶。
2、溶菌酶的分类（1）动物源溶菌酶：分为C型、G型和I型三种类型。
（2）植物源溶菌酶：目前发现含溶菌酶的植物有近170 种，在木瓜、无花果、胡萝卜、大麦等植物中均能分离出溶菌酶。
（3）微生物源溶菌酶：根据其作用对象主要分为细菌细胞壁溶菌酶和真菌细胞壁溶菌酶。
（4）噬菌体溶菌酶：噬菌体产生的溶菌酶具有特异性，由噬菌体感染、诱导宿主细胞产生，未被感染细胞中不存在。
（5）利用基因工程手段制备的溶菌酶：利用基因重组技术将人溶菌酶基因克隆到原核或者真核生物中进行表达。
3、影响溶菌酶活性的因素溶菌酶的活性受到温度、pH、化学环境等因素影响较大。
溶菌酶遇热很稳定，pH值4～7、100℃处理1min仍保持原酶活性；pH值5.5、50℃加热4h后，酶活性不受影响；在碱性条件下，溶菌酶的热稳定性较差，易变性。
糖和聚烯烃类能增加溶菌酶的热稳定牲。
但是，曾发现具有-COOH和-SH、OH基的多糖对溶菌酶活性有抑制作用。
NaCl对溶菌酶也有抗热变性作用，溶菌酶的活性在低盐浓度时和离子强度密切相关的，在高盐浓度时溶菌酶的活性受到抑制。
除此之外，溶菌酶可和许多物质形成络合物导致其活性丧失。
重组蛋白在大肠杆菌分泌表达的研究进展
天津药学ＴｉａｎｊｉｎＰｈａｒｍａｃｙ２００９年第２１卷第４期综述重组蛋白在大肠杆菌分泌表达的研究进展’郑海洲，刘晓志，宋欣（华北制药集团新药研究开发有限责任公司，石家庄０５００１５）摘要长期以来，大肠杆菌是表达外源蛋白的首选表达系统，重组蛋白分泌表达与胞内表达相比有很大优越性，在细胞周质腔不仅能促进重组蛋白二硫键的形成及正确折叠，还能促进分泌蛋白的Ｎ一端加工。
本文综述了近年来在大肠杆菌中表达可溶性外源蛋白的进展，目的是为了提高外源蛋白的生物活性。
关键词大肠杆菌，分泌表达，重组蛋白中图分类号：Ｑ５９１．２文献标识码：Ａ文章编号：１００６－５６８７（２００９）０４－００４０－０３ＡｄｖａｎｃｅｉｎｔｈｅｓｅｃｒｅｔｏｒｙｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔｐｒｏｔｅｉｎｉｎｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｉｌＺｈｅｎｇＨａｉｚｈｏｕ，“ｕＸｉａｏｚｈｉ，Ｓ０ｎｇＸｉｎ（ＮＣＰＣＮｅｗＤｒｕｇＲｅｓｅａｒｃｈａｎｄＤｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔＣｏ．，Ｌｔｄ，Ｓｈｉｊｉａｚｈｕａｎｇ０５００１５）ＡＢＳＴＲＡＣＴＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉｉｓｏｎｅｏｆｔｈｅｍｏｓｔｗｉｄｅｌｙｕｓｅｄｈｏｓｔｓｆｏｒｔｈｅｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎｏｆｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔｐｒｏｔｅｉｎｓ．Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎｏｆ８ｅｃｒｅ—ｔｏｒｙｐｒｏｔｅｉｎｓｉｎｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉｐｒｏｖｉｄｅｓｓｅｖｅｒａｌａｄｖａｎｔａｇｅｓｏｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｉｎｔｈｅｃｙｔｏｐｌａｓｍ．Ｐｅｒｉｐｌａｓｍｐｒｏｖｉｄｅｓｔｈｅｏｘｉｄａｔｉｖｅｅｎ—ｖｉｒｏｎｍｅｎｔｔｏｆａｃｉｌｉｔａｔｅｃｏｒｒｅｃｔｄｉｓｕｌｆｉｄｅｂｏｎｄｉｎｇａｎｄｐｒｏｔｅｉｎｆｏｌｄｉｎｇ．ＩｔａｌｓｏａｌｌｏｗｓｃｏｒｒｅｃｔｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇｏｆＮ—ｔｅｒｍｉｎａｌａｍｉｎｏａｃｉｄｄｕｒｉｎｇｓｅｃｒｅｔｉｏｎ．ＴｈｉｓｒｅｖｉｅｗｄｉｓｃｕｓｓｅｓｒｅｃｅｎｔａｄｖａｎｃｅｓｉｎｓｅｃｒｅｔｏｒｙａｎｄｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎｏｆｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔｐｒｏｔｅｉｎｓＳＯａｓｔｏｉｍｐｒｏｖｅｔｈｅｂｉｏｌｏｇｉｃａｌａｃｔｉｖｉｔｙｏｆｔｈｅｈｅｔｅｍｌｏｇｏｕｓｐｒｏｔｅｉｎｓ．ＫＥＹＷＯＲＤＳｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ，ｓｅｃｒｅｔｏｒｙｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ，ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔｐｒｏｔｅｉｎ大肠杆菌具有遗传背景清楚、繁殖快、成本低、表达量高、表达产物容易纯化等优点，是基因表达技术中发展最早和目前应用最广泛的是经典表达系统…。
实验七 外源基因在大肠杆菌中的诱导表达
大肠杆菌包涵体的分离与蛋白质纯化
1 细菌的裂解： 常用方法有：① 高温珠磨法；② 高压匀浆；③ 超声破碎法； ④ 酶溶法；⑤ 化学渗透等。前三种方法属机械破碎法，并且方 法① 、② 已在工业生产中得到应用，后三种方法在实验室研究 中应用较为广泛。 下面介绍酶溶法和超声破碎法的实验步骤。
1、酶溶法。常用的溶解酶有溶菌酶；β-1,3 -葡聚糖酶；β-1,6 -葡聚糖酶；蛋白酶；壳 多糖酶；糖昔酶等。溶菌酶主要对细菌类有作用，而其他几种酶对酵母作用显著。 主要步骤为： ① 4 ℃ ，5000rpm 离心，15 min ，收集诱导表达的细菌培养液（100 mL ）。弃 上清，约每克湿菌加3 mL 裂解缓冲液，悬浮沉淀。 ② 每克菌加8μL PMSF 及80μL 溶菌酶，搅拌20 min ；边搅拌边每克菌加4 mg 脱 氧胆酸（在冷室中进行）。 ③ 37 ℃ ，玻棒搅拌，溶液变得粘稠时加每克菌20μL DNase I。室温放置至溶液不 再粘稠。 2、超声破碎法。声频为15-20 kHz 的超声波在高强度声能输入下可以进行细胞破碎， 在处理少量样品时操作简便，液体量损失较少，同时还可对染色体DNA 进行剪切 ，大大降低液体的粘稠度。 ① 收集1 L 诱导表达的工程菌，40 ℃ ，5000r pm 离心，15 min ；弃上清，约每 克湿菌加3 mLTE 缓冲液。 ② 按超声处理仪厂家提供的功能参数进行破菌；10 000g 离心，15min ，分别收集 上清液和沉淀。 ③ 分别取少量上清和沉淀，加入等体积的2× 凝胶电泳加样缓冲液，进行SDS PAGE 。 注意事项：超声破碎与声频、声能、处理时间、细胞浓度、菌种类型等因素有关， 应根据具体情况掌握；超声波破菌前，标本经3 -4 次冻溶后更容易破碎。
