Bouin固定液配制及使用方法
Bouin's固定液
Leagene 。
com 北京雷根生物技术有限公司
Bouin's 固定液
简介：
固定的目的在于保存细胞和组织的原有形态结构，固定剂能阻止内源性溶酶体酶对自身组织和细胞的自溶、抑制细菌和霉菌的生长。
Bouin's 固定液(Bouin's Fluid )主要由PA 、甲醛、乙酸混合而成，PA 可沉淀蛋白引起组织收缩，但不会使组织硬化, 其与甲醛和乙酸混合后，穿透速度加快，固定均匀，组织收缩轻微，对细胞的微细结构显示的很清晰，为一种良好的固定液。
组成：
操作步骤(仅供参考)：
1、 一般仅需固定30～60min 。
如果组织块大，可适当延长固定时间。
2、 用Bouin 固定液固定后，组织可稍微流水冲洗或不冲洗直接转入70%的乙醇脱水。
注意事项：
1、 Bouin's 固定液对人体有一定的损害，请在通风好的环境下小心操作， 避免吸入。
2、 组织取材的厚度不同，固定时间也不同，对组织恰当的选材有利于固定液的渗透。
3、 固定液的容量应足够，一般固定液与组织块的体积比率应大于10:1。
4、 温度对固定的影响很明显，提高温度可以加速固定作用，但温度不宜过高。
5、 取出新鲜组织后，应及时固定，无法及时固定时，应保存于生理盐水中及时送检。
编号 名称 DF0010 DF0010 Storage Bouin's Fluid 100ml 500ml RT 避光
使用说明书 1份。
组织切片操作流程
组织切片操作流程切片法主要步骤1、取材与固（1）取材：从动物体取下所需的器官材料。
取材的动物要健康，材料愈新鲜愈好，应在致死后立即取材，防止组织细胞自溶变性；取材的器械要锋利；所取材料力求小而薄（以不超过0.5cm为宜），不能挤压和损伤。
（2）固定：将所取的材料立即投入固定液中，目的是使组织蛋白迅速凝固，使细胞内的结构和成分不再发生变化，保持组织细胞与活体相似的形态结构，固定后的组织块变硬，便于进一步处理。
常用的固定剂有甲醛、乙醇、苦味酸或混合固定液。
实验室常用Bouin固定液，固定时间为12～24小时，其固定的组织块不需进行水洗，可直接进行脱水。
2、脱水与透明（1）脱水：固定后的组织块内含有的大量水分要彻底脱去，以便石蜡的浸入。
常用的脱水剂为乙醇，脱水过程必须循序渐进，从低浓度开始，逐步升高，使组织块中的水分逐渐被乙醇所取代。
具体操作为：Bouin固定液固定的组织块可直接进入70％的乙醇进行脱水，时间12小时左右。
（若材料暂不制片，可保存于70％乙醇中。
）然后将组织块依次移入85％乙醇（Ⅰ）、（Ⅱ）各8-12小时，→95％乙醇（Ⅰ）、（Ⅱ）各2小时，→100％乙醇（Ⅰ）、（Ⅱ）各1小时。
因无水乙醇对组织有脆化作用，故在无水乙醇中时间不能超过2小时。
（2）透明：由于乙醇与石蜡不能相溶，故浸蜡前要对脱水后的组织块进行透明。
常用透明剂有二甲苯、氯仿、苯、香柏油或冬青油等，透明剂能同与乙醇和石蜡相溶，并能增强组织块的折光系数，故透明后的组织块呈半透明状。
使用二甲苯作透明剂的透明过程为：将脱水后的组织块放入无水乙醇与二甲苯混合液（1:1）中30分钟，再移入二甲苯中15-20分钟。
3、浸蜡与包埋（1）浸蜡：将透明后的组织块置于刚过熔点的熔化石蜡中浸渍，使石蜡逐渐渗入并完全置换出透明剂。
过程为：先将透明的组织块移入二甲苯与石蜡混合液（1:1）中，在60℃温箱中放置30分钟，再移入熔化的石蜡（Ⅰ）、（Ⅱ）、（Ⅲ）中，在温箱中每级各1小时。
Bouin固定液使用说明
Bouin固定液Bouin Fixative Solution编号名称规格单位北京华越洋WG07113Bouin固定液250ml，500ml瓶Bouin固定液说明：Bouin固定液是常用的混合型固定液，其渗透能力强，固定均匀，组织收缩小，不会使组织变硬变脆。
适用于绝大部分组织，特别适用于睾丸活检组织的固定。
固定时间一般需要12-24小时。
保存条件：4℃避光保存，有效期半年。
一般固定液固定时的注意事项：(1)固定液量：20倍于材料的体积，以免固定液被稀释。
(2)选择合适的固定液：渗透力强的固定液既可以迅速进入组织中，又不使组织过度收缩或膨胀。
(3)固定的时间要合适：与材料的大小和温度有关：材料大则时间长，材料小则时间短；温度高则时间短，温度低则时间长。
经固定的材料如不及时使用，可以经过90%酒精换到70%酒精中各半小时，再换入一次70%酒精，在0-4℃冰箱内可保存半年。
经过较长时间保存的材料进行观察前可以换新的固定液再处理一次，效果较好。
一般固定液具有的特点：(1)迅速渗入组织，杀死原生质。
在杀死的短时期中，细胞形态不致有所变化。
