酶法合成头孢菌素类抗生素的研究进展

收稿日期:2010-11-15

基金项目:黑龙江省教育厅项目(11511304)作者简介:曾伟民(1973-),男,讲师,博士.

通讯作者:雷　虹(1971-),女,副教授,博士,硕士生导师.

酶法合成头孢菌素类抗生素的研究进展

曾伟民,张基亮,李元敬,雷　虹

(黑龙江大学生命科学学院,黑龙江哈尔滨150080)

中图分类号:S 859.79+

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文献标识码:A 文章编号:1004-7034(2010)12-0036-03 近年来,头孢菌素类抗生素使用得越来越多,临

床应用证明它是一类抗菌谱广、抗菌活性强、疗效高、毒性低、耐β-内酰胺酶的抗生素。头孢菌素属β-内酰胺类抗生素分子中含有的β-内酰胺结构能抑制肽转肽酶所催化的转肽反应,使线性高聚物不能交联成网状结构,抑制黏肽的合成,从而阻止细胞壁的形成,导致细胞的死亡。头孢菌素自从投入工业化生产至今已与青霉素一起构成世界抗生素市场的主导

产品[1]

。

7-氨基头孢烷酸(7-a m i n o c e p h a l o s p o r a n i c

a c i d ,7-A C A )是生产头孢菌素类抗生素的关键性中间体,生产7-A C A 的方法主要有化学法和酶法。目

前,B i o c h e m i c 公司和A n t i b i o t i c s 公司大部分采用酶法生产7-A C A ,国内多由头孢菌素C (C P C )经化学

裂解法得到。国内用酶法催化反应制备7-A C A 的

量很小,是因为化学裂解法使用大量危险的化学原材料,反应条件苛刻,污染严重等,用酶法取代化学法已

成为7-A C A 生产的必然趋势[2]

。

1　7-A C A 合成的途径

1.1　化学法合成1.1.1　直接裂解法　通过C P C 与亚硝酸氯(n o c l )反应,此时侧链环形成不稳定的亚胺内酯中间体,随即分解成7-A C A ,但此法收率较低,只有40%～50%。1.1.2　间接裂解法　使用头孢菌素C 盐作为原料经过酯化、保护羧基、氯化、醚化等几个步骤之后水解为7-A C A ,收率为60%～70%。如果使用无水C P C 可以达到90%的收率。间接裂解法最关键的就是羧基的保护,方法有硅脂法、乙酸混合酸酐法、酰氯酸酐法和异丁酮法等。

化学合成法存在着原料分子的活性基团需要保护、合成过程长、工艺复杂、操作繁琐、收率低和三废

污染、步骤多、反应条件苛刻等不足[3]

。1.2　酶法合成

1.2.1　一步酶法合成7-A C A 头孢菌素C 酰基转

移酶(C P Ca c y l a s e )可以不经过G L -7-A C A 等中间产物直接把C P C 转变到7-A C A ,因此其转化率与化学法相当,而且能得到更高质量的7-A C A 。利用C P Ca c y l a s e 生产7-A C A 的一步酶法是非常新的7-A C A 酶法工程,既具有高转化率和纯度的化学法优势,也具有高经济性和环境保护的两步酶法优势[4]

。虽然该法步骤简单,但目前已发现的C P C 酰化酶活力都十分低,远不能满足工业催化的需要。1.2.2　两步酶法合成7-A C A 第一步,C P C 在通氧气情况下被D-氨基酸氧化酶(D-a m i n o a c i d o x i -d a s e ,D A A O )催化[5]

,产生具有酮基的中间体(k e t o a -d i p y l 7-a m i n o c e p h a l o s p o r a n i c a c i d ,k e t o -7-A C A )和H 2O 2。这个中间体较不稳定,很容易被同时产生的H 2O 2化学氧化脱羧,转变成戊二酰基-7-氨基头孢烷酸(g l u t a r y l 7-a m i n o c e p h a l o s p o r a n i c a c i d ,G L -7-A C A ),然后G L -7-A C A 在G L-7-A C A 酰化酶(G L -7-A C Aa c y l a s e )的作用下脱去其侧链,生成7-A C A 。第二步:酶法合成头孢菌素具有生产工艺简单、周期短、反应在较温和的条件下进行、p H 值接近中性、无需基团保护、割除了化学合成中所需的毒害物质、劳动环境得到改善、减少了三废的排放、有利于清洁生产等优点。因此,酶法合成各类头孢菌素引起了