实验七 外源基因在大肠杆菌中的诱导表达
中国生物工程杂志China Biotechnology, 2005, 25(10)78～82
中国生物工程杂志China Biotechnology, 2005, 25(10):78～82噬菌体溶壁酶研究进展叶道成朱成钢*史锋（浙江大学生命科学学院浙江大学生物化学研究所杭州310029）摘要溶壁酶是噬菌体在感染末期表达的蛋白质，可水解细菌的细胞壁，使子代噬菌体释放出来。
研究表明，溶壁酶在体外能高效地杀死细菌，同样对感染细菌的模型动物有很好的治疗作用。
因此，溶壁酶是一种新型的抗菌物质，具有广阔的应用前景。
溶壁酶通过水解细菌细胞壁肽聚糖上糖与肽间的酰胺键或肽内氨基酸残基间的连键，从而使细菌裂解。
溶壁酶分子由结合功能域和催化功能域两部分组成，其晶体结构使之具有对细胞壁肽聚糖水解的高效性和特异性。
对噬菌体溶壁酶的体内外抗菌作用、抗菌机理、晶体结构等最新研究成果及其应用前景进行了综述。
关键词噬菌体溶壁酶细菌收稿日期：20050404修回日期：20050620* 通讯作者，电子信箱：cgzhu@噬菌体是一种细菌病毒，于1917年被发现，可分为温和性和烈性噬菌体两大类。
噬菌体寄生于细菌中，并在细菌中复制。
在感染细菌的后期，噬菌体表达出溶壁酶(Lysin 或Endolysin，或称为溶素)，水解细菌的细胞壁，从而释放出子代噬菌体，用于感染其它细菌。
虽然早就知道噬菌体溶壁酶的存在以及它具有裂解细菌的作用，但人们对噬菌体Lysin的抗菌效果及其应用前景并没有给予关注。
自然界中，几乎所有的细菌都有相应的噬菌体。
既然溶壁酶具有水解细菌细胞壁的作用，那么我们就可以研发噬菌体溶壁酶作为一种新型的抗菌药物。
1溶壁酶的体外抗菌作用现有的实验表明，溶壁酶在体外对细菌有高效的杀灭作用。
使人致病的链球菌主要是A族链球菌，它的感染可引起咽喉炎，猩红热，败血症，中毒性中风综合症，风湿热等。
用抗生素治疗，有35%的病人不能根除A族链球菌,并能诱导链球菌产生耐药性。
从宿主为C族链球菌的噬菌体C1株细菌裂解液中纯化出溶壁酶C1的分子量约为50kDa,并以二聚体形式存在［1］。
浅谈溶菌酶的研究进展
期引言英国细菌学家弗莱明最早在人体的唾液、眼泪等分泌物中发现了溶菌酶，因为它能溶解细菌，故称为溶菌酶，它的作用机制是破坏细菌细胞壁肽聚糖层的N-乙酰胞壁酸和N-乙酰氨基葡糖之间的β-1，4糖苷键，使细胞壁破裂，使细菌溶解。
溶菌酶作为安全的抑菌剂已被应用于食品加工、疾病治疗等方面，需求量大，所以利用生物技术大量生产迫在眉睫。
此外，关于“淀粉样纤维”形成基于溶菌酶的研究较为热门，因此本文将从这两方面进行叙述。
1溶菌酶的结构及其与病理学相关的研究溶菌酶是蛋白质，具有高级结构，依靠疏水作用、氢键等次级键折叠形成一定的构象，发挥特殊功能。
目前，人类最了解的溶菌酶是鸡蛋清溶菌酶(HEWL)，它包含一条肽链，129个氨基酸。