(2)必须具有渗透力，对组织各部分的渗透力相等，可使组织内外完全固定。
(3)尽可能避免使组织膨胀或收缩。
(4)使细胞内的成分凝固或沉淀。
(5)增加细胞内含物的折光程度，易于鉴别。
(6)增加媒染作用和染色能力。
(7)使组织变硬，具有一定的硬度。
(8)固定以后能起到保存的作用。
(9)在凝固原生质以后，增加细胞对于各种穿透的抵抗力，不致于因以后的处理而使固定的原生质变形。
华越洋Bouin固定液其他相关固定液：通用组织细胞固定液Champy固定液Helly固定液AAF固定液Bouin固定液戊二醛固定液Zetterqvist固定液B-5固定液Bouin固定液Dafano固定液Gendre固定液Methacarn固定液A-F固定液。
组织固定液
组织固定液组织固定液北京华越洋生物------------------------------------------------------AAF固定液500ml 固定液40% 室温,避光,12个月组织化学中细胞或组织切片的固定。
主要由乙醇、冰乙酸、甲醛等组成。
常用于快速脱水和固定以及冷冻切片的快速固定。
AAF固定液5L 固定液40% 室温,避光,12个月组织化学中细胞或组织切片的固定。
主要由乙醇、冰乙酸、甲醛等组成。
常用于快速脱水和固定以及冷冻切片的快速固定。
Davidson's fixative 100ml 固定液40% 室温,避光,12个月Davidson's fixative 500ml 固定液40% 室温,避光,12个月Bouin's固定液100ml 固定液40% 室温,避光,6个月活检标本的固定、媒染剂、适用于脂肪较多的组织标本。
主要由PA溶液、甲醛、乙酸组成。
Bouin's固定液500ml 固定液40% 室温,避光,6个月活检标本的固定、媒染剂、适用于脂肪较多的组织标本。
主要由PA溶液、甲醛、乙酸组成。
改良乙醇Bouin固定液100ml 固定液40% 室温,避光,12个月固定肾活检组织,组织学制备固定液,亦可以很好的保存糖原主要由乙醇、甲醛、乙酸乙酯等组成。
改良乙醇Bouin固定液500ml 固定液40% 室温,避光,12个月固定肾活检组织,组织学制备固定液,亦可以很好的保存糖原主要由乙醇、甲醛、乙酸乙酯等组成。
Carnoy固定液100ml 固定液40% 室温,避光,12个月又称卡诺氏固定液,RNA\DNA染色的固定,糖原的固定,能清除血性标本,可以用于细胞学固定Carnoy固定液500ml 固定液40% 室温,避光,12个月又称卡诺氏固定液,RNA\DNA染色的固定,糖原的固定,能清除血性标本,可以用于细胞学固定Carnoy固定液Ⅱ100ml 固定液40% 室温,避光,12个月又称卡诺氏固定液,RNA\DNA染色的固定,糖原的固定,能清除血性标本,可以用于细胞学固定Carnoy固定液Ⅱ500ml 固定液40% 室温,避光,12个月又称卡诺氏固定液,RNA\DNA染色的固定,糖原的固定,能清除血性标本,可以用于细胞学固定BS固定液500ml 固定液40% 室温,6个月细胞核染色固定,尤其适用于DNA染色。
FTIC及DAPI的染色流程
FTIC及DAPI的染色流程FTIC标记凝集素的组织化学染色程序1、组织切片经脱蜡处理，若是Bouin液固定的组织，用70％乙醇洗3次除去组织切片内的黄色后，再用蒸馏水漂洗；2、PBS漂洗(含1％牛血清白蛋白)2次，每次5分钟；3、加入FITC-凝集素(PBS适当稀释)，置湿盒内孵育，室温1小时；4、PBS漂洗3次，每次5分钟；5、水溶性封片剂封片，荧光显微镜观察。
6、结果FITC标记的凝集素能直接与组织细胞内的糖基结合，从而显示糖基的位置，可用于检测组织细胞中的糖成分，阳性部位呈黄绿色荧光。
7、注意事项(1)固定液：以Bouin固定液为佳，也可用70％乙醇固定；(2)与其他组织化学方法一样，染色过程中，应始终保持一定湿度，使切片保持湿润状态；(3)需经预实验确定FITC-凝集素的最佳工作浓度；(4)凝集素的活性部位需重金属离子维持，故可用TBS作为缓冲液，加微量的金属(CaCl2、MgCl2、MnCl2各1、0mmol/L)，可增强凝集素的结合能力。
DAPI染色1、原理DAPI为4’，6二脒基-2-苯吲哚(4’，6―diamidino-2―phenylindole)能与双链DNA小槽，特别是AT碱基结合，也可插入少于3个连续AT碱基对的DNA序列中。
当它与双链DNA结合时，荧光强度增强20倍，而与单链DNA结合则无荧光增强现象，因此是一种简易、快速和敏感地检测DNA的方法。
DAPI的荧光强度虽较Hoechst低，但荧光稳定性优于Hoechst；其特异性较溴化乙啶(ethidlium bromide，EB)和碘化丙啶(propidium iodide，P1)高。
