生物药物分析与检测高效液相色谱法
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➢ Waters LC-600 ➢ Waters LC-2690 ➢ 岛津LC－10A ➢ HP1050 ➢ Agilent 1100系列
液相色谱仪（1）
液相色谱仪(2)
液相色谱仪（3）
液相色谱仪（4）
液相色谱仪（5）
Agilent 1100系列
一、 高效液相色谱仪结构流程
高压泵
进样器
色谱柱
检测器 储液瓶 废液 高压输液泵、高效分离住、高灵敏度检测器
典型的仪器配置
色谱泵及控制器
数据处理及控制
色谱柱 检测器
Waters 486
进样器
Back
HPLC 系统
溶剂传输系统：心脏 样品引入系统： 样品分离系统：关键 信号检测系统： 数据处理系统：
高压泵 进样器 色谱柱 检测器 软件
一 高压输液系统
高效液相色谱法
第一节 概述 第二节 基本理论 第三节 高效液相色谱的定性和定量分析 第四节 实际操作中的问题 第五节 在药物分析中的应用
第一节 概述
1、历史： 1903年 茨维特分离绿叶色素(Tswett实验) 40年代 TLC，纸色谱 50年代 GC出现使色谱具备分离和在线分析功能 60年代末 HPLC出现，使色谱分析范围进一步扩大
②选择一根适用的色谱柱，确定柱的规格 （柱内径及柱长）和选用固定相（粒径及孔径）。
③选择适当的或优化的分离操作条件，确定 流动相的组成、流速及洗脱方式。
④由获得的色谱图进行定性分析和定量分析。
高效液相色谱方法开发 与色谱条件优化
1 了解样品的有关情况，明确分析目的
2 是否需要样品预处理，是否有特殊的步骤
8 方法论证进入常规实验室
wk.baidu.com
由于HPLC分析不受温度和样品沸点限 制，因此具有更广阔的应用潜力。经过30多 年的迅速发展，高效液相色谱法在基础理论、 仪器装置和色谱柱等方面的研究已趋于成熟， 现已成为化学化工、环境、药学、食品等多 个领域中最具优势的分离分析方法之一。
第18页/共49页
HPLC常见机型
3．操作条件差别
❖ GC：加温操作
❖ HPLC：室温；高压（液体粘度大，峰展宽小）
HPLC的特点和应用
“三高” “一快” “一广”
➢ 高柱效——远高于一般LC ➢ 高灵敏度 ➢ 高选择性 ➢ 分析速度快 ➢ 应用范围广泛（可分析80%有机化合物）
建立高效液相色谱分析方法
①根据被分析样品的特性选择适用于样品 分析的一种高效液相色谱分析方法。
1.贮液器：1-2L的玻璃瓶，配有溶剂过滤器(Ni
合金)，其孔很约2 m，可防止颗粒物进行
泵内。
2.脱气：超声波脱气或真空加热脱气。溶剂通 过脱气器中的脱气膜，相对分子量小的气 体透过膜从溶剂中除去。
3.高压泵：
➢ 对输液泵的要求：密封性好、输液流量稳 定无脉动、可调范围宽、耐腐蚀。
要求： 输出压力高； 平稳、脉冲小； 流量稳定可调； 耐腐蚀。
2．流动相差别 ➢ GC：流动相为惰性气体 ➢ 组分与流动相无亲合作用力，只与固定相作用 ➢ HPLC：流动相为液体 ➢ 流动相与组分间有亲合作用力，为提高柱的选择
性、改善分离度增加了因素，对分离起很大作用 ➢ 流动相种类较多，选择余地广 ➢ 流动相极性和pH值的选择也对分离起到重要作用
选用不同比例的两种或两种以上液体作为流动相 可以增大分离选择性
3 选择仪器类型，确定检测器及其参数
4 选择液相色谱分离类型，色谱柱，流动相，其他相关条件（如波长等），进行预实验，估计最佳条件
5 优化分离条件，选择最佳检测器参数、色谱柱、流动相比例等
6 检查出现的各种现象和问题(包括仪器、样品稳定性等）选择解决办法和特殊步骤
7a 回收纯化物质
7b 定量校正
7c 定性方法
HPLC与GC差别 ✓ 相同：兼具分离和分析功能，均可以在线检测
✓ 主要差别：分析对象的差别和流动相的差别
1．分析对象 ➢ GC：能气化、热稳定性好、且沸点较低的样品，
高沸点、挥发性差、热稳定性差、 离子型及高聚物的样品不可检测 占有机物的20% ➢ HPLC：溶解后能制成溶液的样品， 不受样品挥发性和热稳定性的限制 分子量大、难气化、热稳定性差及高分子 和离子型样品均可检测 用途广泛，占有机物的80%