广泛的兴趣,并显示了很大的优越性[6]

。与化学法相比,酶法裂解可以使产品能够达到高收率、高质量、同时降低成本和减少污染的目的。

2　酶法合成头孢菌素类抗生素的相关酶及产生菌种

用于合成头孢菌素类抗生素的氧化酶、酰化酶等酶来源广泛,其中主要为青霉素酰化酶,如G L -7-A C A 酰化酶,其产生菌主要有杆菌及单孢菌,如巨大芽孢杆菌、无色杆菌、醋酸杆菌、大肠杆菌、黏性节杆菌、巴氏醋酸杆菌、混浊醋杆菌、假单孢菌、产黑假单孢菌、坏死单孢菌等。α-氨基酸酯水解酶也可用于

头孢菌素的合成,其产生菌主要为单孢菌[7]

,如铜绿假单孢菌、柑桔溃疡单孢菌。

D A A O 是一种典型的黄素蛋白,其辅酶为黄素腺嘌呤二核苷酸(F A D ),广泛存在于动物内脏及微生物中。D A A O 的底物专一性较低,可以作用于几乎所

36H e i l o n g j i a n g A n i m a l S c i e n c e

a n d V e t e r i n a r y M e d i c i n e №

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2010年12月(上)

有的D-氨基酸,也可以作用于各种具有D-氨基的化合物,其主要来源有三角酵母(T r i g o n o p s i s v a r i a b i-l i s)、猪肾、腐皮镰孢霉(F u s a r i u m s o l a n i)、红酵母(R h o d o t o r u l a g r a c i l i s)、尖镰孢(F u s a r i u m o x y s p o r u m)和曲霉(A s p e r g i l l u s)等。

3　酶的稳定性及酶的固定化

酶的稳定性决定了产品的产率和效率,熟悉酶的最适条件对生产和经济都有很大的帮助,一些酶经过固定化后,无论是对酶的稳定性、重复利用都会有很大提高。G L-7-A C A酰化酶热稳定性较好,在菌株P s e u d o m o n a s A14、B a c i l l u s J1和P s e u d o m o n a s B L072中,此酶在50℃下可保持90%的酶活,但前两株菌的G L-7-A C A酰化酶仅在p H值为8～9时稳定,而7-A C A和C P C在碱性条件下不稳定,这就导致了此酶不能在最适条件下发挥作用。此外,它们的酰化酶活性还受缓冲液类型的强烈影响,如使用甘氨酸缓冲液时,其活性要比使用磷酸盐或T r i s-H C l缓冲液高5～10倍[8]。

然而使用固定化的方法,将G L-7-A C A酰化酶进行固定化,可以减少很多局限,并且可提高转化率、减少副产物、重复利用酶、降低成本,因此适于大规模的生产。常用的共价固定化载体有环氧乙烷基丙烯酸珠粒和可控制孔径的玻璃珠粒。此外,还可以先将酶吸附,再同戊二醛交联至阴离子交换树脂上,但此法固定的酶活低于共价固定的平均酶活。经固定化后,G L-7-A C A酰化酶的稳定性即可显著提高。如在头孢氨苄酶法缩合反应中,所使用的酶基本上是采用固定化技术处理得到的固定化青霉素酰化酶,而早期使用的固定化细胞等形态的酶,因其形态结构和性能方面的缺陷已逐步被淘汰。目前所使用的固定化酶,在生物工程菌的选育、发酵、酶的提取、固定化载体的选择和固定化技术等方面都有了长足的进步,已经较好地解决了早期固定化酶在形态结构和性能方面的缺陷;同时随着对固定化酶催化反应机制和反应动力学方面的深入研究,在头孢氨苄酶法合成中固定化酶的使用寿命已经大大延长。头孢氨苄的酶催化缩合技术近年来的发展水平已相当令人满意。M o n t i D等[9]对固定化G L-7-A C A酰化酶重复操作42批次后,其酶活仍为初始值的93%。