2、溶液配制(1)0、01mol／L PBS(pH7、0)：取0、1mol／L NaH2PO4・H2O 34ml、0、1mol／LNa2HPO4 66ml、NaCl 0、9g，溶于900m1双蒸水；(2)DAPI储存液：将0、5mgDAPI溶于5、0ml PBS中，分装，低温长期保存；(3)DAPI工作液：用PBS稀释DAPI储存液，终浓度为0、1ug／ml。
组织固定液的使用
谈谈固定液的使用作者: liza3(站内联系TA)发布: 2013-01-11当前，应用于固定试剂的种类较多，它们对于固定不同的组织成分起着不同的作用，因此我们在使用时应该了解不同固定剂的效能，才能合理的固定组织。
根据Bencroft的分类法，将不同的固定剂分为四种类型：Ⅰ类：醛类，甲醛，戊二醛，多聚甲醛，丙烯醛，已二醛，丙二醛等。
Ⅱ类：氧化剂类，四氧化锇（奥酸），高锰酸钾，重铬酸钾等。
Ⅲ类：蛋白变性类，甲醇，乙醇，醋酸等。
Ⅳ类：其他，氯化汞，苦味酸等。
上述四种类型的固定剂，最常使用的是甲醛，其余的也在其它病理技术方面中用到。
下面根据使用的需要，将着重介绍几种常用的固定剂。
（1）甲醛甲醛商品名为福尔马林，一般市售的含甲醛37—40%，由甲醛气体饱和于水而成，比重为1.1 2。
它也可以稳定的固体形式存在，它的成分为高分子量的聚合体，称为多聚甲醛。
甲醛溶液较难纯化，在每批市售商品中，都含有不少的杂质如甲醇，这种在组织化学方法当中，能使酶钝化，影响其反应。
甲酸，它可使固定液变酸，在陈列标本或长时间固定的组织，由于酸的作用，往往细胞核染色欠佳。
甲醛有效固定作用的要点是，在蛋白质末端基团之间形成交联链。
参与甲醛固定蛋白质的基团，主要为氨基，亚氨基及酰氨基，肽，胍基，羟基，SH和芳香环。
甲醛与组织蛋白类的反应是多样和复杂的，因为它能和多种不同的功能基团结合，在多数情况下在其间形成桥键。
甲醛有这种交联的功能，也是它的缺点，在用甲醛固定过的组织中，需要做免疫组化的，往往提倡用酶消化或热抗原修复法来使蛋白与甲醛交联的醛键断裂开，以利于后来的染色。
甲醛可配成简单的或混合的固定液，最简单和最容易掌握的方法，就是取10ml甲醛液，加水9 0ml，这就是10%的福尔马林.当然,现在使用的固定液要求较为严格些,最好是使用缓冲福尔马林固定液,这将有利于后来的免疫组化染色的需要.从组织学的观点来说,甲醛是一种良好的固定剂,它有很多的优点:1. 组织收缩较少,损伤少,保存固有物质好.2. 固定均匀,穿透力强.3. 能使组织硬化,增进组织弹性,有利于切片.4. 能保存脂肪及脂类物质.5. 成本较低.虽然甲醛有上述的优点,但这都是相对而言,任何物质都不可能十全十美的,它也有许多缺点:1. 杂质含量较多,如甲醇,可钝化酶类,影响反应.2. 含有微量甲酸,导致固定液酸变,影响染色.3. 可产生福尔马林色素,影响观察.4. 不能固定尿酸和糖类物质.5. 容易挥发,污染环境,可导致标本干涸.6. 可长期存在于固定过的组织上.有人做过实验,组织用甲醛固定后在流水中冲洗5小时后,仍留有相当多的甲醛与蛋白质相结合,但需要经过长时间的流水冲洗(24天的冲洗)方能除去.可见存在于组织上的甲醛是不可能除去的.因为临床活检不可能有这么长的时间来冲洗组织.因此要特别指出的是,在其后的各种技术操作中,要特别注意到甲醛的存在,必须要想办法除去它,否则将会给各种染色造成影响,甚至导致失败。
石蜡切片步骤
石蜡切片基本步骤（一）取材和固定根据实验目的选择材料。
将整个虫体或虫体的内部器官（如肠道、马氏管、唾液腺等）取出后，立即投入固定液。
取材大小：0.5cm>0.5 cm迥.2或者1.0 cm X.0 cm迥.2，厚度不宜超过3mm。
固定液：2.5%的戊二醛固定液，Bouin 氏液，10%甲醛等。
固定时间：4oC 固定24 小时。
注意事项：取材：1．勿使组织块受挤压切取组织块所用刀、剪要锋利，切割时不可来回切割。
夹取组织时，镊子要轻，切勿挤压，以免损伤组织。
取材时，组织块可稍大一点，以便在固定后，将组织块的不平整部分修去。
2. 选好组织块的切面应熟悉器官组织的组成，并根据观察目的来确定纵切或横切。
3．保持材料的清洁组织块上如有血液、污物、粘液、食物等，先用生理盐水冲洗干净，再入固定液。
4．切除（清除）不需要的部分特别是组织周围的脂肪等，应尽可能清除掉，以免影响以后的程序和观察。
固定：1．材料新鲜取出组织后须立即固定。
否则时间相隔过久，体积就要收缩变形或发生自溶现象。
2．抽气生物组织常有气体的存在，使材料不能沉入固定液中，抽气使得固定液有效渗入。
真空泵抽气或者用空针管抽气。