HPLC与经典LC区别
HPLC与经典LC区别 ✓ 主要区别：固定相差别，输液设备和检测手段
经典LC
仅做为一种分离手段 柱内径1～3cm，固定相 粒径>100μm 且不均匀
常压输送流动相 柱效低（H↑，n↓） 无法在线检测 分析周期长
HPLC
分离和分析
柱内径2～6mm，固定相 粒径<10μm（球形，匀浆 装柱） 高压输送流动相 柱效高（H↓，n↑） 可以在线检测 分析时间大大缩短
机械往复柱塞泵结构图
4.梯度淋洗装置
➢ 梯度洗脱就是在分离过程中使两种或两种 以上不同极性的溶剂按一定程序连续改变 它们之间的比例，从而使流动相的强度、 极性、pH值或离子强度相应地变化，达到 提高分离效果，缩短分析时间的目的。
2、展望： 1．新型固定相和检测器 2．联用仪器：GC-MS，HPLC-MS 3．智能化发展
Tswett实验
茨维特的实验（图示）
色谱三要素：
固定相； 流动相； 待分离物质。
Tswett实验
经典液相色谱法
柱层析
二、什么是HPLC
高效液相色谱法（ high performance liquid chromatography；HPLC）是在 经典液相色谱法的基础上，引入了气相 色谱的理论与高压技术，以高压输送流 动相，采用高效固定相及高灵敏度检测 器，发展而成的现代液相色谱分离分析 方法。
概述 • 高效液相色谱(HPLC)是以溶剂液体为流动相的色谱方法。 • 早期液相色谱，包括Tswett的工作，都是在直径1-5cm, 长50500cm的玻璃柱中进行的。为保证有一定的柱流速，填充的固
定相颗粒直径多在150-200m范围内。即使这样，流速仍然很
低(<1mL/min)，分析时间仍然很长！ 当加压增加流速(真空或空气泵)时，尽管分析时间减少，但
柱塔板高度Hmin也相应增加了！或者说柱效下降了。 为了解决分析时间及柱效问题，人们认识到：最为有效地增
加柱效的唯一方法是减小填充物的粒径（3~10 m ）！ 直到60年代，由于在高压下操作的液压设备、高效固定相
以及高灵敏检测器的出现及发展，才彻底解决了分析时间及柱 效的问题。即所谓的高效液相色谱技术才真正得到广泛应用。
液相色谱仪（1）
液相色谱仪(2)
液相色谱仪（3）
液相色谱仪（4）
液相色谱仪（5）
Agilent 1100系列
一、 高效液相色谱仪结构流程
高压泵
进样器
色谱柱
检测器 储液瓶 废液 高压输液泵、高效分离住、高灵敏度检测器
典型的仪器配置
色谱泵及控制器
数据处理及控制
色谱柱 检测器
Waters 486
进样器
Back
HPLC 系统
溶剂传输系统：心脏 样品引入系统： 样品分离系统：关键 信号检测系统： 数据处理系统：
高压泵 进样器 色谱柱 检测器 软件
一 高压输液系统
高效液相色谱法
第一节 概述 第二节 基本理论 第三节 高效液相色谱的定性和定量分析 第四节 实际操作中的问题 第五节 在药物分析中的应用
第一节 概述
1、历史： 1903年 茨维特分离绿叶色素(Tswett实验) 40年代 TLC，纸色谱 50年代 GC出现使色谱具备分离和在线分析功能 60年代末 HPLC出现，使色谱分析范围进一步扩大
②选择一根适用的色谱柱，确定柱的规格 （柱内径及柱长）和选用固定相（粒径及孔径）。
③选择适当的或优化的分离操作条件，确定 流动相的组成、流速及洗脱方式。
④由获得的色谱图进行定性分析和定量分析。
高效液相色谱方法开发 与色谱条件优化
1 了解样品的有关情况，明确分析目的
2 是否需要样品预处理，是否有特殊的步骤
8 方法论证进入常规实验室
wk.baidu.com
由于HPLC分析不受温度和样品沸点限 制，因此具有更广阔的应用潜力。经过30多 年的迅速发展，高效液相色谱法在基础理论、 仪器装置和色谱柱等方面的研究已趋于成熟， 现已成为化学化工、环境、药学、食品等多 个领域中最具优势的分离分析方法之一。
第18页/共49页
HPLC常见机型
3．操作条件差别
❖ GC：加温操作
❖ HPLC：室温；高压（液体粘度大，峰展宽小）
HPLC的特点和应用
