毛细管电泳

上一世纪后二十年分析化学领域中发展最迅速的分离分析方法
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高效毛细管电泳（High-Performance CE）
高效毛细管电泳在技术上采取了两项重要改进： 高效毛细管电泳在技术上采取了两项重要改进： 一是采用了细内径的毛细管（ 一是采用了细内径的毛细管（ 2-75 µm ）； 二是采用了高达数千伏至数万伏的电压
毛细管电泳
Capillary Electrophoresis, CE
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1937年，Tiselius(瑞典)将蛋白 质混合液放在两段缓冲溶液之间， 两端施以电压进行自由溶液电泳， 第一次将人血清提取的蛋白质混合 液分离出白蛋白和α、β、γ球蛋 白； 发现样品的迁移速度和方向由 其电荷和淌度决定； 其电荷和淌度决定； 第一次的自由溶液电泳； 第一次的自由溶液电泳；第一 的自由溶液电泳 电泳仪； 台电泳仪； 1948年，获诺贝尔化学奖； 年 获诺贝尔化学奖；
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5 HPCE中电渗流的流型 HPCE中电渗流的流型
电荷均匀分布，整体移动，电渗流的流动为平流，塞式 流动（谱带展宽很小）； 液相色谱中的溶液流动为层流，抛物线流型，管壁处流 速为零，管中心处的速度为平均速度的2倍（引起谱带展宽 较大）。
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6 HPCE中电渗流的作用 HPCE中电渗流的作用
电渗流的速度约等于一般离子电泳速度的5～7倍； 电渗流的速度约等于一般离子电泳速度的5 各种电性离子在毛细管柱中的迁移速度为： 各种电性离子在毛细管柱中的迁移速度为：
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(3)电泳淌度 电泳淌度(Electric Field Mobility，简称µep ) 电泳淌度 带电粒子在毛细管中，作定向运动的电泳速度与所在电场强度之比。电泳淌 度的单位用cm2/V.sec表示。 Ld/tm µep = Vep /E = ─── V/Lt Vep:电泳速度 E：电场强度 Ld: 毛细管入口端至检测器长度 (4) ξ电势(Zeta Potential) 电势(Zeta 参与形成双电层被毛细管表面吸附的一层离子与溶液中的游离阳离子之间会 产生一个电势，称为毛细管壁Zeta电势。毛细管壁为高电位区，中心点为低 电位区，毛细管的半径越大电位差越大，形成的ξ电势越大。
V—外加电压；L—毛细管总长度；
(2)分离效率（塔板数） (2)分离效率（塔板数） 分离效率 在HPCE中，仅存在纵向扩散，σ2=2Dt HPCE中 仅存在纵向扩散，
n=
µapVLef
2DL
=
µapELef
2D
;
tR n = 5.54 Y 1/ 2
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扩散系数小的溶质比扩散系数大的分离效率高， 扩散系数小的溶质比扩散系数大的分离效率高，分离生 物大分子的依据。 物大分子的依据。
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7 HPCE中影响电渗流的因素 HPCE中影响电渗流的因素
(1)电场强度的影响 (1)电场强度的影响
ν电渗流 = µE=ε0εξ E
电渗流速度和电场强度成正比，当毛细管长度一定时， 电渗流速度正比于工作电压。
(2)毛细管材料的影响 (2)毛细管材料的影响
不同材料毛细管的表面电 荷特性不同，产生的电渗流大 小不同；
ν+ =ν电渗流 + ν+ef ν- =ν电渗流 - ν-ef ν0 =ν电渗流
一致； 阳离子运动方向与电渗流一致 阳离子运动方向与电渗流一致； 阴离子运动方向与电渗流相反； 阴离子运动方向与电渗流相反； 相反 中性粒子运动方向与电渗流一致； 中性粒子运动方向与电渗流一致； 一致