昆虫整体固定，固定前用解剖针刺数个小孔，以利用固定液渗透。
3．固定剂用量一般为组织体积的10~20倍。
勿使组织贴于瓶底或瓶壁，以免影响固定剂的渗入。
4．避免阳光尽可能避免接触阳光以免失去固定作用。
5．加速固定轻轻摇动盛器使组织移动有利于固定液渗入，对长期固定的标本可经常更换固定液。
（二）洗涤2.5%戊二醛固定液固定的组织：0.2M, pH7.2 磷酸缓冲液漂洗三次，每次10minBouin氏固定液固定的组织：直接入70%酒精更换数次即可脱水，注意苦味酸。
甲醛固定的组织：直接投入50%或70%酒精脱水，不经水洗。
但如果在甲醛中时间过长，则仍应当用流水冲洗。
陈旧性标本和混合性固定液应及时洗涤，有利于脱水、切片和染色。
否则会影响以后的染色效果。
一些固定液及方法介绍
一些固定液及方法介绍前，免疫细胞化学研究中常用的固定剂仍为醛类固定剂，其中以甲醛类和戊二醛最为常用。
在此，简要介绍几种目前较为常用和推荐的固定剂，以供读者选用。
1.4%多聚甲醛-0.1mol/L磷酸缓冲液（pH7.3）试剂：多聚甲醛40g0.1mol/L磷酸缓冲液至1000ml配制方法：称取40g多聚甲醛，置于三角烧瓶中，加入500～800ml 0.1mol/L磷酸缓冲液（Phosphate Buffer以下简称PB），加热至60℃左右，持续搅拌（或磁力搅拌）使粉末完全溶解，通常需滴加少许1N NaOH才能使溶液清亮，最后补足0.1mol/L的PB于1000ml，充分混匀。
该固定剂较适于光镜免疫细胞化学研究，最好是动物经灌注固定取材后，继续浸泡固定2～24h。
另外，该固定剂较为温和，适于组织标本的较长期保存。
2.4%多聚甲醛-磷酸二氢钠/氢氧化钠试剂：A液：多聚甲醛40g蒸馏水400mlB液：Na2HPO4•2H2O16.88g蒸馏水300mlC液：NaOH 3.86g蒸馏水200m配制方法：A液最好在500ml的三角烧瓶中配制（方法同前），至多聚甲醛完全溶解后冷却待用。
注意，在溶解多聚甲醛时，要尽量避免吸入气体或溅入眼内。
B液和C液配制好后，将B液倒入C液中，混合后再加入A液，以1N NaOH或1N HCl 将pH调至7.2～7.4，最后，补充蒸馏水至1000ml充分混合，4℃冰箱保存备用。
该固定剂适于光镜和电镜免疫细胞化学研究，用于免疫电镜时，最好加入少量新鲜配制的戊二醛，使其终浓度为0.5%～1%。
该固定剂较温和，适于组织的长期保存。
组织标本于该固定液中，4℃冰箱保存数月仍可获得满意的染色效果。
3．Bouin's液及改良Bouin's液试剂：饱和苦味酸40%甲醛250ml冰醋酸50ml配制方法：先将饱苦味酸过滤，加入甲醛（有沉淀者禁用），最后加入冰醋酸，混合后存于4℃冰箱中备用。
固定剂的配方及性能介绍
一些固定剂的配方及性能介绍固定，就是用某种方法双最快的速度将细胞杀死并保持组织及细胞原有的形态结构及其组成。
固定在组织制片中极为重要，因为机体死后血液循环停止，细胞逐渐死亡，如不立即处理，则细胞内的酶（水解酶）会使蛋白质分解为氨基酸渗出细胞，使细胞溶解破坏，组织变形，在无冰藏的条件下，更可因其病原微生物的迅速繁殖而腐败，组织结构破坏，不利于形态学的诊断。
组织固定的目的为1、迅速防止组织、细胞死后变化，防止自溶与腐败，以保持和细胞与正常生活时的形态相似；2、使细胞内的蛋白质、脂肪、糖、酶等各种成分转变成不溶解物质，以保持它原有的结构与生活时相仿；3、使组织中的各种物质沉淀和凝固起来而产生不同的折光率，造成光学上的差异，以便染色后易于鉴别和观察；4、固定剂兼有硬化作用，使组织硬化，增加组织硬度，便于制片；5、防止细胞过度收缩或膨胀而失去其原有的形态结构；经过固定的组织，能对染料产生不同的亲和力而着色清晰，便于辨认。
为了能够达到固定的目的，固定剂必须具备以下的性质和条件：1、迅速渗入组织而固定原生质，使短期解剖的组织细胞形态不至于有较大变化；2、固定液有相当的渗透力，对组织各部分的渗透力相等，可使组织内外完全固定；3、使组织细胞中不至于因固定引起人为的改变；4、在凝固原生质以后，增加细胞对于各种穿透的抵抗力，不至于因以后的处理，而使固定后的原生质变形；5、尽可能避免使组织膨胀或收缩（不致改变原生质原来的体积）；6、能使细胞内的成分（蛋白质）凝固或沉淀下来；7、增加细胞内含物的折光度，易于鉴别，增加媒染作用和染色作用；8、使细胞变硬，适于切片，但又不使材料太坚硬或松脆；9、使组织充分固定，便于保存。
[1][2]下面我们介绍中华医学会病理分会推荐的几种常用固定剂的性能[3]：1、4%中性甲醛（10%中性福尔马林）固定液配方：甲醛（40%）100ml，无水磷酸氢二钠6.5g，磷酸二氢钠4. 0g，蒸馏水900ml。