4对半胱氨酸残基间形成4个二硫键，具有大量的α螺旋结构。
HEWL在体外一定条件的诱导下可以形成“淀粉样纤维”，研究人员发现PH值较低时，蛋白质逐渐去折叠，随着去折叠蛋白质浓度的增大，蛋白质之间的疏水作用加大，逐渐出现“淀粉样纤维”，具有成核效应。
另外在蛋白质变性剂的存在下，溶菌酶的二级结构发生变化，可能出现“淀粉样纤维”，但是不同浓度的变性剂对“淀粉样纤维”的作用也不同，研究还有待深入。
陕西理工大学白瑜博士利用溶菌酶与朊蛋白结构上的相似性来研究淀粉样纤维的形成机制，为神经退行性疾病的研究带来福音[1]。
溶菌酶是一种小分子碱性蛋白，材料易取，一直被作为一种模型体系，用于研究蛋白质的空间构象、酶动力学及其与分子进化、分子免疫间的关系。
为优化食品加工过程、提高食品质量提供理论指导，并为神经系统等疾病建立了相关蛋白质模型。
目前有研究人员利用溶菌酶为模型研究盐浓度对蛋白质聚集的影响，对人类疾病的研究具有重要意义。
2基因工程载体表达溶菌酶的新进展溶菌酶的用处广泛，但直接从生物体内提纯效率低，所以其基因的重组和表达也成为研究热点。
鸡溶菌酶的外显子及内含子序列已经确定，人的溶菌酶基因也逐渐被解析清楚，为重组表达载体的构建和优化提供契机。
溶菌酶的研究进展及应用
溶菌酶的研究进展及应用朱元镇;刘婧仪;于常红【期刊名称】《山东医学高等专科学校学报》【年(卷),期】2018(040)003【总页数】4页(P207-210)【关键词】溶菌酶;作用机制;改良方法【作者】朱元镇;刘婧仪;于常红【作者单位】青岛大学,山东青岛266071;青岛大学,山东青岛266071;青岛大学,山东青岛266071【正文语种】中文溶菌酶(Lysozyme)又称胞壁质酶(Muramidase), 广泛存在于自然界，具有抗细菌、真菌及肿瘤等多种药理作用，具有生物相容性好对组织无刺激性、无毒性的特点，已被制作为一种性质优良杀伤病原微生物而不破坏机体的酶制剂。
根据其分子结构和来源的不同分为6类：植物溶菌酶、微生物溶菌酶、噬菌体溶菌酶(主要为T4噬菌体)、C型(蛋清溶菌酶、胃溶菌酶等)、G型(鹅型溶菌酶)和I型(无脊椎动物溶菌酶)，其中C、G型和噬菌体溶菌酶最常见。
溶菌酶化学性质稳定，商品化主要为蛋清溶菌酶，仅对革兰氏阳性菌有抑制作用，为此国内外一直致力于开发改良新型溶菌酶。
本文就溶菌酶的作用机制、目前的改良开发及应用情况进行综述。
1 溶菌酶的作用机制1.1 抗细菌作用溶菌酶是存在于动物体液及组织中的固有免疫因子，通过破坏细菌细胞壁激活细菌自溶蛋白，使膜通透性增大导致细菌裂解死亡，其机制如下：N-乙酰己糖胺酶水解细菌细胞壁肽聚糖的β-1,4糖苷键；酰胺酶水解细菌细胞壁内N-乙酰葡糖胺与肽桥之间的连接—N-乙酰葡糖胺-L-丙氨酸键及内肽酶水解细菌细胞壁肽桥内的肽键。
蛋清溶菌酶是目前研究最为透彻的一种溶菌酶。
通过X-射线衍射得到的晶体学数据，Phillips等最先提出蛋清溶菌酶催化糖苷键断裂的能力来自静电稳定的碳正离子中间体及空间位阻效应，酶的活性位点与糖结合使其变构成半椅型构象，使糖苷键容易断裂；之后Vocadlo等又发现酶结构中Glu35对于维持酶的活性至关重要，Glu35作为糖苷键的质子供体，切割底物碳氧单键，通过Asp52形成糖基酶中间体，随后Glu35与水反应形成的氢氧根攻击糖基酶中间体，水解生成产物，而酶保持不变。
