分子生物学检测.
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福州艾迪康
PCR实验室 介绍
陈衍娇
聚合酶链反应(PCR)技术
PCR发展简史
PCR基本概述 PCR基本原理
PCR发展简史
1985 年，美国 PE-Cetus 公司的 Mullis 等人发明了
聚合酶链反应（PCR）
1993 年 ， Higuchi 等 报 道 了 实 时 PCR(real-
timePCR)
PCR基本概述
聚合酶链反应(Polymerase Chain Reaction) 简称ＰＣＲ，是一项在短时间内大量扩增特定的 ＤＮＡ片段的分子生物学技术。
PCR基本原理
PCR扩增基本要素
PCR扩增过程
PCR扩增基本要素
DNA模板 DNA引物 TaqDNA聚合酶 dNTP 缓冲液 Mg2+
供体荧光基团
受体荧光基团
5’ 3’
3’
5’
3’ 5’
靶DNA
5’ 3’ 靶DNA
3’ 5’
实时荧光定量PCR工作流程
标本的采集 标本的运送
标本的处理
基因扩增 扩增产物分析
标本的采集
标本采集时间对扩增检测结果的影响 标本采集部位的准备
标本采集的类型和采集量
采样质量的评价 采样及运输容器 标本采集中的防污染
1）低危型：宫颈上皮内低度病变，引起外生殖器湿疣等良性性病（HPV 6、11、42等） 2）高危型：宫颈上皮内高度病变，与宫颈癌的发生有关（HPV 16、 18、 31、33、35、39 、45、51、52、53、56、58、59、66及 68等）
分布
有些亚型和地区、宫颈癌的病理类型有关。 HPV45在非洲西部很常见，HPV39和59在美洲中部和南部常见，HPV52， 58 在中国常见。在宫颈鳞状上皮细胞癌中以HPV16（占51％），在腺癌 和腺鳞癌中HPV18分别占56％和39％。
PCR实验室设置
试剂准备区(Ⅰ区 )
标本处理区( Ⅱ区 ) 扩增分析区( Ⅲ区 )
产物分析区( Ⅳ区 )
实时荧光定量PCR的应用 我们福州PCR主要检测项目
1.乙型肝炎病毒DNA(HBV-DNA)
2 .人乳头瘤病毒HPV23型、人乳头瘤病毒 6/11、人乳头瘤病毒16/18 3.沙眼衣原体DNA、解脲支原体DNA、淋球 菌DNA 4.丙型肝炎RNA
乙肝病毒结构图
乙型肝炎病毒基因区
S区
C区 P区 X区
乙型肝炎病毒临床意义
判断肝病的病情、预后和传染性
预测抗病毒治疗的效果 监测和评价抗病毒药物的疗效
乙型肝炎病毒YMDD变异
YMDD: 蛋氨酸
YIDD 突变：蛋氨酸
YVDD突变：蛋氨酸
异亮氨酸
缬氨酸
人乳头瘤病毒（HPV）PCR检测
人乳头瘤病毒的致癌机理
HPV的基因结构
人乳头瘤病毒 HPV 的基因结构按功能可分为早期区 （E区）、晚期区（L区）和非编码区（LCR）三个区域
HPV的致癌机理
人乳头瘤病毒检测的临床意义
低危型
1）预防和提示外生殖器湿疣等良性性病。 2）可用于临床可疑尖锐湿疣患者的确诊，及HPV感 染的早期诊断。
人乳头瘤病毒的概述 人乳头瘤病毒的型别与分布 人乳头瘤的致癌机理 人乳头瘤病毒检测的临床意义 人乳头瘤病毒感染与宫颈癌的关系 理想的宫颈癌筛查
人乳头瘤病毒的概述
双链DNA无包膜病毒
环状DNA，约8Kb； 病毒颗粒直径为50～55nm； 依靠宿主细胞进行复制、转录和翻译。
游离在细胞内，持续存在，不引起任何病变，或引
HPV病毒电镜图
起良性病变和低度病变，如尖锐湿疣或轻度不典型增生 等。而癌变则与病毒DNA整合入染色体密切相关。HPV 感染是否发病取决于被感染的细胞是否进行成熟分化。
人乳头瘤的型别与分布
型别
已发现100多种不同的亚型，其中超过40种可以感染人类的生殖器官，约30 种与肿瘤有关。
依据不同型别HPV与肿瘤发生的危险性高低可分
乙型肝炎病毒(HBV)PCR检测
乙型肝炎病毒(HBV)概述
乙型肝炎病毒基因区 乙型肝炎病毒临床意义 乙型肝炎病毒变异检测
乙型肝炎病毒(HBV)概述