免疫组化的经验总结3
免疫组化的经验总结（3）－操作要点和技巧 生物谷网站1．固定：最好用4%的多聚甲醛固定液。
对于冰冻切片，甲醛固定有时比冰冻丙酮好；但对于不同的组织和抗原，可选用不同的固定液。
有时候商品化的抗体会有比较适合而推荐的固定液，请于购置前注意说明书。
Bouin S固定液：饱和苦味酸750ml，甲醛250ml，冰醋酸50ml，其对组织的穿透力较强，固定较好，结构完整，但因偏酸，对抗原有一定损害，且组织收缩明显，不适于组织标本的长期保存。
PLP液：即高碘酸钠-赖氨酸-多聚甲醛，适于固定石蜡切片。
适于富含糖类组织，对超微结构及许多抗原的抗原性保存较好。
2．组织脱水，透明：时间不能太长，否则在切片时容易碎片，切不完整。
3．切片时展片：有些组织在切片后难以在水中展开，这时可适当地在水中加入几滴乙醇。
4．烤片：60℃ 30分钟或37℃ 过夜，温度太高或时间太长，抗原容易丢失。
5．蜡块及切片的保存：最好在4℃保存6．脱片问题： Poly-L-Lysine(多聚赖氨酸)为目前免疫组化染色工作中最常用的一种防脱片剂，6ml的多聚赖氨酸溶液可按1:10稀释成60ml的工作液，适合于需要酶消化、微波、高温高压的防脱片处理。
如不行，可用双重处理（APES和Poly-L-Lysine）的切片。
在以上两种条件都行不通的情况下，可用如下方法：切片在脱蜡前，放在APES 1：50 丙酮溶液中浸泡3分钟，晾干，即可进行下一步。
7．灭活内源性酶：HRP系统：3%双氧水灭活；AP系统：3%HAc灭活。
8．暴露抗原：对于石蜡切片的免疫组化实验时，必须采用高温加热抗原修复，这将有助于暴露抗原决定簇，从而增加免疫组化染色的强度(不同抗体的最佳修复液请参阅抗体说明书)。
对于不同的组织，不同的抗原，不同的抗体，所采用的方法应不一样，可进行热修复、胰酶消化、既不修复也不消化。
胶原还可以用胃蛋白酶消化等。
9．封闭：在山羊血清封闭，非特异性染色仍然较强时，可延长封闭时间或用浓缩血清封闭10．抗体稀释：应遵循“现用现配”的原则，对于PBS稀释的抗体一定要当天使用。
HE染色石蜡切片制作的基本过程
1、取材与固定：从人或动物新鲜尸体上取下组织块(一般厚度不超过0．5厘米)投入预先配好的固定液中(1 0％福尔马林，Bouin氏固定液等)使组织、细胞的蛋白质变性凝固，以防止细胞死后的自溶或细菌的分解，从而保持细胞本来的形态结构。
Bouin氏液是常用的混合固定液配方：苦味酸饱和液（1.22％）75ml福尔马林25ml冰醋酸5ml2、脱水透明：一般用由低浓度到高浓度酒精作脱水剂，逐渐脱去组织块中的水份。
再将组织块置于既溶于酒精，又溶于石蜡的透明剂二甲苯中透明，以二甲苯替换出组织块的中酒精，才能浸蜡包埋。
3、浸蜡包埋：将已透明的组织块置于已溶化的石蜡中，放入溶蜡箱保温。
待石蜡完全浸入组织块后进行包埋：先制备好容器(如折叠一小纸盒)，倒入已溶化的石蜡，迅速夹取已浸透石蜡的组织块放入其中。
冷却凝固成块即成。
包埋好的组织块变硬，才能在切片机上切成很薄的切片。
（生物秀实验频道）4、切片与贴片：将包埋好的蜡块固定于切片机上，切成薄片，一般为5—8微米厚。
切下的薄片往往皱折，要放到加热的水中烫平，再贴到载玻片上，放45℃恒温箱中烘干。
5、脱蜡染色：常用HE染色，以增加组织细胞结构各部分的色彩差异，利于观察。
苏木精(Hematoxylin，H)是一种碱性染料，可将细胞核和细胞内核糖体染成蓝紫色，被碱性染料染色的结构具有嗜碱性。
伊红(Eosin，E)是一种酸性染料，能将细胞质染成红色或淡红色，被酸性染料染色的结构具有嗜酸性。
染色前，须用二甲苯脱去切片中的石蜡，再经由高浓度到低浓度酒精，最后入蒸馏水，就可染色。
HE染色过程是：①将已入蒸馏水后的切片放入苏木精水溶液中染色数分钟。
②酸水及氨水中分色，各数秒钟。
③流水冲洗1小时后入蒸馏水片刻。
④入70％和90％酒精中脱水各10分钟。
⑤入酒精伊红染色液染色2—3分钟。
6、脱水透明：染色后的切片经纯酒精脱水，再经二甲苯使切片透明。
7、封固：将已透明的切片滴上加拿大树胶，盖上盖玻片封固。
用Bouin液作固定剂制作石蜡组织切片标本的方法