溶菌酶实验报告
溶菌酶实验报告溶菌酶实验报告引言：溶菌酶是一种广泛存在于自然界中的酶类物质，具有溶解细菌细胞壁的能力。
它在免疫系统中起着重要的作用，可以破坏细菌细胞壁，使得细菌失去保护，从而被免疫系统清除。
本次实验旨在研究溶菌酶的活性以及其对细菌的溶解能力。
材料与方法：1. 细菌培养基：含有适量营养物质的培养基，用于细菌的培养。
2. 细菌培养物：选择一种常见的细菌，如大肠杆菌。
3. 溶菌酶溶液：从可靠渠道购买到的高纯度溶菌酶。
4. 试管：用于混合反应物。
5. 恒温水浴：用于控制反应温度。
6. 分光光度计：用于测量溶菌酶的活性。
实验步骤：1. 取一定量的细菌培养物，接种到培养基中，将培养瓶置于恒温水浴中，培养一定时间，使得细菌充分繁殖。
2. 取适量的培养物，通过离心机离心，将细菌沉淀下来。
3. 将细菌沉淀洗涤至无营养基残留，再次用培养基悬浮细菌，制备一定浓度的细菌悬浮液。
4. 取若干试管，分别加入不同浓度的溶菌酶溶液，同时加入相同体积的细菌悬浮液。
5. 将试管置于恒温水浴中，控制反应温度，反应一定时间。
6. 反应结束后，用分光光度计测量各试管中的溶菌酶活性。
结果与讨论：根据实验结果，我们可以得到不同浓度溶菌酶对细菌的溶解能力。
通过测量各试管中的溶菌酶活性，我们可以得到一个活性曲线，了解溶菌酶的活性与浓度的关系。
实验结果显示，溶菌酶的活性随着浓度的增加而增加，但当浓度达到一定程度后，活性趋于饱和，进一步增加浓度不会显著提高溶解能力。
在本次实验中，我们使用了大肠杆菌作为细菌模型。
大肠杆菌是一种常见的肠道细菌，其细胞壁主要由脂多糖组成。
溶菌酶作用于细菌细胞壁的脂多糖结构，破坏其完整性，导致细菌溶解。
因此，通过实验我们可以验证溶菌酶对大肠杆菌的溶解能力。
溶菌酶的活性受到多种因素的影响，如pH值、温度等。
在实验中，我们通过控制反应温度，使得溶菌酶能够在最适合的温度下发挥最大的活性。
此外，我们还可以通过调整溶菌酶的酸碱度，探究其对活性的影响。
外源基因在大肠杆菌中表达简略实验步骤
外源基因在大肠杆菌中表达简略实验步骤(总3页)--本页仅作为文档封面，使用时请直接删除即可----内页可以根据需求调整合适字体及大小--目的基因在大肠杆菌中的诱导表达一般程序如下：获得目的基因－准备表达载体－将目的基因插入表达载体中（测序验证）－转化表达宿主菌－诱导靶蛋白的表达－表达蛋白的分析－扩增、纯化、进一步检测。
[主要试剂]1、LB培养基。
2、100mM IPTG（异丙基硫代-β-D-半乳糖苷）： IPTG溶于100ml ddH2O 中,μm滤膜抽滤，-20℃保存。
[操作步骤]1、通过PCR方法获得目的基因：以含目的基因的克隆质粒为模板，按基因序列设计一对引物（在上游和下游引物分别引入不同的酶切位点，本实验中为BamHⅠ和HiindⅢ），PCR循环获得所需基因片段。
PCR反应体系为：PCR反应条件为：94℃变性3min；94℃变性3min、52℃复性40sec、72℃延伸1min，30个循环；最后72℃延伸8min。
2、构建重组表达载体（1）载体酶切：将表达质粒pRSETA用限制性内切酶（同引物的酶切位点）进行双酶切，酶切产物行琼脂糖电泳后，用凝胶回收Kit或冻融法回收载体大片段。
（2）R基因PCR产物双酶切后回收，在T4 DNA连接酶作用下连接入载体。