（1）可一次完成阳离子、阴离子、中性粒子的分离； 可一次完成阳离子、阴离子、中性粒子的分离； （2）改变电渗流的大小和方向可改变分离效率和选择性， 改变电渗流的大小和方向可改变分离效率和选择性， 如同改变LC中的流速； 如同改变LC中的流速； LC中的流速 （3）电渗流的微小变化影响结果的重现性； 电渗流的微小变化影响结果的重现性； 在HPCE中，控制电渗流非常重要。 HPCE中 控制电渗流非常重要。
ν电渗流 = ε0εξ E
实际电泳分析，可在实验测定相应参数后， 实际电泳分析，可在实验测定相应参数后，按下式计算
ν电渗流 = Lef/teo
Lef —毛细管有效长度； teo—电渗流标记物（中性物质）的迁移时间。
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一般情况下，电渗流随着电解质浓度的增加而增加，随着pH值的 上升（向碱性方向增加）而加大。在高pH值溶液中，毛细管壁的 负电荷多，吸附溶液中的正离子多，产生的电渗流大。在低pH值 溶液中，毛细管壁的负电荷少，吸附溶液中的正离子少，产生的 电渗流小。
2(t2 − t1) R= W2 +W 1
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3 HPCE中电渗流的计算 HPCE中电渗流的计算
电渗流的大小用电渗流速度ν电渗流表示，取决于电渗淌 表示， 度µ和电场强度E。即 和电场强度
ν电渗流 = µ E
电渗淌度取决于电泳介质及双电层的Zeta电势， 电渗淌度取决于电泳介质及双电层的Zeta电势，即 Zeta电势 µ =
ε0εξ
ε0—真空介电常数；ε—介电常数；ξ—毛细管壁的Zeta电势。
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(3)分离度 (3)分离度
R = 0.177⋅
µ平均
∆µ
µapVLef
DL
µ平均 =
µap1 + µap2
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影响分离度的主要因素；工作电压V 影响分离度的主要因素；工作电压V；毛细管有效长度与 总长度比；有效淌度差。分离度可按谱图直接由下式计算： 总长度比；有效淌度差。分离度可按谱图直接由下式计算：
毛细管的采用使产生的热量能够较快散发，大大减小了温度效应 ，使电场电压可以很高。 电压升高，电场推动力大，又可进一步使柱径变小，柱长增加， 高效毛细管电泳的柱效远高于高效液相色谱，理论塔板数高达几 十万块/米，特殊柱子可以达到数百万。
5、毛细管、检测器、溶液瓶
c 加入有机溶剂如甲醇、乙腈，使
电渗流增大。
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8 HPCE中的参数与关系式 HPCE中的参数与关系式
(1)迁移时间（保留时间） (1)迁移时间（保留时间） 迁移时间 HPCE兼具有电化学的特性和色谱分析的特性。 HPCE兼具有电化学的特性和色谱分析的特性。有关色谱 兼具有电化学的特性和色谱分析的特性 理论也适用。 理论也适用。 Lef Lef Lef ⋅ L t= = = νap µap ⋅ E µap ⋅V
1984年Terabe等把胶束电泳技术引入到毛细管电泳中，为今后发展新型的 毛细管电泳分离模式提供了依据。 1987年H.Jerten把等电聚焦电泳、凝胶电泳引入到毛细管电泳中。 1989年改用10-25µm的毛细管电泳,并获得满意的分离效果 1994年又推出了2－5µm的毛细管柱，使得毛细管电泳在分析领域有了很 大的发展。
在其他条件相同，浓度相同而阴离子不同时，毛细管中 的电流有较大差别，产生的焦耳热不同。 缓冲溶液离子强度，影响双电层的厚度、溶液黏度和工 作电流，明显影响电渗流大小。缓冲溶液离子强度增加，电 渗流下降。
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(4)温度的影响 (4)温度的影响
毛细管内温度的升高，使溶液的黏度下降，电渗流增大。 温度变化来自于“焦耳热”； 焦耳热：毛细管溶液中有电流通过时，产生的热量； 焦耳热 HPCE中的焦耳热与背景电解质的摩尔电导、浓度及电场强 度成正比。 温度每变化1，将引起背景电解质溶液黏度变化2%～3%；