包埋 将浸蜡后的组织包埋于石蜡 中 , 并使它凝固成蜡块 , 这一 过程成称为包埋。包埋的关键是用温镊子 轻轻夹取组织块使 其欲切片面朝向盒底并 放正位置。 7 切片 切片前 , 先用刀片将蜡块修整成正方形或梯形 , 将组织块 以外的多余石蜡修 去但 让组织 四周 留有 2 mm 石蜡 , 以免 切 除的 蜡 带 弯 曲 不 直。切 片 的 第 一 步 需 粗 切 , 粗 切 厚 度 为 20 m 左右 , 粗切使组织全 部暴露 后 , 再 进行细 切。细切至 组 织面表面均匀一致 , 无白点。切片时要用力均匀 , 不可时快时 慢 , 防止机器震动太厉害 , 以致切 片厚薄不均 [ 2] 。切片厚度为 5~ 6 m, 切下的蜡片大 小形状应与组织块上的组织大小形状 一致。 8 贴片与烤片 用小玻棒蘸取一点 ( 绿豆大小 ) 蛋白甘 油于一干净的载玻 片上 , 用手指涂匀 , 并加几滴蒸馏 水于载玻片上。用小镊子将 蜡片轻放在载玻片的水面上 , 如蜡片皱褶无法摊平 , 把载玻片 放在温度为 45 左右的 展片台 上 , 蜡 片受热 后即慢 慢展开 , 完全展平后立即从展片台上移开 , 用解剖针将蜡片位置拨正 , 倾去载玻片上的余水后 , 将其放在烤片盒中置于 50 左右恒 温箱内烤干 , 并使切片与载玻片牢固粘贴 , 温度过高会引起切 片的组织细胞收缩。 9 脱蜡 、 复水 、 染色 脱蜡也相当重要 , 脱蜡时间与室温高低有一定关系 , 如果 脱蜡不干净 , 切片不易着 色 , 或 者着色 不均 , 所以切 片在脱 蜡 剂二甲苯 、 溶液中各历时 7~ 8 min, 脱蜡 干净后 , 经 下行 梯度酒精和蒸馏水洗去 二甲苯 , 在各液中停留 3~ 4 min, 染色 按常规 HE 染色。苏木精染液配 好后最 好停留 6 W 再用 , 染 色时间 20~ 30 min 。染色结果 : 胞 核为苏木 精染液 所染成 鲜 明的蓝色 , 胞浆为伊红所染呈桃红色 , 其他如核仁、 肌纤维、 胶 原纤维等也为伊红所染 , 红细胞染成朱红色 , 染色好的切片应 该是红蓝相映色彩鲜明 。 10 脱水 、 透明 、 封固 切片脱水依次采用上行梯度 酒精 , 为防止尹红褪色 , 故在 各液中停留 2 min, 切片经 二甲苯 透明 , 用中性 塑胶封 片。准 备封片时动作要快 , 封藏剂容易吸入水份 , 同时也要避免口鼻 呼出的气体接触到 玻片上 的封藏 剂 , 以 免影响 切片质 量。盖 玻片时防止气泡出现。 参 考 文 献 6
病理组织的固定
病理组织的固定㈠凡需要进行病理组织学检查的标本（器官或组织），于离体（活体或尸体）后，应尽快置放（浸泡）于装有足够量固定液的容器中固定。
固定液量应为被固定标本体积的5~10倍。
置放标本的容器大小视标本和固定液的体积而定，应适当大一些。
临床科室切取的标本置放于容器中固定后，应尽快送交病理科继续固定。
未能及时、充分固定的干涸或腐败标本不能再进行固定和用于制做切片。
㈡常规固定液为4%中性甲醛（10%中性福尔马林），应预先多量配制贮存，以备随时使用。
小标本的固定时间为4~6小时，大标本为18~24小时或更久。
㈢根据病理学特殊检查（特殊染色和组织化学染色、免疫组织化学染色和原位核酸分子杂交染色、电镜观察等）的需要，应选用其他适宜的固定液进行固定［参见后述的“㈦固定液的常用种类和制备”］。
㈣器官、组织固定的基本方法1．食管、胃、肠、胆囊、膀胱等空腔器官：依规范方法剪开后，按其自然状态平铺于硬纸板上（重点暴露黏膜面或内表面的病变处），并用大头针将标本边缘处固定于纸板上，然后放入4%中性甲醛中固定（黏膜面或内表面朝向容器的液面，并覆盖薄层脱脂棉）。
2．肝、脾：由器官背面，沿其长轴每间隔1.5~2.0cm纵向平行剖开，切成数片。
将每片肝或脾轻轻地平放于装有4%中性甲醛的容器中，容器底面衬以脱脂棉。
应避免标本弯曲和相互间的叠压。
3．肺叶：放入固定液中的肺叶漂浮于液面，需在肺表面覆盖薄层脱脂棉。
必要时从支气管注入适量4%中性甲醛。
4．肾：沿肾外缘中线朝肾门方向作一水平切面（深达于肾盏），再行固定。
5．淋巴结：先用4%中性甲醛固定1小时后，再沿其长轴切成数片（厚 2 ~3mm），继续固定。
6．骨组织：先锯成小片（若是长骨应作横向锯片），在4%中性甲醛中固定24小时后，再进行脱钙。
7．微小组织或液体沉淀物：先用拭纸或滤纸妥为包裹（需用大头针扎牢），然后放入专用小盒内进行中性4%甲醛固定，以防检材遗失。
8．凡进入固定程序的标本必须连带其正确无误的病理检验号（病理号）。
Bouin液和4中性甲醛固定液对睾丸活检组织固定和HE染色差异的比较
虫堡痘堡堂苤查垫！Ｑ生！旦筮ｉ！鲞筮！翅堡垒ｉ！』呈塾：！！Ｐ堡堡垒竺！Ｑ！Ｑ：ｙ！！：！！：堕！：！Ｂｏｕｉｎ液和４％中性甲醛固定液对睾丸活检组织固定和ＨＥ染色差异的比较王海萍王淑妍在男性学发展过程中，睾丸活检曾经是惟一对无精子症或少精子症有诊断价值的检查。
随着精液内一些附性腺的功能性指标检测技术的建立，生殖激素测定及与精子发生有关基因诊断技术的开展，睾丸活检已成为一种既可协助临床诊断又可指导临床治疗的方法。