连接反应体系为：3、获得含重组表达质粒的表达菌种（1）将连接产物转化大肠杆菌DH5α，根据重组载体的标志（抗Amp）作筛选，挑取单斑，碱裂解法小量抽提质粒，双酶切初步鉴定。
（2）测序验证目的基因的插入方向及阅读框架均正确,进入下步操作。
否则应筛选更多克隆，重复亚克隆或亚克隆至不同酶切位点。
（3）以此重组质粒DNA转化表达宿主菌BL21（DE3）的感受态细胞。
4、诱导表达1、挑取含重组质粒的菌体单斑至2ml LB（含Amp50μg/ml）中37℃过夜培养。
2、按1∶100比例稀释过夜菌，一般将1ml菌加入到含100mlLB培养基的300ml培养瓶中, 37℃震荡培养至OD600≌（最好，大约需3hr）。
溶菌酶的研究及应用简介
溶菌酶的研究及应用简介摘要溶菌酶（lysozyme）是一种专门作用于微生物细胞壁的水解酶，又称胞壁质酶（muramidase）。
人们对溶菌酶的研究始于20 世纪初，英国细菌学家Fleming在发现青霉素的前6年（1922年）发现人的唾液、眼泪中存在能溶解细菌细胞壁的酶，因其具有溶菌作用，故命名为溶菌酶，其中鸡蛋溶菌酶的研究和应用已相当深入和广泛［1］。
通过对它的结构、性质、来源的研究；溶菌酶已广泛的应用于医药、生物工程和食品工业等多个方面。
关键词溶菌酶；结构；应用；研究进展溶菌酶（Lysozymc EC3.2.1.17）又名胞壁质酶（muramidase）、乙酞胞壁酸聚糖水解酶（N-acctylmuramide glyca-nohydrolase）,广泛地分布于自然界[2]。
在病毒（如噬菌体T4）、细菌（如枯草杆菌）、植物（如番木瓜）、动物（如鼠、狗）及人体都含有。
人体多数组织器官含有一定浓度的溶菌酶。
但以脾、肾含量较高。
在鼻及支气管分泌液、泪液、脑脊液、唾液、乳汁及血液中均含有一定量的溶菌酶。
此酶自被发现以来,经科学家们不断地研究,使得它在酶学及临床医学中均占有一定的重要位置，也将其应用于医疗、食品、畜牧及生物工程中。
1 溶菌酶的发现1907年Nicollc[2]猜测芽胞杆菌（Bacillus）及枯草杆菌中含有溶解细菌的酶。
1909年schtchenko[3]第一个报道了鸡蛋清含有溶解细菌的酶。
1922年Alexander Fleming[2]发现鼻粘液里有一种能溶解微球菌（micrococcus lysodeikticus）及其他细菌的酶，他把这种酶命名为溶菌酶（lysozyme）。
经过仔细的观察和研究，他发现此酶广泛地存在于生物组织及机体的某些分泌物中。
之后Robert及Wolff 也从鸡蛋清里提取出溶菌酶。
1937~1946年间Abraham[3]，Robinson, Alderson及Fevold等人通过实验从而分别获得了溶菌酶的结晶。
溶菌酶裂解大肠杆菌冰上孵育目的
文章标题：探究溶菌酶裂解大肠杆菌冰上孵育的目的及意义在细菌学研究领域中，溶菌酶裂解大肠杆菌冰上孵育一直是一项备受关注的实验方法。
本文将从多个角度对此进行深入探讨，包括实验方法、目的和意义等方面。
一、实验方法让我们来了解一下溶菌酶裂解大肠杆菌冰上孵育的实验方法。
这种方法通常包括以下步骤：1. 准备大肠杆菌样品，并将其裂解；2. 将裂解后的样品置于冰上孵育一段时间；3. 进行后续的实验操作，如制备DNA、蛋白质或其他生物分子。