D A A O在冷冻(-20℃)状态下、p H值为8.3的20m m o l/L焦磷酸盐中是稳定的,解冻和冷冻均不影响活性。室温下,D A A O稳定性较差;23℃、p H值为7.0～7.3时,三角酵母的D A A O酶活半衰期只有10～15h[10];30℃、10%甘油稳定剂的条件下,半衰期仅为12～14h;无O2和H2O2时,20～25℃、p H值为7.0～8.2的磷酸盐缓冲液中,半衰期可达50～70h。在催化过程中,D A A O的稳定性差的原因还可能和反应混合物中的O2和H2O2有关。但为实现快速、高产的反应,必须有O2和H2O2存在。辅基F A D 的脱离是造成D A A O热不稳定的主要原因,向酶液中加入F A D和甘油可明显改善其热稳定性。D A A O 一般存在于真菌细胞的过氧化酶体中,物质传递比较困难,因此细胞需经透性化处理后再用于催化。经过25%丙酮溶液处理的三角酵母细胞的D A A O表观酶活能提高20～50倍[11]。此外,对特定的氨基酸进行定点突变来改变D A A O的结构或将D A A O固定化,也是提高其稳定性的有效途径。

将D A A O固定在有机载体上能显著延长使用时间,常用的固定化载体有C N B r活化的a g r o s e、S e p H 值a r o s e H B或D u o l i t e A365等。有一种新的固定化载体为聚甲基丙烯酸缩水甘油酯树脂,先利用酶蛋白变性的方法去除D A A O中的过氧化氢酶,再将D A A O 经共价交联到该树脂上[12],经处理后的酶对热、p H 值、O2的稳定性都大大提高,且在催化C P C的过程中,酮酸中间体随反应批次的增加而逐渐减少。

4　产物的提取与回收

在酶法制备头孢菌素类药物技术中,产品分离与纯化的方法是一项关键性技术。以酶法合成头孢氨苄为例,由于所用的原料和产物的理化性质相近,采用普通的方法难以达到分离提纯的目的。因此,该问题一直成为酶法合成头孢类抗生素工业化生产的一大障碍。目前已进行研究开发的头孢类抗生素回收纯化方法有多种,如酸碱结晶法、浓缩结晶法、化学法、柱层析法等。这些方法虽然都能达到分离纯化产品的目的,但各有其优缺点,还需要进一步的改进和完善。采用酸碱结晶法分离产品,可以不用有机溶剂,从而避免对环境的损害,但是此方法并不能把产品一次性分离干净,母液中残留的产品仍需通过浓缩结晶或其他方法加以回收处理,而且产品纯度也不够理想,需要进一步的精制处理[13]。采用化学法分离产品是一个比较简单可行的分离方法,反应体系中的头孢类抗生素可以定量地与萘酚形成复合物而得到完全分离。采用β-萘酚作为复合剂,其非常适合有酶存在的反应体系,几乎可以定量地产生头孢类抗生素β-萘酚复合物。采用柱色谱方法分离提纯可得到高纯度的产品,回收率高,同时也可以回收得到其他可利用的原料,但此法的生产能力有限,同时还产生大量的废水。

5　结论与展望

酶促合成头孢菌素类抗生素已取得了很大的进展,并且在某些产品的合成中已取得工业化应用,头孢菌素类抗生素酶促合成方法的实现是一个例证。酶法生产头孢菌素类抗生素将提高抗生素生产中能源和原材料的使用效率,减少三废的排放,满足了经济、环境和社会进步的需要。目前,人们主要通过定点突变的技术来改变酶的结构,以提高酶的活性和稳

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　《黑龙江畜牧兽医》科技版