通常情况下睾丸活检组织与普通组织标本放在一起用４％中性甲醛液固定，但甲醛在睾丸组织的固定中渗透速度相对较慢，且后续ＨＥ染色中组织色彩暗、对比差、生精细胞及精子结构模糊，影响其观察。
自１９９７年１月开始，我们改用Ｂｏｕｉｎ液固定了１３６６例睾丸活检组织，并对其中的１６例患者的睾丸活检组织分别用Ｂｏｕｉｎ液和４％中性甲醛液作了对比，效果满意。
一、材料与方法１．材料：睾丸活检标本来源于２００６—２００９年宁波大学医学院附属医院泌尿外科不育症患者。
主要试剂及仪器：４％中性甲醛（饱和甲醛溶液１９ＩＹｌｌ＋ｐＨ７．４０．１ｍｏｌ／Ｌ磷酸缓冲液９０ｍ１），Ｂｏｕｉｎ固定液（苦味酸７５ｒｎｌ＋４０％甲醛溶液２５ｌｌｌｌ＋冰乙酸５ｍ１），乙醇，二甲苯，盐酸及石蜡等，ＨＭ３１５Ｒ型Ｍｉｃｒｏｍ切片机，ＹＴ－６Ｂ型摊烤片仪，电热恒温电烤箱（上海跃进医疗器械厂）。
２．方法：将配对好的Ｂｏｕｉｎ液和４％中性甲醛固定液交给临床医师保存。
同一患者同部位取两块睾丸活检组织，立即分别放入两种固定液中，固定４ｈ以上。
用Ｂｏｕｉｎ液固定·６２９·．技术交流．的组织在７０％乙醇中脱水１ｈ以上。
这样可以洗去因固定液中苦味酸染上的黄颜色，然后和用４％中性甲醛固定的组织按常规方法脱水、包埋、石蜡切片机连续切片，片厚４斗ｍ，４２℃水浴裱片，ＨＥ常规染色，光镜下观察比较睾丸组织结构，同时对精子数量进行计数。
每例标本各观察计数５张切片１０个高倍视野，取其均数。
常用的组织固定液及配制
常用固定液及其配制固定液分单纯固定液和混合固定液。
1甲醛（formal dehyd e）是无色气体，易溶于水成为甲醛溶液。
易挥发，且有强烈刺激气味，常用得是37％～40％得甲醛溶液，商品名为福尔马林（formal in）。
用作固定的浓度习惯为10％福尔马林（即1份甲醛溶液加9份水配制而成），实际含甲醛4％。
10％福尔马林渗透力强，固定均匀，对组织收缩少。
对脂肪、神经及髓鞘、糖等固定效果好，是最常用的固定剂。
经福尔马林固定时间长的组织，易产生黑色的沉淀，称福尔马林色素。
2 乙醇无色液体，易溶于水，它除可作为固定剂外，还可作为脱水剂，对组织有硬化作用。
固定用一般是80%~95%浓度，乙醇渗透力校弱，它能溶解脂肪，核蛋白被沉淀后，仍能溶于水，因此核的着色不良。
3 中性甲醛液（混合固定液）甲醛（浓）120ml，加蒸馏水880ml,磷酸二氢钠（NaH2PO4?H2O）4g，磷酸氢二纳（Na2HPO4）13g。
此液固定效果比单纯10％福尔马林要好。
4 AF液（混合固定液）95％乙醇90ml，甲醛(浓)10ml。
也有配方是95％乙醇85ml，甲醛（浓）10ml，冰醋酸5ml。
此液除有固定作用外，兼有脱水作用，因此，固定后可直接入95％乙醇脱水。
以上4种固定液中，以中性甲醛为首选，其次为10％福尔马林，乙醇应尽量不用。
yzbaiwrote:（1）10%甲醛：对组织渗透性强，固定均匀。
对组织膨胀约5%，经酒精脱水时有较大的收缩。
能保存脂肪，不能沉淀核蛋白及白蛋白，长期用其固定的组织使组织变为酸性，不利于染色，特别是细胞核的着色。
经自来水冲洗6~24小时后，可以使其酸碱中和，并减少结晶。
（2）4%多聚甲醛：对组织穿透性好，组织收缩小，对大多数抗原物质保存较好，特别是对脂肪和各种酶的固定效果更好。
实验室中固定液
实验室中固定液、缓冲液配置一、固定剂大多数神经激素、肽类物质为水溶性，在用于免疫细胞化学研究之前，常需固定。
但肽类和蛋白质的物理、化学性质不同，因而对不同的固定方法或固定剂的反应也不尽相同。
某些固定剂甚至可同时破坏和/或保护同一抗原的不同抗原决定簇。
因此，在进行免疫细胞化学研究之前，很有必要了解所要研究的物质（蛋白质或肽类）的化学性质，并根据需要来选择适宜的固定剂（或固定方法）以及改进固定条件。
目前，免疫细胞化学研究中常用的固定剂仍为醛类固定剂，其中以甲醛类和戊二醛最为常用。
在此，简要介绍几种目前较为常用和推荐的固定剂，以供读者选用。
1.4%多聚甲醛-0.1mol/L磷酸缓冲液（pH7.3）试剂：多聚甲醛40g0.1mol/L磷酸缓冲液至1000ml配制方法：称取40g多聚甲醛，置于三角烧瓶中，加入500～800ml 0.1mol/L磷酸缓冲液（Phosphate Buffer以下简称PB），加热至60℃左右，持续搅拌（或磁力搅拌）使粉末完全溶解，通常需滴加少许1n NaOH才能使溶液清亮，最后补足0.1mol/L的PB于1000ml，充分混匀。
该固定剂较适于光镜免疫细胞化学研究，最好是动物经灌注固定取材后，继续浸泡固定2～24h。
另外，该固定剂较为温和，适于组织标本的较长期保存。