乙肝病毒是已知最小的部 分双链的环形DNA病毒，长 3.2kb，有高度重叠的4个基因 区，编码至少8种蛋白。即S基 因编码的大、中、小HBs；C 基因的前C、HBc、HBe；P基 因的聚合酶和X基因的HBx。
PCR扩增参数
温度与时间参数
（1）变性温度与时间 （2）退火温度与时间 （3）延伸温度与时间
循环次数
PCR基本扩增过程
实时定量荧光PCR技术
实时荧光PCR基本原理
Taqman实时荧光PCR基本原理
双杂交探针实时荧光PCR基本原理
Taqman实时荧光PCR基本原理
靶DNA
高危型
1）女性常规体检，评估宫颈癌发生的可能性。 2）跟进宫颈癌的疗效，评估宫颈癌复发的可能性。
人乳头瘤病毒和宫颈癌的关系
早在十九世纪四十年代，一位意大利医生Regoni Stern最早提出结婚与否与宫颈癌的发生可能有关。 1977年Laverty在电镜中源自文库察到宫颈癌活检组织中存在 人乳头状瘤病毒（Human papillomavirus，HPV）颗粒。 至89年左右，约翰.霍普金斯大学教授Keerti Shah证 实子宫颈癌与HPV感染有直接关系。 1995 年世界卫生组织国际癌症研究所（ IARC）专题讨 论会认为：HPV感染是宫颈癌发生的主要病因。
理想的宫颈癌筛查
临床提示，从HPV的持续感染到一般的宫颈癌前病变 并最终发展为宫颈癌大约需要 5-10 年。因此，必须采取 适当的预防和筛查措施，才能够阻止宫颈癌的发生并有 望最终根治。
美国肿瘤临床指导：性行为开始三年左右，不晚于21岁开始。
每年筛一次。若2～3次HPV和细胞学筛查均为正常者，可延长筛查时 间至5-8年。大于 70 岁，在10 年内已有 3 次以上满意的细胞学检查和 HPV检查正常者，可停止筛查。良性子宫切除患者不需要检查，否则， 连续3年检查，可终止。
PCR过程中,TaqMan探针 和引物与靶序列退火
5’ 淬灭剂
TaqMa n 探针
3’ 报告 荧光 靶DNA 引物
引物在Taq酶的聚合延伸下, 其5’外切酶活性将水解探针, 从而使荧光基团脱离淬灭剂 的作用而发出荧光
5’ 3’ 淬灭剂
3’ 引物 5’ 报告 荧光
TaqMa n 探针
双杂交探针实时荧光PCR基本原理
PCR实验室 介绍
陈衍娇
聚合酶链反应(PCR)技术
PCR发展简史
PCR基本概述 PCR基本原理
PCR发展简史
1985 年，美国 PE-Cetus 公司的 Mullis 等人发明了
聚合酶链反应（PCR）
1993 年 ， Higuchi 等 报 道 了 实 时 PCR(real-
timePCR)
PCR基本概述
聚合酶链反应(Polymerase Chain Reaction) 简称ＰＣＲ，是一项在短时间内大量扩增特定的 ＤＮＡ片段的分子生物学技术。
PCR基本原理
PCR扩增基本要素
PCR扩增过程
PCR扩增基本要素
DNA模板 DNA引物 TaqDNA聚合酶 dNTP 缓冲液 Mg2+
供体荧光基团
受体荧光基团
5’ 3’
3’
5’
3’ 5’
靶DNA
5’ 3’ 靶DNA
3’ 5’
实时荧光定量PCR工作流程
标本的采集 标本的运送
标本的处理
基因扩增 扩增产物分析
标本的采集
标本采集时间对扩增检测结果的影响 标本采集部位的准备
标本采集的类型和采集量
采样质量的评价 采样及运输容器 标本采集中的防污染
1）低危型：宫颈上皮内低度病变，引起外生殖器湿疣等良性性病（HPV 6、11、42等） 2）高危型：宫颈上皮内高度病变，与宫颈癌的发生有关（HPV 16、 18、 31、33、35、39 、45、51、52、53、56、58、59、66及 68等）
分布
有些亚型和地区、宫颈癌的病理类型有关。 HPV45在非洲西部很常见，HPV39和59在美洲中部和南部常见，HPV52， 58 在中国常见。在宫颈鳞状上皮细胞癌中以HPV16（占51％），在腺癌 和腺鳞癌中HPV18分别占56％和39％。
PCR实验室设置
试剂准备区(Ⅰ区 )
标本处理区( Ⅱ区 ) 扩增分析区( Ⅲ区 )
产物分析区( Ⅳ区 )
实时荧光定量PCR的应用 我们福州PCR主要检测项目
1.乙型肝炎病毒DNA(HBV-DNA)