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经典电泳分析
利用电泳现象对某些化学或生物物质进行分离分析的方 利用电泳现象对某些化学或生物物质进行分离分析的方 电泳 法和技术叫电泳法或电泳技术。 法和技术叫电泳法或电泳技术。 按形状分类：U型管电泳、柱状电泳、板电泳； 按载体分类：滤纸电泳、琼脂电泳、聚丙烯酰胺电泳、 自由电泳； 传统电泳分析：操作烦琐，分离效率低，定量困难，无 法与其他分析相比。
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(5)添加剂的影响 (5)添加剂的影响
a 加入浓度较大的中性盐，如K2SO4，溶液离子强度增大，使
溶液的黏度增大，电渗流减小。
b 加入表面活性剂，可改变电渗流
的大小和方向； 加入不同阳离子表面活性剂 来控制电渗流。 加入阴离子表面活性剂，如 十二烷基硫酸钠（SDS），可以使 壁表面负电荷增加，zeta电势增 大，电渗流增大；
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(3)电解质溶液性质的影响 (3)电解质溶液性质的影响
a 溶液pH的影响 溶液pH的影响 pH
对于石英毛细管，溶液pH增高时，表面电离多，电荷密 度增加，管壁zeta电势增大，电渗流增大，pH=7，达到最大； pH=7，达到最大 pH=7 pH<3，完全被氢离子中和，表面电中性，电渗流为零。分析 时，采用缓冲溶液来保持pH稳定。 b 阴离子的影响
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4 HPCE中电渗流的方向 HPCE中电渗流的方向
电渗流的方向取决于毛细管内表面电荷的性质： 电渗流的方向取决于毛细管内表面电荷的性质： 内表面带负电荷，溶液带正电荷，电渗流流向阴极； 内表面带负电荷，溶液带正电荷，电渗流流向阴极； 内表面带正负电荷，溶液带负电荷，电渗流流向阳极； 内表面带正负电荷，溶液带负电荷，电渗流流向阳极； 石英毛细管；带负电荷，电渗流流向阴极； 石英毛细管；带负电荷，电渗流流向阴极； 改变电渗流方向的方法： 改变电渗流方向的方法： （1）毛细管改性 表面键合阳离子基团； （2）加电渗流反转剂 内充液中加入大量的阳离子表面活性剂，将使石英毛细 管壁带正电荷，溶液表面带负电荷。电渗流流向阳极。
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毛细管电泳的原理 毛细管电泳分离模式 毛细管电泳的进样与检测 毛细管电泳的应用
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一、毛细管电泳的原理
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1 HPCE中的电渗现象与电渗流 HPCE中的电渗现象与电渗流
当固体与液体接触时，固体表面由于某种原因带一种电荷，则因静电引力使 其周围液体带有相反电荷，在液-固界面形成双电层 双电层，二者之间存在电位差。 双电层 当液体两端施加电压时，就会发生液体相对于固体表面的移动， 当液体两端施加电压时，就会发生液体相对于固体表面的移动，这种液体相对 于固体表面的移动的现象叫电渗现象 电渗现象。 于固体表面的移动的现象叫电渗现象 电渗现象中整体移动着的液体叫电渗流（ 简称EOF）。 电渗现象中整体移动着的液体叫电渗流（electroosmotic flow ，简称 电渗流 ）。 石英毛细管柱，内充液pH>3 pH>3时 表面电离成管内壁带负电荷， 石英毛细管柱，内充液pH>3时，表面电离成-SiO-,管内壁带负电荷，形成双电 层。在高电场的作用下，带正电荷的溶液表面及扩散层向阴极移动，由于这些阳 在高电场的作用下，带正电荷的溶液表面及扩散层向阴极移动， 离子实际上是溶剂化的，故将引起柱中的溶液整体向负极移动， 离子实际上是溶剂化的，故将引起柱中的溶液整体向负极移动，速度ν电渗流。