2.4%多聚甲醛-磷酸二氢钠/氢氧化钠试剂：A液：多聚甲醛40g蒸馏水400mlB液：Na2HPO4·2H2O16.88g蒸馏水300mlC液：NaOH 3.86g蒸馏水200m配制方法：A液最好在500ml的三角烧瓶中配制（方法同前），至多聚甲醛完全溶解后冷却待用。
注意，在溶解多聚甲醛时，要尽量避免吸入气体或溅入眼内。
B液和C液配制好后，将B液倒入C液中，混合后再加入A液，以1n NaOH或1N HCl 将pH调至7.2～7.4，最后，补充蒸馏水至1000ml充分混合，4℃冰箱保存备用。
该固定剂适于光镜和电镜免疫细胞化学研究，用于免疫电镜时，最好加入少量新鲜配制的戊二醛，使其终浓度为0.5%～1%。
(完整版)常用的组织固定液及配制
常用固定液及其配制固定液分单纯固定液和混合固定液。
1甲醛（formaldehyde）是无色气体，易溶于水成为甲醛溶液。
易挥发，且有强烈刺激气味，常用得是37％～40％得甲醛溶液，商品名为福尔马林（formalin）。
用作固定的浓度习惯为10％福尔马林（即1份甲醛溶液加9份水配制而成），实际含甲醛4％。
10％福尔马林渗透力强，固定均匀，对组织收缩少。
对脂肪、神经及髓鞘、糖等固定效果好，是最常用的固定剂。
经福尔马林固定时间长的组织，易产生黑色的沉淀，称福尔马林色素。
2 乙醇无色液体，易溶于水，它除可作为固定剂外，还可作为脱水剂，对组织有硬化作用。
固定用一般是80%~95%浓度，乙醇渗透力校弱，它能溶解脂肪，核蛋白被沉淀后，仍能溶于水，因此核的着色不良。
3 中性甲醛液（混合固定液）甲醛（浓）120ml，加蒸馏水880ml,磷酸二氢钠（NaH2PO4?H2O）4g，磷酸氢二纳（Na2HPO4）13g。
此液固定效果比单纯10％福尔马林要好。
4 AF液（混合固定液）95％乙醇90ml，甲醛(浓)10ml。
也有配方是95％乙醇85ml，甲醛（浓）10ml，冰醋酸5ml。
此液除有固定作用外，兼有脱水作用，因此，固定后可直接入95％乙醇脱水。
以上4种固定液中，以中性甲醛为首选，其次为10％福尔马林，乙醇应尽量不用。
yzbai wrote:（1）10%甲醛：对组织渗透性强，固定均匀。
对组织膨胀约5%，经酒精脱水时有较大的收缩。
能保存脂肪，不能沉淀核蛋白及白蛋白，长期用其固定的组织使组织变为酸性，不利于染色，特别是细胞核的着色。
经自来水冲洗6~24小时后，可以使其酸碱中和，并减少结晶。
（2）4%多聚甲醛：对组织穿透性好，组织收缩小，对大多数抗原物质保存较好，特别是对脂肪和各种酶的固定效果更好。
固定的时间不宜太长，以24小时以内为宜，适用于免疫组织化学染色。
几种细胞固定方法选择最佳固定液标准是：（1）最好地保持细胞和组织的形态结构；（2）最大限度地保存抗原的免疫活性。
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Bouin固定液
Bouin氏液是组织化学中最常用的混合型固定液之一，由苦味酸饱和液（1.22%）、甲醛和冰醋酸按15:5:1的比例混合而成。
此固定液对大多数组织固定效果良好。
它具有下列特点：
1.其渗透能力强，固定均匀，组织收缩小，染色效果好。
2.适用范围广，特别适合于富含结缔组织的标本和胚胎标本。
能够软化皮肤角质，并可以用于植物组织的固定。
3.因为本产品含有苦味酸，会溶解火棉胶，所以如果用于火棉胶包埋，必须进行洗脱苦味酸处理。
标本尺寸不可太大，一般窄边不大于5 mm。
使用方法：1.标本修块，厚度一般不超过5 mm，置入本产品内固定8 ~ 24 h（根据样品材料、大小不同，固定时间可能会有较大差异）。
2固定后用70%-80%乙醇洗涤。
Bouin氏液是常用的混合固定液配方：
苦味酸饱和液（1.22%）75ml
福尔马林25ml
冰醋酸5ml
Bouin固定液使用方法
1.标本修块，厚度一般不超过5 mm，置入本产品内固定8 ~ 24 h（根据样品材料、大小不同，固定时间可能会有较大差异）。
2.固定后用70%-80%乙醇洗涤。
Bouin固定液关联产品
Zenker固定液；Helly固定液；
Carnoy固定液；Karnovsky固定液
此液一般在临床用时配制，对皮肤及肌腱有软化作用。
没有很好的固定就无法染色，所以，一种好的固定液是细胞观察的重点。
当前国内外基本上都还是要用甲醛来固定组织。
从免疫组织化学的角度来说，甲醛固定的组织大部分都可以用免疫组化的手段来检测，据多人认为，它对lgA ，lgM，J链，K链和λ链的标记效果较好，且背景清晰。
但美中不足的是：经它固定的组织，可与蛋白形成醛交
联蛋白，这种醛键可封闭抗原。
固此，在免疫组化实际检测中，应根据不同的要求和需要，采用酶消化或者其它抗原修复如微波、高压等的方法，以便破坏醛键重新暴露抗原。