2 .人乳头瘤病毒HPV23型、人乳头瘤病毒 6/11、人乳头瘤病毒16/18 3.沙眼衣原体DNA、解脲支原体DNA、淋球 菌DNA 4.丙型肝炎RNA
乙肝病毒结构图
乙型肝炎病毒基因区
S区
C区 P区 X区
乙型肝炎病毒临床意义
判断肝病的病情、预后和传染性
预测抗病毒治疗的效果 监测和评价抗病毒药物的疗效
乙型肝炎病毒YMDD变异
YMDD: 蛋氨酸
YIDD 突变：蛋氨酸
YVDD突变：蛋氨酸
异亮氨酸
缬氨酸
人乳头瘤病毒（HPV）PCR检测
人乳头瘤病毒的致癌机理
HPV的基因结构
人乳头瘤病毒 HPV 的基因结构按功能可分为早期区 （E区）、晚期区（L区）和非编码区（LCR）三个区域
HPV的致癌机理
人乳头瘤病毒检测的临床意义
低危型
1）预防和提示外生殖器湿疣等良性性病。 2）可用于临床可疑尖锐湿疣患者的确诊，及HPV感 染的早期诊断。
人乳头瘤病毒的概述 人乳头瘤病毒的型别与分布 人乳头瘤的致癌机理 人乳头瘤病毒检测的临床意义 人乳头瘤病毒感染与宫颈癌的关系 理想的宫颈癌筛查
人乳头瘤病毒的概述
双链DNA无包膜病毒
环状DNA，约8Kb； 病毒颗粒直径为50～55nm； 依靠宿主细胞进行复制、转录和翻译。
游离在细胞内，持续存在，不引起任何病变，或引
HPV病毒电镜图
起良性病变和低度病变，如尖锐湿疣或轻度不典型增生 等。而癌变则与病毒DNA整合入染色体密切相关。HPV 感染是否发病取决于被感染的细胞是否进行成熟分化。
人乳头瘤的型别与分布
型别
已发现100多种不同的亚型，其中超过40种可以感染人类的生殖器官，约30 种与肿瘤有关。
依据不同型别HPV与肿瘤发生的危险性高低可分
乙型肝炎病毒(HBV)PCR检测
乙型肝炎病毒(HBV)概述
乙型肝炎病毒基因区 乙型肝炎病毒临床意义 乙型肝炎病毒变异检测
乙型肝炎病毒(HBV)概述
乙肝病毒是已知最小的部 分双链的环形DNA病毒，长 3.2kb，有高度重叠的4个基因 区，编码至少8种蛋白。即S基 因编码的大、中、小HBs；C 基因的前C、HBc、HBe；P基 因的聚合酶和X基因的HBx。
PCR扩增参数
温度与时间参数
（1）变性温度与时间 （2）退火温度与时间 （3）延伸温度与时间
循环次数
PCR基本扩增过程
实时定量荧光PCR技术
实时荧光PCR基本原理
Taqman实时荧光PCR基本原理
双杂交探针实时荧光PCR基本原理
Taqman实时荧光PCR基本原理
靶DNA
高危型
1）女性常规体检，评估宫颈癌发生的可能性。 2）跟进宫颈癌的疗效，评估宫颈癌复发的可能性。
人乳头瘤病毒和宫颈癌的关系
早在十九世纪四十年代，一位意大利医生Regoni Stern最早提出结婚与否与宫颈癌的发生可能有关。 1977年Laverty在电镜中源自文库察到宫颈癌活检组织中存在 人乳头状瘤病毒（Human papillomavirus，HPV）颗粒。 至89年左右，约翰.霍普金斯大学教授Keerti Shah证 实子宫颈癌与HPV感染有直接关系。 1995 年世界卫生组织国际癌症研究所（ IARC）专题讨 论会认为：HPV感染是宫颈癌发生的主要病因。
理想的宫颈癌筛查
临床提示，从HPV的持续感染到一般的宫颈癌前病变 并最终发展为宫颈癌大约需要 5-10 年。因此，必须采取 适当的预防和筛查措施，才能够阻止宫颈癌的发生并有 望最终根治。
美国肿瘤临床指导：性行为开始三年左右，不晚于21岁开始。
每年筛一次。若2～3次HPV和细胞学筛查均为正常者，可延长筛查时 间至5-8年。大于 70 岁，在10 年内已有 3 次以上满意的细胞学检查和 HPV检查正常者，可停止筛查。良性子宫切除患者不需要检查，否则， 连续3年检查，可终止。
PCR过程中,TaqMan探针 和引物与靶序列退火
5’ 淬灭剂
TaqMa n 探针
3’ 报告 荧光 靶DNA 引物
引物在Taq酶的聚合延伸下, 其5’外切酶活性将水解探针, 从而使荧光基团脱离淬灭剂 的作用而发出荧光
5’ 3’ 淬灭剂
3’ 引物 5’ 报告 荧光
TaqMa n 探针
双杂交探针实时荧光PCR基本原理