“三高” “一快” “一广”
➢ 高柱效——远高于一般LC ➢ 高灵敏度 ➢ 高选择性 ➢ 分析速度快 ➢ 应用范围广泛（可分析80%有机化合物）
建立高效液相色谱分析方法
①根据被分析样品的特性选择适用于样品 分析的一种高效液相色谱分析方法。
1.贮液器：1-2L的玻璃瓶，配有溶剂过滤器(Ni
合金)，其孔很约2 m，可防止颗粒物进行
泵内。
2.脱气：超声波脱气或真空加热脱气。溶剂通 过脱气器中的脱气膜，相对分子量小的气 体透过膜从溶剂中除去。
3.高压泵：
➢ 对输液泵的要求：密封性好、输液流量稳 定无脉动、可调范围宽、耐腐蚀。
要求： 输出压力高； 平稳、脉冲小； 流量稳定可调； 耐腐蚀。
2．流动相差别 ➢ GC：流动相为惰性气体 ➢ 组分与流动相无亲合作用力，只与固定相作用 ➢ HPLC：流动相为液体 ➢ 流动相与组分间有亲合作用力，为提高柱的选择
性、改善分离度增加了因素，对分离起很大作用 ➢ 流动相种类较多，选择余地广 ➢ 流动相极性和pH值的选择也对分离起到重要作用
选用不同比例的两种或两种以上液体作为流动相 可以增大分离选择性
3 选择仪器类型，确定检测器及其参数
4 选择液相色谱分离类型，色谱柱，流动相，其他相关条件（如波长等），进行预实验，估计最佳条件
5 优化分离条件，选择最佳检测器参数、色谱柱、流动相比例等
6 检查出现的各种现象和问题(包括仪器、样品稳定性等）选择解决办法和特殊步骤
7a 回收纯化物质
7b 定量校正
7c 定性方法
HPLC与GC差别 ✓ 相同：兼具分离和分析功能，均可以在线检测
✓ 主要差别：分析对象的差别和流动相的差别
1．分析对象 ➢ GC：能气化、热稳定性好、且沸点较低的样品，
高沸点、挥发性差、热稳定性差、 离子型及高聚物的样品不可检测 占有机物的20% ➢ HPLC：溶解后能制成溶液的样品， 不受样品挥发性和热稳定性的限制 分子量大、难气化、热稳定性差及高分子 和离子型样品均可检测 用途广泛，占有机物的80%
HPLC与经典LC区别
HPLC与经典LC区别 ✓ 主要区别：固定相差别，输液设备和检测手段
经典LC
仅做为一种分离手段 柱内径1～3cm，固定相 粒径>100μm 且不均匀
常压输送流动相 柱效低（H↑，n↓） 无法在线检测 分析周期长
HPLC
分离和分析
柱内径2～6mm，固定相 粒径<10μm（球形，匀浆 装柱） 高压输送流动相 柱效高（H↓，n↑） 可以在线检测 分析时间大大缩短
机械往复柱塞泵结构图
4.梯度淋洗装置
➢ 梯度洗脱就是在分离过程中使两种或两种 以上不同极性的溶剂按一定程序连续改变 它们之间的比例，从而使流动相的强度、 极性、pH值或离子强度相应地变化，达到 提高分离效果，缩短分析时间的目的。
2、展望： 1．新型固定相和检测器 2．联用仪器：GC-MS，HPLC-MS 3．智能化发展
Tswett实验
茨维特的实验（图示）
色谱三要素：
固定相； 流动相； 待分离物质。
Tswett实验
经典液相色谱法
柱层析
二、什么是HPLC
高效液相色谱法（ high performance liquid chromatography；HPLC）是在 经典液相色谱法的基础上，引入了气相 色谱的理论与高压技术，以高压输送流 动相，采用高效固定相及高灵敏度检测 器，发展而成的现代液相色谱分离分析 方法。
概述 • 高效液相色谱(HPLC)是以溶剂液体为流动相的色谱方法。 • 早期液相色谱，包括Tswett的工作，都是在直径1-5cm, 长50500cm的玻璃柱中进行的。为保证有一定的柱流速，填充的固
定相颗粒直径多在150-200m范围内。即使这样，流速仍然很
低(<1mL/min)，分析时间仍然很长！ 当加压增加流速(真空或空气泵)时，尽管分析时间减少，但
柱塔板高度Hmin也相应增加了！或者说柱效下降了。 为了解决分析时间及柱效问题，人们认识到：最为有效地增
加柱效的唯一方法是减小填充物的粒径（3~10 m ）！ 直到60年代，由于在高压下操作的液压设备、高效固定相
以及高灵敏检测器的出现及发展，才彻底解决了分析时间及柱 效的问题。即所谓的高效液相色谱技术才真正得到广泛应用。