细胞凋亡的研究方法的建立与评价

• 凋亡：细胞凋亡指的细胞的程序性死亡，细胞被 自身的酶降解，按一定的步骤“自杀”，其死亡 细胞仍为一整体，最终被白细胞吞噬。（而细胞坏死会
有细胞壁破裂的现象，内含物外泄，会影响周围的细胞。）
启动 信 号 通 路
凋亡早期
凋亡中期
凋亡晚期
Caspase 激活
★核染色质凝缩 凋亡小体形成 ★ 细胞膜PS 外翻 ★线粒体膜电位丧失 ★DNA 被切割成片段
进行有丝分裂的细胞才具有细胞周期。 ）
• 分化：在个体发育中，通过细胞分裂后产生的子 代细胞比上一代细胞具有更专一的功能。后代在 形态结构和功能上发生稳定性的差异过程称为细 胞分化（cellular differentiation）。（比如血液中的红细胞、
白细胞、淋巴细胞、血小板等都是从造血干细胞分化出来的，但是与造血干细胞相比， 这些子代细胞都具有更加专一的功能。 ）
• MTT法（四甲基偶氮唑盐微量酶反应比色 法）是Mosmann1983年报告的。原理是活 细胞内线粒体脱氢酶能将四氮唑化物 （MTT）由黄色还原为紫红（兰）色的甲 （肷）紫,后者溶于有机溶剂（如二甲基亚 枫、酸化异丙醇等）,甲紫（肷）产量与细 胞活性成正比。可在560nm处用酶标仪测 定其OD值。
Apoptosis 细胞凋亡研究方法建立与评价
蒋纪恺
•
研究生？
• 研究方向 • 研究立题（研究背景、发现问题、提出问 题（？）、提出假设、解决问题的策略与 方法） 申请课题，获得经费 • 实验验证（实验模型、技术指标、方法建 立与评价） • 结果分析（撰写论文，申报专利，评奖）
• 研究方向：白血病 • 研究立题：肿瘤靶向治疗的分子机制研究。文献 • 阅读与学习。信号转导在白血病发生 • 与治疗的背景知识 • • 研究模型：白血病细胞株；动物模型等 • 技术平台：实验技术的建立与评价，（技术指 • 标，动手能力） • • 结果分析：统计学知识，文献回顾 • 论文撰写：语言能力
• 灵敏度 • 特异性 • • • • • 蛋白质分析 1，染色 2，酶 3，免疫 分泌蛋白、膜蛋白、细胞质，细胞核蛋白
方法学建立与研究策略
• 药物浓度的选择（MTT）
• 形态学观察（凋亡小体形成） • DNA 被切割成片段 • 细胞膜PS 外翻 • Caspase 激活 • 信号通路
MTT测定细胞增殖
Gossypol（24h）
个体化 靶向治疗
Deficiency
• Chinese herbal medicine in Chaoshan area
• HL60(Human promyelocytic leukemia cells) • derived from a 36-year-old woman with acute promyelocytic leukemia at the National Cancer Institute
研究方法建立与评价
形态学观察
DNA 被切割成片段
细胞膜PS 外翻
Annexin V
• 基本原理 细胞凋亡早期改变发生在细胞膜表面，目前早期识别仍有困难。这些 细胞膜表面的改变之一是磷脂酰丝氨酸（PS）从细胞膜内转移到细 胞膜外，使PS暴露在细胞膜外表面。PS是一种带负电荷的磷脂，正 常主要存在于细胞膜的内面，在细胞发生凋亡时细胞膜上的这种磷脂 分布的不对称性被破坏而使PS暴露在细胞膜外。Annexin V是一种 Ca+依赖的磷脂结合蛋白，最初发现是一种具有很强的抗凝血特性的 血管蛋白，AnnexinBiblioteka BaiduV具有易于结合到磷脂类如PS的特性。对PS有高 度的亲和性。因此，该蛋白可充当一敏感的探针检测暴露在细胞膜表 面的PS。PS转移到细胞膜外不是凋亡所独特的，也可发生在细胞坏 死中。两种细胞死亡方式间的差别是在凋亡的初始阶段细胞膜是完好 的，而细胞坏死在其早期阶段细胞膜的完整性就破坏了。因此，可以 建立一种用Annexin V结合在细胞膜表面作为凋亡的指示并结合一种 染料排除试验以检测细胞膜的完整性的检测方法。
研究模型
• 慢性粒细胞白血病（chronic myelogenous leukemia，CML ） • 逆转 • K562 cell line 分化（红系细胞） • 增殖 • • 凋亡 药物诱导
• K562 cells
• a bcr:abl positive erythroleukamia line derived from a 53 year old female CML patient in blast crisis • Philadelphia chromosome
研究背景
肿瘤治疗
• • • • 手术 放疗 化疗 骨髓移植（白血病）
立题依据
增殖
Survival Growth
分化
Differetiation
凋亡
Apoptosis
肿瘤 Tumour
• 增殖：细胞通过分裂使细胞数目增加的过程 ，细 胞分裂。（真核细胞的增殖方式有：有丝分裂、减数分裂、无丝分裂三种方式，只有连续