二、目的和意义接下来，我们将重点探讨溶菌酶裂解大肠杆菌冰上孵育的目的和意义。
1. 目的我们来看一下这一实验方法的主要目的。
溶菌酶是一种能够裂解细菌细胞壁的酶类物质，因此裂解后的大肠杆菌会释放出其内部的生物分子，如DNA、蛋白质等。
而将其置于冰上孵育，则可以帮助分离这些生物分子，使其更易于提取和利用。
该实验方法的主要目的是帮助研究人员获得大肠杆菌内部生物分子的样品。
2. 意义对于溶菌酶裂解大肠杆菌冰上孵育的意义，我们需要从实验结果和应用价值两个方面来进行分析。
通过这一实验方法，研究人员能够获得高质量的DNA、蛋白质等生物分子样品，为后续的实验和研究提供了重要的基础。
这些样品的获取对于生物医学、生物工程等领域的研究具有重要的应用价值，可以帮助人们更深入地了解细胞内部的结构和功能，进而为相关疾病的治疗和预防提供理论和实践支持。
三、个人观点和理解就我个人而言，我认为溶菌酶裂解大肠杆菌冰上孵育的实验方法，是一项非常重要且有价值的研究工具。
通过这一方法，我们可以不仅可以获得大肠杆菌内部生物分子的样品，还可以为细菌学和生物医学领域的研究提供重要的支持。
对于我来说，深入了解这一实验方法的原理和意义，将有助于我更好地把握其在科学研究和工程应用中的潜在价值。
总结溶菌酶裂解大肠杆菌冰上孵育的目的和意义是多方面的，既有理论上的科学研究价值，又有实际上的生物医学和生物工程应用意义。
通过深入了解这一实验方法，我们可以更好地认识到其在细菌学研究领域的重要性，为我们的科学研究和工程应用提供更加全面、深刻和灵活的支持。
大肠杆菌表达原理(很好)
E.Coli （CE6）
T7 启动子
目的基因
热诱导
T7 RNA 聚合酶
PL 启动子 T7 RNA 聚合酶基因
cI857
T7 表达系统
转录调控的机理 双质粒系统 一个质粒带有 T7 RNA 聚合酶 基因，另一个质粒带有 T7 启 动子和目的基因
对宿主菌的要求
用溶源化 l 噬菌体的大肠杆菌作 PL、PR 启动子表达载体的宿主菌
N4830-1，POP2136 等菌株已经溶源化 cI 857(ts) l 噬菌体， 可用作表达外源基因时的宿主菌。 把 cI 857(ts) 基因组装在表达载体上 宿主菌选择范围更大
PL 和 PR 表达系统存在的问题
外源基因在大肠杆菌中的表达
外源基因在大肠杆菌中的表达
大肠杆菌作为表达外源基因受体菌的特征
大肠杆菌表达外源基因的优势 全基因组测序，共有4405个开放型阅读框架 基因克隆表达系统成熟完善 繁殖迅速、培养简单、操作方便、遗传稳定 被美国FDA批准为安全的基因工程受体生物
外源基因在大肠杆菌中的表达
大肠杆菌作为表达外源基因受体菌的特征
整合到染色体后，均能使 lac 和 tac 启动子的转录受到温度严紧调控 在较低温度（30℃）时抑制，在较高温度（42℃）时开放。
用乳糖替代 IPTG 诱导 lac 和 tac 启动子的转录 乳糖在 b-半乳糖苷酶作用下生成异乳糖，异乳糖具有诱导剂的作用 这一过程涉及乳糖的转运和转化，其效率受到多种因素的影响和制约 因此乳糖诱导的有效剂量大大高于IPTG。 乳糖本身作为一种碳源可以被大肠杆菌代谢利用，较多的乳糖存在也 会导致菌体生理及生长特性变化。乳糖替代 lPTG 作为诱导剂的研究 要与发酵工艺结合起来，才能显示其良好的前景。